エンテロペプチダーゼ阻害は、糖尿病性腎疾患のラットモデルにおける腎機能を改善します
Mar 13, 2022
前書き
2型糖尿病は、高血糖、インスリン抵抗性、および相対的なインスリン不足を特徴とする慢性代謝障害です。 これは、微小血管および大血管の糖尿病合併症を引き起こす世界的な臨床的問題です。1糖尿病 腎臓病（DKD）は、慢性的な結果となる主要な微小血管性糖尿病合併症です。腎臓病（CKD）および末期腎疾患。 米国では、2型糖尿病患者の40％以上がDKDを患っています。2DKDは、高血糖誘発性の過剰濾過、高血圧、および有足細胞損傷によって引き起こされる糸球体損傷を反映して、微量アルブミン尿とそれに続くタンパク尿によって定義されます。近位尿細管細胞への負荷は原因腎臓炎症および間質性線維症、腎不全進行。4アンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアンジオテンシンII受容体遮断薬（ARB）のいずれかによるレニン-アンジオテンシン系（RAS）の遮断は、DKD患者の標準治療として臨床的に使用されています。5最近、ナトリウム-グルコース共輸送体{ {6}}阻害剤は、新しいクラスの腎保護薬として導入されました。6,7しかし、これらの薬物介入にもかかわらず、徐々に悪化している患者腎臓機能 残り、新しい作用機序を持つ新薬はそれらを改善するために必要です腎臓病的状態。過剰な食事性タンパク質摂取は、腎不全糸球体の過剰濾過、尿毒症毒素の蓄積、および糸球体のオートファジーの阻害を誘発することによって8。食事中のタンパク質摂取量の増加は、末期への進行のリスクの増加と正の相関があることが報告されています。腎不全しかし、CKD; 9の患者では、食事中のタンパク質摂取量を減らすことの治療上の重要性腎臓機能物議を醸すままであり10、タンパク質消化カスケードの調節における薬理学的介入の有効性は不明です。
エンテロペプチダーゼはII型膜貫通型セリンプロテアーゼであり、十二指腸の刷子縁の腸細胞の管腔側で高度に発現しています。 不活性なトリプシノーゲンをトリプシノーゲン活性化部位での切断により活性なトリプシンに変換し、その後、活性化されたトリプシンは、キモトリプシノーゲン、プロエラスターゼ、プロカルボキシペプチダーゼなど、膵臓から分泌される他の消化性ザイモゲンを活性化します。 AAs）。 したがって、エンテロペプチダーゼはタンパク質の消化とAAの吸収に重要な役割を果たします。 SCO -792は、最大阻害濃度の半分の新規の経口投与可能なエンテロペプチダーゼ阻害剤です。<10 nm="" against="" rat="" and="" human="" enteropeptidase="" in="" vitro.14="" in="" mouse="" models,="" enteropeptidase="" inhibition="" improves="" obesity="" and="" diabetes.15="" how="" ever,="" the="" pharmacological="" effects="" of="" enteropeptidase="" inhibition="" on=""> 肝臓合併症はほとんど知られていません。 エンテロペプチダーゼがタンパク質の消化と吸収プロセスに関与する酵素の最も上流にあることを考えると、DKD状態に対するエンテロペプチダーゼ阻害の治療効果の調査は価値があるかもしれません。本研究では、エンテロペプチダーゼ阻害剤であるSCO-792の効果を調べました。肝臓 DKD.16の動物モデルであるWistar脂肪（WF）ラットの変数最初に、WFラットにおけるSCO-792の代謝および腎保護効果を評価しました。 次に、AA吸収の変化がSCO-792の有効性に与える影響を評価しました。 糸球体オートファジー活性に対するSCO792の効果を明らかにし、SCO-792とARBの複合効果を調べるために追加の実験を行いました。
キーワード：抗糖尿病薬、糖尿病性腎症、医薬品開発; 腎臓病; 腎不全; 腎臓
材料および方法
材料特に記載がない限り、すべての試薬は富士フイルム和光純薬株式会社（大阪、日本）から購入しました。 SCO -792は、武田薬品工業株式会社（東京、日本）によって合成されました。 塩酸ピオグリタゾンは東京化成工業（東京、日本）から購入しました。 イルベサルタンは、LKT Laboratories、Inc.（ミネソタ州、セントポール）から購入しました。
動物雄のWFラットおよび対応する型なしウィスターリーン（WL）ラットは、RABICS Ltd（神奈川県）から入手しました。 すべての動物は、温度（23 C）、湿度（55％）、照明（ライトは午前7時00から午後7時：00の間）に制御された部屋に収容され、無料でアクセスできました。標準的な実験用固形飼料（CE -2; CLEA Japan、Inc.、Tokyo、Japan）と水道水に。 本研究で使用された動物管理手順および動物実験プロトコルは、米国実験動物管理認定協会によって認定された施設内動物管理使用委員会（Shonan Health Innovation Park）によって承認された。
CISTANCHEは腎臓/腎機能を改善します
WFラットにおける2週間の反復投与試験ベースライン体重が693.5±22.5g、糖化ヘモグロビンレベルが7.4±0。4％の31週齢の雄WFラットを、ランダムに5つのグループ（媒体、6、2 0）に分けました。および60mg / kg SCO -792、および1 mg/kg塩酸ピオグリタゾン;n= 7）、初期尿中アルブミン対クレアチニン比（UACR）、糖化ヘモグロビン、血漿グルコース、血漿インスリンおよび体重。 WLラットを対照として使用した（n=5）。 ラットに、ビヒクル（0.5パーセント[w / v]メチルセルロース）、SCO -792、または塩酸ピオグリタゾンのいずれかを1日1回15日間経口投与しました。 最初の治療日を0日目と指定しました。体重と摂餌量を1〜4日ごとに監視し、7日目に糞便を採取しました。無作為化前と14日目に血液サンプルを採取し、血液変数を評価しました。 尿サンプルは、ランダム化の前、および尿変数を測定するために3、7、および13日目に収集されました。 15日目肝臓麻酔をかけたラットから組織を分離し、使用するまで-80℃で保存しました。
糸球体濾過率の測定3 0週齢の雄WFラットは、初期糸球体濾過率（GFR）、UACR、糖化ヘモグロビン、および体重に基づいて2つのグループ（n=7）にランダム化され、経口投与されました。ビヒクル（0.5パーセントメチルセルロース）または60 mg / kgSCO-792を4日間。 WLラットを対照として使用した（n=5）。 GFRは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-イヌリン（F3272; Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）を使用して測定しました。 生理食塩水に溶解したFITC-イヌリンを36mg/kgでラット尾静脈に注射し、注射後20、40、60および80分に採血してFITC-イヌリン濃度を測定した。 GFRはFITC-イヌリンクリアランスから計算されました。17
WFラットにおけるAA補給の評価24週齢の雄WFラットは、初期UACR、糖化ヘモグロビン、血漿グルコース、および体重に基づいて4つのグループ（n=5）にランダム化されました。 ラットは、18個のL-AA（アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸）を補給した後、粉末CE -2ダイエット、またはAAの51.8％増加（CE -2の同じ比率）を含むダイエットのいずれかを受けました。酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、システイン、メチオニン、トリプトファン）。 ビヒクル（0。5パーセントメチルセルロース）または60 mg / kgSCO- 792のいずれかを1日1回11日間ラットに経口投与しました。 血漿AAレベルの変化を評価するために、9日目のSCO -792投与の前と3、8、13時間後に血液サンプルを採取しました。11日目に尿サンプルを採取してUACRを測定しました。
糸球体オートファジーマーカーの測定29週齢の雄WFラットは、UACR、糖化ヘモグロビンレベル、血糖値、体重（n=7）に基づいて2つのグループにランダムに分けられ、その後、ビヒクル（0）が経口投与されました。 5パーセントメチルセルロース）または60 mg / kgSCO-792。 3時間後、肝臓麻酔をかけたラットから組織を分離し、次に糸球体をふるい分け法で分離しました18。LC3A/ B、p62、p-S6、S6、ウィルムス腫瘍1（WT1）、-アクチンなどの標的タンパク質のレベル糸球体はウエスタンブロッティングで検出されました。
CISTANCHEは腎臓/腎感染症を改善します
WFラットにおけるSCO-792とイルベサルタンの4週間の併用治療ベースライン体重675.7±31.2g、糖化ヘモグロビン7. 0パーセント±0。3パーセントの32週齢の雄WFラットを、6つのグループにランダムに分けました（媒体、{{ 9}}。02パーセントのSCO-792、0。{{2 0}}5パーセントのSCO-792、15 mg / kg irbesartan、{ {29}}。02パーセントSCO-792+ 15 mg / kgイルベサルタン、および0.05パーセントSCO-792プラス15mg/kgイルベサルタン;n= 7）に基づく彼らのUACR、糖化ヘモグロビン、血漿グルコースおよび体重。 WLラットを正常対照として使用した（n=5）。 ラットは、各化合物を含むCE -2粉末食（w / w：0.02および0.05パーセントSCO -792）またはCE-2粉末食のみを自由に摂取できました。 ビヒクル（0.5％メチルセルロース）またはイルベサルタン（15 mg / kg）のいずれかを1日1回経口投与しました。 血液変数を決定するために、28日目に血液サンプルを収集した。 尿サンプルは、ランダム化の前、および尿変数を決定するために7日目と30日目に収集されました。肝臓33日目に麻酔をかけたラットから組織を単離し、使用するまで-80℃で保存した。
統計分析統計的有意性は、最初にバートレットの分散の均一性の検定を使用して分析され、次にウィリアムズの検定（P>{{0}}。05）およびシャーリー-ウィリアムズの検定（P以下0。{{10}}5）用量依存研究の場合、ダネット検定（P>0。05）および鋼検定（P未満または多重比較対対照の場合は0。05）に等しいか、すべてのペアワイズ比較の場合はテューキー検定（P> 0.05）。 あるいは、分散の均一性についてF検定を使用して統計的有意性を分析し、続いてスチューデントのt検定（P> 0.2）またはAspin-Welch検定（P 0.2以下）を使用しました。 WilliamsとShirley-Williamの検定は、片側有意水準2.5％（0.025）を使用して実施されました。 他のテストは、1パーセント（0.01）と5パーセント（0.05）の両側有意水準を使用して実施されました。 SCO -792とイルベサルタンの併用治療が有意な相加効果または相乗効果を持っているかどうかを評価するために、SCO-792とイルベサルタンの主な効果と相互作用効果を提供する双方向ANOVAを実行しました。 すべてのデータは平均±SDとして表されます。 糞便タンパク質含有量の定量化、血液および尿変数の測定、遺伝子発現の分析、糸球体の分離、ウエスタンブロッティングの実施、および測定の方法腎臓コラーゲン含有量は付録S1に記載されています。
結果
SCO-792はWFラットの代謝変数を改善しましたエンテロペプチダーゼ阻害の抗DKDの可能性を評価するために、SCO-792をWFラットに1日1回2週間経口投与しました。 WFラットはWistarKyotoラットとZucker脂肪ラットの交配によって生成され19、それらの代表的な代謝表現型（高血糖、重度の肥満を伴うインスリン抵抗性、12週齢からの進行性タンパク尿16）のためにDKDモデルとしての使用に理想的です。 腸内でのエンテロペプチダーゼ阻害後のタンパク質消化低下の薬力学的マーカーである糞便タンパク質レベルは、SCO -792-処理ラットで用量依存的に増加しました（図1A）。 研究中に食物摂取量の減少が観察され、累積食物摂取量はSCO -792によって有意に減少しました（図1B）。 一貫して、体重はSCO -792-で治療したラットの方が低かった（図1C）。 血漿グルコース、糖化ヘモグロビン、血漿インスリン、血漿グルカゴンレベルなどの糖尿病変数は、2-週間のSCO -792の反復投与後に減少しました（図1D–G）。 血漿脂質レベルもSCO-792によって減少しました（図1H、I）。
SCO-792はWFラットの腎変数を改善しました糖尿病変数の改善に加えて、SCO -792はUACRを迅速に減少させ、この効果は反復投与の間維持されました（図2A）。 対照的に、UACRは、血漿グルコースレベルの強力な低下にもかかわらず、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニストであるピオグリタゾンを投与されたラットでは変化しませんでした。
SCO -792と同等です（図1D、2A）。 研究の終わりに、腎臓SCO -792を投与したラットでは、線維症マーカーであるCol1a120と炎症マーカーであるCcl221のmRNAレベルが低下しました（図2B）。 尿肝臓傷害分子-1（KIM -1）、これはのバイオマーカーです肝臓尿細管損傷22は、SCO -792-投与ラットでも減少しました（図2C）。 FITC-イヌリンを使用したGFRの測定により、WLラットと比較したWFラットの糸球体過剰濾過状態が明らかになりました。 ただし、SCO -792の4-日投与後、WFラットの糸球体過負荷は完全に正常化されました（図2D）。
食事のAA補給は、WFラットのSCO-792によるUACRの減少を逆転させましたSCO -792処理後に観察された糞便タンパク質レベルの増加により、エンテロペプチダーゼ阻害がタンパク質消化を防止したことが確認されました（図1A）。 したがって、SCO -792は、腸管腔内のタンパク質からのAAの生成を減衰させました。 SCO -792の腎保護効果におけるAA摂取の役割を調査するために、ビヒクルまたはSCO -792を投与されたラットを、通常の固形飼料またはAA添加固形飼料を自由に摂取できる状態で飼育しました。 予想通り、通常の固形飼料を与えられたラットでは、SCO - 792は血漿総AAレベルを低下させました（図3A、C）。 しかし、食事へのAA補給は、エンテロペプチダーゼによって誘発された変化を打ち消しました（図3B、C）。 バリン、ロイシン、イソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸（BCAA）の血漿レベルは、通常の固形飼料を与えられたラットのSCO -792によって特に減少しましたが、これらの変化はAA補給によって打ち消されました（図3D–F ）。 血漿AAレベルの観察された変化と一致して、SCO -792-によって誘発されたUACRの減少は、AAを補充した固形飼料を与えられたラットで大幅に減弱されました（図3G）。
SCO -792は、WFラットの糸球体でオートファジーシグナル伝達を活性化しましたアミノ酸は細胞内タンパク質ホメオスタシスの重要な調節因子として機能し、同化（タンパク質合成）プロセスと異化（オートファジー）プロセスのバランスを調整します23。これは、哺乳類のラパマイシン標的（mTOR）などのAAセンシングタンパク質によって達成されます。非抑制性キナーゼ2の一般的な制御。SCO-792が糸球体のオートファジー経路に影響を与えるかどうかを調べるために、WFラットの糸球体におけるLC3A/BIおよびLC3A/B-IIタンパク質の発現は
ウエスタンブロッティングで測定。 LC3A / Bはオートファゴソームマーカーですが、LC3A/BIはオートファジー中にC末端の脂質化によってLC3A/B-IIに変換されます。 したがって、LC3A/B-IIとLC3A/BIのタンパク質発現比は、オートファジーの指標として使用されます24。ここで、ウエスタンブロッティング分析により、SCO-792がLC3A/B-IIとWFラットの糸球体におけるLC3A/BI（図4A、B）。 対照的に、オートファジー基質をオートファゴソームに送達し、オートファジーによって分解される代替オートファジーマーカーであるp62のタンパク質レベル25は、SCO -792によって減少しました（図4A、C）。 さらに、SCO-792はS6タンパク質のリン酸化レベルを大幅に低下させました。 これは、mTORシグナル伝達の不活性化を示しています（図4A、D）。 対照的に、WT1、有足細胞マーカー、および-アクチン、ウエスタンブロッティングのローディングコントロールの発現レベルは、グループ間で変化しませんでした（図4A、E、F）。
SCO -792とイルベサルタンの併用により、WFラットのUACRが相加的に減少しましたRAS阻害剤はDKD患者の標準治療として広く使用されているため、新規抗DKD薬にはRAS阻害剤の追加効果が必要です。 SCO -792とARBの複合効果を評価するには、SCO -792（0。02パーセントおよび0。05パーセント食餌中）およびイルベサルタン（15mg / kgを1日1回経口投与）を単独または組み合わせてWFラットに4週間投与した。 疾患変数に対する持続的なエンテロペプチダーゼ阻害の有効性を評価することは興味深いことでした。 したがって、この研究では、SCO-792の食事混合投与を実施しました。 各グループの計算されたSCO-792用量（mg / kg / d）は、0。02パーセントSCO-792グループで6.81、0.05パーセントSCOで13.10でした。 -792グループ、0.02パーセントのSCO -792とイルベサルタングループの場合は6.59、0.05パーセントのSCO-792とイルベサルタンのグループの場合は11.44。 SCO -792単独およびイルベサルタン単独ではUACRが減少しましたが、SCO-792とイルベサルタンの組み合わせではUACRがさらに減少しました。 イルベサルタンと組み合わせたSCO- 792の投与後、UACRの減少に対する有意な相加効果が観察されました（図5A、B）。 対照的に、イルベサルタンは、SCO -792によって達成される抗糖尿病または抗肥満効果に影響を与えませんでした（図5C-F）。 特に、SCO-792は大幅に腎臓コラーゲン含有量（図5G）。
討論本研究では、DKDの前臨床ラットモデルの病態に対する新規エンテロペプチダーゼ阻害剤SCO-792の効果を評価しました。 WFラットへのSCO-792の経口投与は、わずか3日間の治療後、アルブミン尿を即座に軽減し、この効果は薬物投与期間を通して維持されました。 さらに、この効果はおそらくグルコース制御に依存していなかった。 さらに、線維症、炎症および尿細管損傷マーカーの減少肝臓SCO-792-処理ラットで観察されました。 SCO-792投与は追加を誘発しました肝臓糸球体の過剰濾過の緩和および糸球体におけるオートファジーの活性化を含む保護効果。 SCO -792-によって誘発されたUACRの減少は、食事のAA補給によって大幅に減弱されました。 最後に、SCO -792とイルベサルタンを組み合わせるとUACRアミノ酸が効果的に減少し、過濾過の既知の誘導物質です26。ヒトでは、タンパク質が豊富な食事またはAA注入を1回行うと、GFRが一時的に増加します27,28。たんぱく質が豊富食事療法は、腎機能CKD.29の患者では、WFラットはGFRの上昇を示し、UACRを上昇させる可能性のある糸球体の過剰濾過を示しています。 SCO -792治療は、WFラットの血漿AAレベルを低下させ、UACRを低下させましたが、食事へのAA補給後、この効果は打ち消されました。 さらに、SCO-792治療はWFラットのGFRを正常化しました。 まとめると、SCO -792-によって誘発される循環AAの減少は、WFラットの糸球体過濾過を改善しUACRを減少させる役割を果たしている可能性があります。 さらに、SCO -792は、線維症、炎症、尿細管損傷マーカーを改善しました。肝臓。糸球体濾液中の過剰なタンパク質は誘発する可能性があります腎臓近位尿細管細胞の炎症と間質性線維症。4したがって、アルブミン尿の軽減は糸球体と腎臓SCO-792-処理ラットの尿細管細胞腎臓減損。
CISTANCHEは腎臓/腎臓の痛みを改善します
LC3AB-IIとLC3AB-Iの比率およびp62タンパク質レベルの変化は、糸球体画分におけるSCO-792-誘導オートファジー活性化を示しました。肝臓WFラットの組織。 興味深いことに、SCO-792はWFラットの血漿BCAAレベルを急激に低下させました。 BCAA、特にロイシンは、mTORシグナル伝達を伴うオートファジー経路の重要な調節因子であり、オートファゴソームの形成を阻害します23,30。実際、mTORの下流シグナル伝達分子であるS6タンパク質のリン酸化は、SCOによって強力に阻害されました{{ 4}}、エンテロペプチダーゼ阻害による血漿BCAAレベルの低下が、mTOR経路の不活性化を介した糸球体オートファジーの活性化に関与している可能性があることを示しています。 オートファジーは一般的に栄養不足への反応ですが、さまざまな生理学的プロセスや病気の発症にも関与しています。腎臓病.31糸球体では、足細胞を小胞体ストレスから保護し、足細胞の機能を維持するためにオートファジーが必要であるため、足細胞には高い基礎レベルのオートファジー活性があります32。糸球体濾過機構におけるオートファジーの極めて重要な役割。32,33したがって、糸球体オートファジーの活性化は、SCO-792がWFラットのアルブミン尿を改善したAA関連メカニズムの1つである可能性があります。
慢性高血糖は、ポリオール経路の活性化、糖化最終産物の生成、酸化ストレス、および炎症を誘発することにより、DKDの経路形成に関与していると報告されています34。本研究では、高血糖を改善したピオグリタゾンはUACRを減少させることができませんでした。 WFラットで。 これは、高血糖の改善が、このモデルのSCO-792によるUACRの迅速な削減の主な要因ではないことを示唆しています。 RASはの進行のための重要な経路です腎不全、およびDKD患者におけるARBによる阻害の有益な効果は十分に確立されています。5併用試験により、UACR低下の発症までの時間は、SCO -792とイルベサルタンで異なり、これらの化合物は相加的に作用することが明らかになりました。 WFラットのUACRを改善する。 これらの結果は、SCO-792の抗アルブミン尿効果の根底にあるメカニズムがRASに依存しないことを示しています。 WFラットは正常血圧であり、SCO-792はWFラットの血圧に影響を与えませんでした。 したがって、SCO -792の観察された効果は、血圧制御に依存しない可能性があります（図S1）。 したがって、SCO -792は、将来の臨床現場でRAS阻害剤の追加療法として使用される可能性があります。 さらに、エンテロペプチダーゼの持続的阻害は、SCO -792の食事混合投与が、1日1回の経口投与よりも低い日用量でより強力な治療効果を示したため、疾患変数の治療により効果的であることが示唆されています。
上記のように、血漿BCAAレベルは、WFラットのSCO-792によってAA間で特に減少しました。 代謝性疾患とBCAAの関係は、インスリン抵抗性と広く相関しています35。さらに、タンパク質の摂取は、ヒトの筋肉のインスリン抵抗性を誘発します36。したがって、SCO -792の投与によって引き起こされる血漿BCAAの低下は、インスリン抵抗性を改善し、改善する可能性がありますWFラットの糖尿病の表現型。 これは、糖尿病マウスでの以前の研究結果と一致しており、SCO -792が高インスリン血症-正常血糖クランプ研究でインスリン感受性（主に筋肉）を増加させたことを示しています15。さらに、SCO {{7} }は、グルカゴンとAA間の相互フィードバックサイクルを介して血漿グルカゴンの減少に関与している可能性があります37。興味深いことに、2-週間の反復で体重にわずかな影響しか及ぼさなかった用量でも、糖尿病変数の強力な改善が観察されました。 SCOの投薬研究-792。 これは、インスリン抵抗性の改善や血漿グルカゴンレベルの低下などのAA依存性メカニズムが、体重減少依存性作用に加えて、SCO-792の抗糖尿病効果に関与している可能性が高いことを示しています。
本研究の主な制限は、DKDの後期段階に対するSCO-792の影響が評価されなかったことです。 WFラットは、DKDの比較的初期の段階を表す病状であるGFRの上昇を伴うアルブミン尿を示した。 この制限に対処するために、GFRの漸進的な低下を示す他のCKDモデルが長期の評価に必要となるでしょう腎臓SCO-792治療後の結果。 最近、腸–肝臓軸は関心のあるトピックの1つになり、腸内細菌叢とその代謝物との関連性腎臓病エンテロペプチダーゼの生理学的役割を考慮すると、その阻害は腸内細菌叢の組成を調節する可能性があります。 したがって、SCO-792-によって誘発される微生物叢の変化に焦点を当てた追加の分析も必要です。
結論として、これはエンテロペプチダーゼ阻害剤SCO-792が効果的に改善することを実証する最初の研究です肝臓DKDのラットモデルの変数。 腸内でのタンパク質分解の阻害とそれに続くAA吸収の低下は、SCO -792の腎保護効果の主要な経路であり、糸球体の過剰濾過の緩和と糸球体のオートファジーの活性化に影響を与える可能性があります。 まとめると、結果は、SCO-792がDKD患者の新しい治療選択肢としての可能性を秘めていることを示唆しています。
