ヴァイテックスロイコキシロンの水性葉抽出物から合成された鉄ナノ粒子のグリーン合成と特性評価およびその生物医学的応用
Jul 13, 2023
抽象的な：冷抽出法を使用して、ヴィテックス ロイコキロン1:10の比率で残します。 鉄ナノ粒子 (FeNP) は、葉水抽出物を使用して合成されました。V.ロイコキロン還元剤として。 植物医学アプローチを使用して、1 mL の植物抽出物と 1 mM の硫酸第二鉄を混合することによって FeNP を作成しました。 合成された FeNP の検査には、走査型電子顕微鏡 (SEM)、フーリエ変換赤外分光法 (FTIR)、紫外可視分光法 (UV-Vis)、およびエネルギー分散型 X 線分光法が使用されました。 還元反応は溶液の色の変化によって示され、黒色の形成は FeNP が形成されたことを確認します。 最大の吸収ピーク (最大) は、UV-Vis スペクトル分析で 395 nm で見つかりました。 FTIRスペクトルV.ロイコキロン水性葉抽出物では、いくつかのピーク、つまり 923.96 cm にシフトが見られました。−1 1709.89cm−1、カルボン酸、不飽和アルデヒド、およびケトンの官能基を持ち、これらは FeNP の FTIR スペクトルには欠けており、FeNP の形成に関与します。 直径 45 ～ 100 nm の FeNP が SEM 画像で観察されました。 FeNP の生成は EDX によって確認され、6 ～ 8 Kev の金属鉄領域で強いシグナルが示されました。 ＸＲＤにより、結晶性があり、平均直径が１３６．４３ｎｍであることが明らかになった。酸化防止剤,抗炎症薬、細胞毒性、および創傷治癒in vitro 試験では、FeNP の顕著な活性が報告されました。 本研究の累積的な知見は、FeNP のグリーン合成が可能であることを示しています。生物活性を高めるとして機能する場合があります皮膚創傷治癒剤の可能性そして癌に対する細胞傷害性薬剤。 FeNPs の合成に関与するメカニズムの特定については、今後の研究が必要です。V.ロイコキロンおよびその生物医学的応用。
キーワード:ヴィテックス ロイコキロン; 鉄ナノ粒子。 SEM; 創傷治癒; 細胞毒性のある
シスタンシュのメリット酸化防止剤,抗炎症、細胞毒性、および創傷治癒
1. はじめに
ナノスケールレベルで新しい材料を製造するための科学技術におけるナノテクノロジーの応用は、急速に成長している分野です[1]。 ナノテクノロジーは、好ましい用途に合わせて操作できる特有の特性を得るために原子レベルで材料を製造することを扱います。 この分野は、ナノスケール レベルで新しい材料を製造する科学技術への応用により急速に成長しています [2]。 電子記憶システム [3]、バイオテクノロジー [4]、標的分析物の磁気分離と予備濃縮、標的薬物送達 [5]、遺伝子と薬物の媒体の分野での応用により、近年、さまざまな産業部門がナノテクノロジーを採用しています。配信[3,5,6]。 したがって、これらの粒子は幅広い用途に使用できるため、社会に大きな影響を与える可能性があります。 ナノ粒子 (NP) は、サイズが 100 ナノメートル未満の粒子の塊であり、ナノテクノロジーの分野で重要な構造塊とみなされています。 NP のより高い活性は、NP の特徴であり、最も注目に値する品質でもあります [7]。 有機 NP と無機 NP は、ナノ粒子に適用できる 2 つの主要な分類です。 無機ナノ粒子には、磁性 NP、貴金属 NP (金や銀など)、および半導体 NP (二酸化チタンや酸化亜鉛など) が含まれます。 有機ナノ粒子には炭素 NP が含まれる場合があります。 無機ナノ粒子は、優れた材料特性と多機能な機能を提供するため、大きな注目を集めています。 それらは、それらが持つサイズ特性により、医療画像および病気の治療のための可能なツールとして研究されてきました[8]。 NP の多様な化学的、物理的、生物学的特性は、ナノ粒子のサイズや形態、表面コーティングなどのさまざまなパラメーターによって大きく影響されます。これらのパラメーターは通常、ナノ粒子の合成中に決定されます。 意図した生物学的活性の損失は、コロイドの安定性の低下によって引き起こされます。 pH、イオン強度、および関連する状況下で AgNP と相互作用する多数のタンパク質はすべて、コロイドの安定性に影響を与えます。 結果として、特定の用途に望ましい粒子特性を得るには、適切な合成技術を選択することが重要です [9]。
現在、さまざまな物理的、化学的、生物学的、ハイブリッドプロセスを使用して合成できる多種多様な NP があります。 多数の研究結果によると、ナノ粒子を製造するための物理的および化学的プロセスには、有機溶媒、有害化合物、大量のエネルギー、生分解性ではない安定化剤の使用が含まれます[10]。 したがって、グリーンナノテクノロジーの分野では、植物抽出物、さまざまな微生物、それらの代謝産物、およびいくつかの天然フミン物質などの天然に入手可能な材料を還元剤およびキャッピング剤として使用するNPの合成がますます一般的になってきています。 銀、金、鉄、銅、亜鉛などのさまざまな金属ナノ粒子の製造には、環境に優しい合成方法が使用されています。 NP を合成するための簡単で環境に優しい方法の開発は、ナノテクノロジーの重要な焦点の 1 つです。 微生物や植物抽出物などの生体材料は、さまざまな NP を調製するプロセスで利用できます [13,14]。 ただし、一部の微生物は病原体であるため、それらを扱うのは危険です。 微生物が増殖するためには、微生物を培養状態に維持し、温度、pH、その他のパラメーターを含む慎重に制御された条件にさらす必要があります。 微生物培養を維持するという面倒なプロセスが不要になるため、植物の一部を使用したNPの合成は、他の生物学的プロセスよりも有利であることが判明する場合があります[15]。 その結果、天然資源の利用、迅速性、環境への優しさ、良性などの固有の特性が注目を集めています。 これらの魅力的な特性は、医療用途で使用するために絶対に必要です。 グリーンシンセシスによって生成されるナノ粒子は、明確に定義されたサイズを有し、制御されており、汚染物質がなく、この方法はスケールアップが簡単です。 これらは、グリーン合成の追加の利点の一部です [16]。 合成されたナノ粒子の生物学的活性は、金属イオンの安定性と低減に利用されるグリーンマテリアルによって主に決定され、微調整されます。 NP の理想的な特性の 1 つは、潜在的な標的 (病原体) と哺乳動物 (宿主) 細胞を区別する優れた能力を備えていなければならないことです [17]。
このため、現在の研究では、V. leucoxylon の葉の水性抽出物が鉄ナノ粒子 (FeNP) の形成を促進する可能性について調査されました。 鉄は地球上で最も豊富に存在する元素の 1 つです。 最近、高い保磁力や超常磁性などのさまざまなユニークな特性を備えているという事実により、新しいクラスの重要なNPとして認識されるようになりました。 触媒、電子デバイス、情報ストレージ、センサー、薬物送達技術、生物医学、磁気記録装置、環境浄化などは、FeNP を利用した多くの興味深い応用例のほんの一部です [18]。 さらに、多くの研究によれば、FeNP はさまざまな植物抽出物から生成される可能性があります。 これらの植物抽出物には、ユーカリ グロブルスの葉 [19]、ザクロの葉 [20]、バナナの皮の灰 [21] が含まれます。 今回の研究で使用された植物 V. leucoxylon はクマツヅラ科のメンバーです。 五葉の貞淑な木（カンナダ語: センゲニ、ホレネッキ、ホララッキ）としても知られ、常緑樹および半常緑樹林の川岸沿いの地域や、小川沿いの湿った落葉樹林で見られます。 高さは最大20メートルに達することがあり、中型から大型の落葉樹に分類されます。 インドの西ガーツ山脈の森林に沿って、大量に生息しています。 V. leucoxylon 葉抽出物注入液は、抗炎症作用、抗酸化作用、抗精神病作用、抗うつ作用、抗パーキンソン病作用、抗高脂血症作用など、幅広い薬理活性を有することが報告されています [22]。 天然物は歴史を通じて、特に民間療法において、さまざまな病気や病気の治療に利用されてきました。 この習慣は古代にまで遡ります。 長い間存在してきた天然物化学の方法により、陸地および海洋源に由来する多種多様な生理活性二次代謝産物を見つけることが可能になりました。 これらの天然物質のかなりの数が現在、潜在的な医薬品としての使用が検討されています [23]。
人類にとって有用な、まだ解明されていない天然の化学物質や栄養素が数多くあります。 この結果、副作用を最小限に抑えながら治療介入にうまく利用できる革新的な治療選択肢の研究開発が早急に求められています。
現在提案されている FeNP のグリーン合成プロセスは、独特でコスト効率が高いです。 現在の研究では、化学薬品や物理的手法を一切使用せずに、室温でナノ粒子を作成する試みが行われました。 鉄ナノ粒子を合成するために Vitex leucoxylon 植物が選択され、鉄ナノ粒子の効力を評価するために包括的で体系的な in vitro モデルが実行されました。 この植物に関しては、ナノ粒子の概念とその生物医学への応用に関する限られた数の研究しか発表されていません。 その結果、私たちは次の目標を念頭に置いてこの研究を実施することが有益であると判断しました。植物化学物質のスクリーニングと V. leucoxylon の二次代謝産物の数の測定。 V. leucoxylon 由来の FeNP のグリーン合成と特性評価。 インビトロでのV.ロイコキシロンとそのFeNPの抗酸化作用と抗炎症作用の比較研究。 皮膚癌、肺癌、および口腔癌に対する V. ロイコキシロンの水性葉抽出物およびその FeNP の in vitro 細胞傷害活性。 スクラッチアッセイによる V. ロイコキシロンの水性葉抽出物およびその合成 FeNP の in vitro 創傷治癒活性。
2。材料と方法
2.1. 植物素材の収集
2022年3月、インドのカルナータカ州ウッタル・カンナダ地区にある西ガーツ山脈のアンシ森林地域からV. leucoxylonの新鮮な葉が収穫されました。 葉は、ダルワドのカルナータカ科学大学植物学部の分類学者、コトレシャ K. 博士によって識別および認証されました。 カルナータカ州ダルワドのカルナータカ科学大学植物学部に寄託された引換券標本を参照して、カルナータカ州。 採取後、新鮮な植物の葉を水道流水で洗浄し、天日乾燥させた後、機械式粉砕機を用いて粗粉末に粉砕した。 粉末は、後の粗溶媒抽出プロセスで使用できるように、室温で密封された容器に保管されました。
2.2. 植物抽出物の調製
ソックスレー装置を使用して、25 g の粉末状の葉を 250 mL の蒸留水で 48 時間抽出しました。 水性抽出物をロータリーエバポレーターを使用してさらに濃縮し、デシケーターで乾燥させた後、使用するまで密閉ボトルに入れて 4 °C で保管しました。 FeNP の合成では、水抽出物が還元剤および安定化剤として利用されました。
2.3. 溶媒と試薬
使用した化学物質と溶媒はすべて分析品質であり、Hi-media (Hubli、インド) から購入しました。
2.4. 植物化学分析
Deeptiらによって説明された手順に従います。 (2012)、粗水性葉抽出物 V. leucoxylon は、フラボノイド、アルカロイド、フェノール、グリコシド、ステロール、リグニン、サポニン、アントラキノン、タンニン、還元糖などのさまざまな植物化学成分の存在について定性的にテストされました [24]。
2.5. 鉄ナノ粒子の合成
まず、V. leucoxylon 葉水抽出物 1 mL を 0.05 mM FeSO4 水溶液 10 mL に加え、混合物を振とうしました。 室温および暗所で、完全な反応混合プロセスが実行されました。 無色の反応混合物をインキュベートし、必要な時間反応させた後、酸化/還元反応がはっきりと確認できました[25]。 所望の反応期間中、10,{7}} rpmで10分間遠心分離した後、粉末状態で乾燥させた新たに合成したFeNPから微量の水性抽出物を除去するために、FeNPを含む水性混合物を遠心分離しました。もう一度蒸留水に再分散させて乾燥させました[26]。
2.6. FeNP の特性評価
紫外可視分光法 (UV-Vis)、フーリエ変換赤外分光法 (FTIR)、走査型電子顕微鏡、エネルギー分散型 X 線分光法、X 線回折 (XRD)、粒径分析装置、ゼータ分析などのいくつかの方法FeNP を特徴付けるために、潜在的な可能性が利用されました。
2.6.1. UV-可視分光法に基づく分析
まず、石英キュベット内のコロイド状 FeNPs 溶液の 1 mL アリコートを、紫外可視分光法 (U-3310、日立、東京、日本) を使用し、基準として蒸留水を使用し、0.05 mM FeSO4 を使用して評価しました。コロイド溶液中の第二鉄イオンの還元を検証するためにブランクとして使用されます [27]。
2.6.2. FTIR ベースの分析
鉄表面に結合し、FeNP の合成に関与する官能基 (グループ) は、FTIR 分光法 (S700、米国マサチューセッツ州ニコレット) を使用して同定されました [28]。 72 時間のインキュベーション後、反応混合物を 10,{6}} rpm で 15 分間遠心分離 (3 ～ 4 回) することを繰り返して、FeNP を単離しました。 上清を脱イオン水に置き換え、ペレットを粉末として保管した。 乾燥後、FeNP を 1:100 の比率で臭化カリウムペレット化プロセスを使用して FTIR 分析にかけました。
2.6.3. 走査型電子顕微鏡による分析
走査電子顕微鏡 (JSM-IT 500、Jeol、ボストン、マサチューセッツ州、米国) を使用して、ナノ粒子を検査し、その表面形状を確立しました。 基板は、直径 100 mm のウェーハから劈開されたきれいな 5 mm × 5 mm Si 基板上に準備されました。 基質を 2 ～ 6 時間反応させ、コロイド溶液を 10,{8}} rpm で 5 分間遠心分離することによってサンプルを調製しました。 ペレットを何度も遠心分離した後乾燥させ、その後脱イオン水に再分散させ、この手順を繰り返した。 最後に、乾燥ペレットが得られ、国立標準技術研究所、NIST-2007 [29] によって記載された手順に従って、SEM 分析による構造特性評価がさらに行われました。
2.6.4. エネルギー分散型X線
炭素被覆銅グリッド上で乾燥させた後、還元された FeNP を EDX (JSM-IT 500、Jeol、ボストン、マサチューセッツ州、米国) を使用して分析し、元素組成を決定することもできました。
2.6.5. ゼータ電位
NP の観察 ゼータ電位は、コロイド NP の安定性に関するさらなる洞察を得るために役立つツールです。 ゼータ電位の振幅は、コロイドの安定性の可能性に関するヒントを提供します。 Meléndrezらによると、 (2010) では、粒子のゼータ電位値がプラス 30 mV よりも正であるか、または 30 mV よりも負である場合、粒子は安定していると見なされます [30]。 この事実を考慮する必要があります。 表面ゼータ電位の読み取り値を取得するために、レーザーゼータメーターを利用した(Malvern zeta seizer 2000、Malvern、UK)。 合計 5 ミリリットルのナノ粒子の液体サンプルを 50 ミリリットルの再蒸留水で希釈し、1 平方メートルあたり 2 mm の塩化ナトリウムを懸濁電解質溶液として使用しました。 その後、所望のレベルに達するまで pH を調整しました。 サンプルを合計 30 分間撹拌しました。 容器を振った後、平衡時のpHを記録し、金属粒子のゼータ電位を測定した。 FeNP の表面電位を決定する目的で、ゼータ電位を利用しました。 それぞれの場合において、記載された値は 3 回の個別の測定結果の平均です。 ゼータ電位の値がプラス 30 mV より高く、30 mV より低い場合、NP の安定性の基準が決定されました [31]。
2.6.6. 粒度分析装置
サンプルの粒子サイズを決定するために、サンプルを凍結乾燥し、超音波処理装置 (SZ-100、堀場、京都、日本) を使用して分散させた後、PSA 試験を実施しました。
2.6.7. X線回折分析（XRD）分析
V.ロイコキシロンの水性葉抽出物から合成された鉄ナノ粒子をXRD分析（Smart Lab SE、東京、東京、理学）に供して、ナノ粒子の性質および平均サイズを決定した。
2.7. インビトロ法を使用した抗酸化活性の測定
2.7.1. 第二鉄イオン還元抗酸化力アッセイ (FRAP)
小柳津 (1986) によれば、若干の修正を加えて、第二鉄イオンの還元力が評価されました [32]。 50 °Cで30分間、2.5 mLの20 mMリン酸緩衝液と2.5 mLの1パーセントフェリシアン化カリウムを2.5 mLのV. leucoxylon葉抽出物に加え、その合成FeNPを組み合わせ。 インキュベーション期間後、混合物に 2.5 mL の 10 パーセント w/v トリクロロ酢酸および 0.5 mL の 0.1 パーセント w/w 塩化第二鉄を補充し、その後さらに 10 分間インキュベートしました。 最後に、UV-V 分光光度計を使用して 700 nm の吸光度を検出しました。 標準としてアスコルビン酸を使用した。 各サンプルは 3 回テストされました。
2.7.2. 過酸化水素捕捉アッセイ
V. leucoxylon 水性葉抽出物およびその合成 FeNP の過酸化水素を捕捉する能力に基づいて、これらの化合物の抗酸化活性が評価されました。 まず、4 mM H2O2 を含む {{0}}.6 mL のリン酸緩衝液 (pH 7.4) を、既知の濃度の標準アスコルビン酸 0.5 mL、およびさまざまな濃度の植物抽出物を含むチューブに加えました。 100 μL ～ 500 μL (pH 7.4) の範囲です。 リン酸緩衝液と過酸化水素を含まないブランク溶液を使用して、10 分後に溶液の 230 nm での吸光度を評価しました。 リン酸緩衝液は、サンプルまたは標準の代わりに対照を作成するために使用されました [33]。 各サンプルは 3 回テストされました。 式アプローチを使用して阻害率を計算しました。
2.7.3. DPPH フリーラジカル消去
アッセイ V. leucoxylon 葉抽出物と合成 FeNP は、試薬として DPPH ラジカルを使用して、フリーラジカルを除去する能力についてテストされました [34]。 サンプルを、異なる濃度 (w/v) のエタノール (100 μL) 中の DPPH ラジカル溶液 (60 M) と組み合わせました。 ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、室温、暗所で３０分間インキュベートした後、５１７ｎｍで混合物の吸光度を測定した。 アスコルビン酸を実験の標準として使用しました。 次の方程式を使用して、各サンプルの DPPH 消去活性を決定しました。
ここで、Ac は、100 μL のエタノールと 100 μL の DPPH 溶液を混合することによって実行される対照反応の吸光度を表し、At は試験サンプルの吸光度を表します。 実験は三つ子で行われました。 各サンプルの IC50 値を計算しました。 より高いレベルのフリーラジカル活性は、より低い吸光度を有する反応混合物によって示された。
2.7.4. リンモリブデン (PM) アッセイ
総抗酸化活性は、Prieto et al., 1999 の標準技術を使用して測定されました。 3 mL の蒸留水と 1 mL のモリブデン酸塩試薬溶液を含む各試験管に、V. leucoxylon の葉水抽出物とその FeNP を 100 μL ～ 500 μL の範囲のさまざまな濃度で加えました。 これらのチューブを 95 °C で 90 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、これらのチューブを 20 ～ 30 分間室温に調整した後、反応混合物の吸光度を 695 nm で測定しました。 参照標準はアスコルビン酸でした[35]。
2.8. インビトロ抗炎症活性の評価
V. leucoxylon 水性葉抽出物とその生成した FeNP の抗炎症効果は、Elias et al., 1988 によって概説されたタンパク質変性法に若干の変更を加えて評価されました [36]。 標準薬としてジクロフェナクナトリウムを用いた。 既知濃度の製造された FeNPs (100 g/mL) 2 mL と標準ジクロフェナクナトリウム (100 g/mL) およびリン酸緩衝生理食塩水 (pH 6.4) 2.8 mL を含む反応混合物を、新鮮な鶏卵 2 mL と混合しました。アルブミン (1 mM) を添加し、27 ± 1 °C で 15 分間インキュベートしました。 反応混合物を 70 °C の水浴に 10 分間入れて変性を誘導しました。 冷却後、再蒸留水をブランクとして用いて660nmにおける吸光度を測定した。 各テストは 3 回実行されました。 次の式を使用して、タンパク質変性の阻害パーセントを計算しました。
ここで、試験サンプルの=における吸光度。 コントロールの Ac=吸光度。
2.9. MTT アッセイを使用した鉄ナノ粒子の細胞毒性および抗がん活性の測定
非癌性線維芽細胞 L292 の生存率に対する V. ロイコキシロンとその合成 FeNP の効果、および皮膚癌 (A375)、肺癌 (A549)、および口腔癌 (KB-3-1) に対するその抗癌活性が評価されました。 Carmichael et al., (1987) [37] によると、標準的な MTT アッセイを使用します。 すべての細胞株は、インドのプネにある国立細胞科学センター (NCCS) から入手しました。 細胞増殖阻害率 (IC50) 値は、各細胞株の用量反応曲線を使用して導出され、次の式を使用して増殖阻害率を計算しました。 健康な細胞のミトコンドリア脱水素酵素による MTT の紫色のホルマザン生成物への変換は、この実験の基礎となっています [38]。
2.10. スクラッチアッセイ試験を使用したインビトロ創傷治癒研究
現在の研究では、既知濃度の植物抽出物と鉄ナノ粒子を含むサンプルによって引き起こされる L292 細胞株細胞の拡散能力と遊走能力が調べられました [39]。 10 パーセント FBS および 2 パーセント Pen-Strep 抗生物質を補充した DMEM 培地を含む動物細胞培養プレート (ダルムシュタット、ドイツ) を使用して、細胞培養プロセスを開始しました。 滅菌プラスチック ピペット チップを使用して、細胞が 1 mL あたりおよそ 50,000 細胞まで増殖した後、細胞の単層コンフルエントを引っ掻きました。 PBS 溶液を使用して、不要な細胞破片を除去しました。 ネガティブコントロールとして未処理の細胞を使用し、既知濃度のポリマーサンプルのポジティブコントロールとして標準アスコルビン酸を使用しました。 次の 24 時間、細胞を 5% CO2 を含む 37 °C に保ちました。 相対的な細胞遊走と創傷閉鎖を調べるために、引っ掻いた細胞層をインキュベートし、0 時間から 6 時間、12 時間、24 時間までの間隔で画像化しました。 MagVision ソフトウェアの測定 (X64、2016、インド、ニューデリー、マグナス) の 4 倍解像度でのキャリブレーションを使用して、ギャップ距離を定量化しました。 創傷閉鎖と移動速度を決定するために、以下に示す式が使用されました。
以下に関して: A0h=の創傷面積は、引っ掻いた直後に測定されました。 ATh=創傷面積は時間後に測定。 Rm=移動速度 (μm/h); Wf=初期創傷幅 (μm); T=の移行時間 (時間)。
2.11. 統計分析
データは平均標準偏差と標準誤差として表示され、各実験は 3 回実行されました。 SPSS ソフトウェア バージョン 20 を使用して、グループ間に存在する平均スコアの差について一元配置分散分析 (ANOVA) を実行しました。
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