GRP78 の過剰発現は PINK1-IP3R を介した神経保護的マイトファジーを引き起こすパート 1
Aug 01, 2024
抽象的な：
脊髄根剥離（RA）の実験モデルは、ニューロンと標的の切断後に逆行性神経変性を引き起こす原因となる分子プログラムを研究するのに役立ちます。
脊髄根剥離は致命的な中枢神経系損傷であり、患者の日常生活や認知能力に重大な影響を与える可能性があります。しかし幸いなことに、必ずしも記憶力が影響を受けるわけではなく、ほとんどの患者は効果的な認知リハビリテーション方法によって記憶力を改善できます。
脊髄根剥離は人の記憶には直接影響しないが、主に注意、認知、学習などの患者の脳の認知能力に影響を与えることが、いくつかの研究で示されている。これは、たとえ脊髄根剥離の影響を受けても、多くの人が依然として良好な記憶力を持っていることを意味します。
したがって、脊髄根剥離の影響を受ける人にとって、認知能力を向上させることが記憶力を向上させる鍵となります。認知リハビリテーションは、患者の脳の認知能力を再構築し、記憶力を向上させる効果的な方法です。これらの方法には、患者の集中力、感受性、反応速度の向上に役立つクローゼ、数学的演算などが含まれます。
さらに、前向きな姿勢も記憶力を向上させる重要な要素です。脊髄根剥離の患者は、課題や困難に直面したとき、リハビリテーションの過程で最良の結果を達成するために、楽観的な態度を維持し、人生のさまざまな課題に勇敢に立ち向かうように努めるべきです。
要約すると、脊髄根部剥離損傷は人の記憶に直接影響を与えません。ほとんどの人は、認知リハビリテーションなどの効果的な方法によって記憶力を向上させることができます。同時に、楽観的な態度も記憶力を向上させる鍵となります。リハビリテーションの過程で、私たちは困難を克服し、健康な未来に向かって一歩ずつ進むことができると強く信じなければなりません。記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンカは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬材料であるため、カンカは記憶力を大幅に改善することができ、そのうちの1つは記憶力を改善することです。シスタンケの効能は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体などを含むさまざまな有効成分によってもたらされます。これらの成分はさまざまな方法で脳の健康を促進します。
この神経変性プロセスは、小胞体 (ER) ストレスの存在やオートファジー流の遮断などの神経疾患関連プロセスと共通の特徴を共有します。
我々は以前、GRP78の過剰発現がRA後の運動ニューロンの神経保護を促進することを発見した。その後、偏りのない比較プロテオミクス分析と薬理学的および遺伝的介入を実施することで、根底にあるメカニズムを解明することを目指しました。
予想外なことに、ミトコンドリア因子は、GRP78が過剰発現されたときに最も変化することが判明し、マイトファジーの特徴である飲み込まれたミトコンドリアの豊富さも、GRP78過剰発現後のRA損傷運動ニューロンにおいて電子顕微鏡によって観察された。
さらに、GRP78 の過剰発現は、LC3- ミトコンドリアのタグ付けを増加させ、PINK1 の転座とマイトファジーの誘導を促進し、ER ストレスを受けた細胞におけるミトコンドリアの機能を回復しました。
最後に、運動ニューロン死の in vitro モデルにおいて、GRP78- が促進する生存促進性マイトファジーが PINK1 と IP3R によって媒介されることを発見しました。このデータは、GRP78 シャペロンとマイトファジーの間の新たな関係を示しており、神経保護を達成するための薬剤設計に新たな治療選択肢が開かれます。
キーワード: GRP78/BiP;マイトファジー;運動ニューロン。神経変性;神経保護。
1. はじめに
機能的なニューロン接続の破壊は、神経変性プロセスの一般的な初期の特徴です [1]。軸索変性によりニューロンが分離され、逆行性および進行性の機能不全プロセスを経て消滅します。
損傷に直面すると、ニューロンは反応し、折り畳まれていないタンパク質応答 (UPR)、熱ショック応答、オートファジー経路、ユビキチン - プロテアソーム システム、シャペロン発現、小胞体 (ER) 関連分解機構などの内因性神経保護機構を活性化します。 (ERAD)、および抗酸化防御。
それらの正確な活性化は細胞の回復に効果的ですが、過度の損傷や経年劣化により、これらのプログラムの 1 つまたは複数の機能不全が生じる可能性があります。
私たちは、自然を模倣し、これらの内因性メカニズムを促進することが神経保護の効率的な戦略である可能性があると推論しました [2,3]。BiP または熱ショックタンパク質 5a (HSP5a) としても知られる GRP78 は、神経保護の内因性メカニズムにおいて重要な機能を持つ多機能タンパク質です [4] ]。 GRP78 は、ER ストレス後に活性化される UPR を調整し、ATPase 活性を持ち、Ca2+ 結合タンパク質です [5,6]。
また、新たに合成されたタンパク質や誤って折りたたまれたタンパク質の適切なフォールディングを促進し、分解されたタンパク質を ERAD 機械による分解の対象にするように作用します ([7] で概説)。
証拠はまた、GRP78 がマクロオートファジーの誘発に関与し、折り畳まれていないタンパク質と機能不全の細胞小器官の可溶性および凝集形態の両方を除去することを示唆しています [8-15]。
GRP78 の過剰発現は、神経変性のいくつかのモデルで神経保護作用があることが証明されており [16-23]、老化中および変性疾患の進行全体を通じて GRP78 レベルの低下が観察されています [24]。
これらの研究の中には、神経保護がアポトーシスの阻害によって媒介されることを報告したものもあります。しかし、アポトーシスが神経変性過程における神経細胞死の主な原因になることはほとんどありません[20、25-27]。
したがって、我々の主な目標は、神経変性の非トランスジェニックモデルを使用して、GRP78の過剰発現が神経保護につながるメカニズムを確立することです。
特に、脊髄運動ニューロン（MN）軸索切断のいくつかのモデルの解剖学的および技術的利点を利用して、我々は以前、神経根剥離（RA）が運動神経変性の逆行性プロセス（損傷後1か月にわたるMNの80％の喪失）を開始し、以下の特徴を有することを報告した。 ERストレスの存在、オートファジーフラックスの遮断、小胞およびタンパク質輸送の停止、アポトーシス/抗アポトーシス/アノイキシン開始の同時発生であるが、効果的なアポトーシスの実行が存在しない[20、25、28]。
我々は、損傷したMNではGRP78の発現がRA後約5日で失われ、その強制的な過剰発現により軸索切断後の生存が可能になることを発見した。以前にオートファジーの正しい解決により RA 後のニューロンの生存が増加すると述べたように [26]、選択的オートファジーに保護効果があるかどうかを解読できるかどうか疑問に思います。
したがって、我々はRAモデルを使用して、公平なプロテオミクス分析を使用してGRP78神経保護を媒介するメカニズムを明らかにし、RAモデルの2つの主な特徴であるERストレスとタンパク質輸送停止の両方を引き起こすツニカマイシン治療を使用したin vitro深度分析によって得られた仮説をさらに検証しました。 [26]。
2. 材料と方法
2.1.外科的処置
12週齢のSprague-Dawley雌ラットを光と温度の標準条件下で飼育し、餌と水を自由に与えた。我々は、本質的に以前に報告されているように[26,27]、ケタミン/キシラジンのカクテル(0.1 mL/100 g重量)を腹腔内に用いた麻酔下で外科的処置を行った。
L4〜L5根の椎骨外神経根剥離を行うために、坐骨神経の各側を特定するために正中皮膚切開を行い、椎間孔から離れた選択された根に適度な牽引力を適用し、運動根と感覚根を含む混合脊髄神経を取得しました。後根神経節。
傷は飛行機で縫合され、ポビドンヨードで消毒され、動物は暖かい環境で回復させられた。偽手術動物を対照として使用した。
動物に関係するすべての手順はスペイン語 (Real Decreto 53/2013) とヨーロッパ人 (2010/63/UE) によって実施され、カタルーニャ州政府の農務省、ラマデリア、ペスカ、アリメンタシオ・イ・メディナチュラルによって承認されました。カタルーニャ）の法律。
2.2.ウイルスベクターの構築、精製、感染
ＧＲＰ７８をコードするｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ、ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、英国テディントン）をｐＡＣ．ＣＭＶシャトルベクターにクローニングした。組換えアデノウイルスは、HEK293 細胞における相同組換えによって構築されました。
細菌性ガラクトシダーゼ（Ad- -gal）を発現する対照アデノウイルスは、CB Newgard（デューク大学、米国ノースカロライナ州ダーラム）のご厚意により寄贈されました。ウイルスは、製造業者（Sartorius、Göttingen、Germany）の指示に従って、Vivapure AdenoPackTM 20キットを使用して精製した。
アデノ随伴ベクター構築のために、GRP78 cDNAを、CMVプロモーターの制御下にあるAAV2のITRドメインとウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメントの間のNheIおよびHindIII部位にクローニングした[29]。
AAVrh10 ベクターは、HEK293- AAV 細胞 (Stratagene、ベリンガム、ワシントン州、米国) と分岐ポリエチレンイミン (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を含むプラスミドによる三重トランスフェクションによって、以前に記載されているように [30] 生成されました。 AAV2のITR、Rep2とCapfor rh10を含むAAVヘルパープラスミド（米国ペンシルバニア州フィラデルフィアのペンシルベニア大学のJM Wilson氏のご厚意により提供）、およびヘルパーアデノウイルス遺伝子を含むpXX6プラスミド[31]。組換えベクターは、ベンゾナーゼ処理 (50 U/mL、Novagen、米国ウィスコンシン州マディソン) およびポリエチレン グリコール (PEG 8000、Sigma-Aldrich) 沈殿後に清澄化されました。
ベクターは、標準操作手順に従って、CBATEG-UABのベクター製造ユニットによりイオジキサノール勾配によって精製されました。 1 ml あたりのウイルスゲノム (VG/mL) を、PicoGreen (Invitrogen、Waltham、MA、USA) を使用して定量しました。
RA直後、動物の腰部の髄腔に、33-ゲージ針とハミルトン注射器を使用して、14μLのAd-GRP78またはAd-galウイルス（108pfu/mL）を注射した。
あるいは、RAの3週間前に、GFPまたはGRP78を過剰発現させるためのAAVrh10アデノ随伴ウイルスの4×10−10ウイルスゲノム10μLを髄腔内投与して、イソフルラン麻酔した動物の椎骨L3とL4の間のCSFにゆっくりと注入した[32]。
AAVrh10 は脊髄運動ニューロンの 30% に特異的に感染するため、AAVrh10 を使用しました [32]。くも膜下腔への適切なアクセスは、動物の尾のフリックによって確認されました。針を注射部位の所定の位置に１分間保持し、その後筋肉と皮膚を縫合した。
2.3.サンプルの調製とプロテオミクス分析
ラット（n=4-5）を7 dpiで麻酔し、L4-L5脊髄セグメント（長さ5- mm）のサンプルを取得し、液体窒素中で急速冷凍しました。氷上でポッターホモジナイザーを用いて、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテル）中で組織をホモジナイズした。
800×g、4℃で20分間、ライセートを遠心分離した後、核後画分の上清を収集し、BCAアッセイ（Pierce Chemical Co.、ダラス、テキサス州、米国）によってタンパク質を定量しました。
プロテオミクス分析のために、各サンプル 75 μg を 4% SDS、8 M 尿素、0.1 M HEPES、pH 7.7、0.1 M DTT、加えた 0 に可溶化しました。 ０５Ｍヨードアセトアミドで処理し、フィルター支援サンプル調製（ＦＡＳＰ）法を用いてトリプシン（酵素：基質の比１：１０）で消化した。
すべてのサンプルを並行して処理しました。ProxeonEasyLC (Thermo Fisher Scientific) に接続した LTQ-OrbitrapVelos 質量分析計 (Thermo FisherScientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用してサンプルを分析しました。ペプチド混合物を分析カラム (2 μL) に直接ロードしました。 ·min−1）、5-μm C18粒子が充填された内径100μmの15-cmカラム（NikkyoTechnos Co.、東京、日本）を使用した逆相クロマトグラフィーによってペプチドを分離しました。
クロマトグラフィーのグラジエントは、97% 緩衝液 A (0.1% ギ酸 (FA) 水溶液)、および 3% 緩衝液 B (アセトニトリル、0.1% FA) で開始し、流速 500 nl で行いました。 ·min−1、4 分で 85% バッファ A + 15% バッファ B に増加し、120 分で 55% バッファ A + 45% バッファ B に増加しました。
オービトラップで分解能 60、000、m/z 350 ～ 2000 の質量範囲で 1 回のフル MS スキャンを実行し、TOP20 データ依存取得モードで機器を操作し、その後、最も強度の高い 20 個のイオンの MS-MS スペクトルを取得しました。 。衝突誘起解離法でイオントラップを利用してフラグメントイオンスペクトルを生成し、正規化された衝突エネルギーを 35% で使用しました。すべてのデータは Xcalibur ソフトウェア v2.1 で取得しました。
ペプチドの同定と定量には、Proteome Discoverer ソフトウェア スイート (v1.3.0.339、Thermo Fisher Scientific) および Mascot 検索エンジン (v2.3.01、Matrix Science50) を使用しました。
最も一般的な汚染物質 (599 エントリ) を含むデータを SwissProt Rat データベースと照合して分析しました。 MS1 レベルで 7 ppm の前駆体イオン質量許容値を使用し、トリプシンの誤切断は 3 回まで許容しました。
フラグメントイオンの質量許容値は 0.5 Da に設定されました。メチオニンの酸化とN末端タンパク質のアセチル化を可変修飾とし、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。
誤検出率に基づいてペプチドをフィルタリングしました (FDR > 5% は考慮されません)。ペプチドの定量化については、ProteomeDiscoverer を使用して計算されたペプチドのクロマトグラフィー ピークを考慮し、R 3.0.2 を使用して log2 変換によって面積を中央値で正規化しました。 R パッケージ MSstats (v. 2.0.1) を使用してデータを定量化しました。
各比率について、調整された p 値を計算しました (有意性については p < 0.05)。最後に、DAVID Annotation Web ツール (https://david.ncifcrf.gov/、2021 年 5 月 28 日にアクセス) および KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway) を使用して、制御されたタンパク質の遺伝子オントロジーとパスウェイ分析を実行しました。 html、2021 年 5 月 28 日にアクセス)、以前に実行したように (詳細は [25] を参照)。
2.4.免疫組織化学および画像解析
ペントバルビタールによる深い麻酔後、10 U/mL ヘパリンを含む生理食塩水で動物を経心的に灌流し、続いて 0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.2 中の 4% パラホルムアルデヒドで 7 dpi で組織を固定しました (n {{7各条件について}})、脊髄の L4 セグメントと L5 セグメント (全長 5- mm) を除去し、同じ固定液で 4 時間後固定し、30% スクロースで一晩凍結保存しました。
連続横断切片 ({{0}} μm 厚さ) をクライオトーム (Leica、Wetzlar、ドイツ) を使用してゼラチン化スライド上で取得し、分析まで -20 °C で保存しました。免疫組織化学のために、0.03% TritonX-100および10%ウシ血清を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)中のブロッキング溶液でスライドを1時間処理し、その後異なる一次抗体:ウサギ抗LC3B(ab51520; アブカム)とともにインキュベートしました。 ；１：２００）またはマウス抗ＣＯＸＩＶ（Ａ２１３５５；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１：５００）。
TBS、0.05% Tween-20で数回洗浄した後、切片をCy-2またはCy-3結合ロバ抗ウサギ抗体とともに2時間インキュベートしました（JacksonImmunoresearch、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）。
DAPI (Sigma、ミズーリ州セントルイス、米国) または NeuroTrace 蛍光ニッスル染色 (Molecular Probes、オランダ、ライデン) で切片を対比染色し、Fluoromount-G 封入剤 (SouthernBiotech、アラバマ州バーミンガム) でスライスをマウントしました。手作りのモヴィオル。
比較するセクションは、同じ日に同じスライド上で一緒に処理されました。
異なる治療および対照からの脊髄サンプルの画像を、共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 700）を使用して分析した各マーカーについて同じ露光時間、感度、解像度で撮影しました。 ImageJ ソフトウェア (国立衛生研究所、http://rsb.info.nih.gov/ij/ で入手可能、2021 年 5 月 28 日にアクセス) を使用してシグナル強度を分析しました。
For more information:1950477648nn@gmail.com
