GRP78 の過剰発現は PINK1-IP3R を介した神経保護的マイトファジーを引き起こすパート 2
Aug 01, 2024
2.5.ウェスタンブロット
我々は、ドリータール（n=4）を7 dpiでラットに深く麻酔し、ウェスタンブロット分析用にL4〜L5脊髄セグメント（長さ5- mm）を取得しました。サンプルを液体窒素中で急速冷凍しました。
近年、タンパク質のブロッティングと記憶の間に密接な関係があることを示す研究結果が増えています。プロテインブロッティングは、タンパク質発現を検出するための分析手法であり、神経科学研究で広く使用されています。
ニューロン間の接続は記憶の保存と密接に関係しています。タンパク質ブロッティングは、ニューロン間の接続状態とシナプス前および後シナプスタンパク質の発現を検出することができ、記憶の形成と記憶におけるタンパク質の重要な役割をさらに明らかにします。
研究により、シナプス前ニューロンタンパク質の発現が記憶の形成と保存に密接に関連していることがわかっています。たとえば、学習と記憶のプロセス中に、ニューロンはシナプス前タンパク質の発現を変化させ、この変化は新しい記憶の形成と保存に関連しています。さらに、いくつかの研究では、一部のタンパク質の発現の変化がアルツハイマー病などの神経変性疾患に関連していることも判明しています。
したがって、タンパク質ブロッティングにより、神経細胞間の結合状態や関連タンパク質の発現変化を深く理解することができ、神経細胞の分子機構を明らかにすることができます。これは、記憶形成のメカニズムや神経変性疾患の研究にとって非常に重要です。
つまり、タンパク質のブロッティングと記憶の関係は、ニューロンと記憶保存の間の接続におけるタンパク質の役割を示しています。これは、記憶形成と神経変性疾患のメカニズムを研究するための新しいアイデアと方向性を提供します。脳科学の研究を積極的に推進し、健康長寿に貢献しましょう！私たちは記憶力を向上させる必要があることが分かります。カンクイには抗酸化作用、抗炎症作用、老化防止作用があり、脳内の酸化反応や炎症反応を軽減し、神経の健康を守る効果があるため、記憶力を大幅に向上させることができます。システム。さらに、Cistanche は神経細胞の成長と修復を促進し、それによって神経ネットワークの接続と機能を強化します。これらの効果は、記憶力、学習能力、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発生を防ぐこともできます。
サンプルを保存するか、溶解バッファー（20 mM HEPES、pH 7.7、251 mM スクロース、1 mM EDTA、1 mM EGTA、およびプロテアーゼ（Sigma-Aldrich）とホスファターゼ阻害剤（Roche、バーゼル、スイス）のカクテル）中での均質化によってさらに処理しました。 ) 氷上でポッターホモジナイザーを使用します。
溶解物を800×g、4℃で20分間遠心分離した後、核後画分として上清を収集し、BCAassay（Pierce Chemical Co.）によってタンパク質を定量しました。
ウェスタンブロッティングでは、各動物の L4 ～ L5 セグメントの核後画分 30 µg を 12% SDS ポリアクリルアミドゲルにロードして、タンパク質の電気泳動分離を実行し、続いて BioRadcuvette システムの 25 mM で PVDF 膜に転写しました。トリス、pH 8.4、192 mM グリシン、20% (v/v) メタノール。
PBS 中の 5% BSA と 0.1% Tween-20 を加えたもので膜を室温で 1 時間ブロックし、一次抗体: マウス抗 - - アクチン ( 1:10000; SigmaAldrich)、マウス抗 GRP78 (1:500、Sigma-Aldrich)、マウス抗 CV (1:1000、Invitrogen)、ウサギ抗 HSP60 (1:500、Antibodies-online)、マウス抗NDUFA9 (1:1000、Invitrogen)、マウス抗 OPA1 (1:1000、BD Biosciences)、ウサギ抗 Parkin (1:500、Abcam、ケンブリッジ、英国)、マウス抗 PINK1 (1:500、Abcam)、ウサギ抗NRF2 (1:500、Abcam)、抗MNF2(1:500、Abcam)、ウサギ抗GRP75 (1:500、Abcam)。
数回洗浄した後、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した適切な二次抗体(1:5000、Vector)とともに2時間インキュベートした。膜は、1:1 (0.5 M ルミノール、79.2 mM p-クマリン酸、1 M トリス-HCl、pH 8.5) および (8.8 M 過酸化水素、1 M トリス-HCl、pH 8.5) の化学発光混合物を使用して可視化されました。画像はGene Genome装置で撮影し、Gene SnapおよびGene Toolsソフトウェア（Syngene）で分析した。
2.6.インビトロモデル
NSC34細胞は、10%ウシ胎児血清（Sigma-Aldrich）、100単位/mLペニシリン、および0.5×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加した改変イーグル培地（DMEM、Biochrom、ケンブリッジ、英国）で培養しました。 (Sigma-Aldrich) を使用し、基本的に以前に記載されているように [26]、5% CO2 下、37 °C の加湿インキュベーター内で維持しました。
培地を交換せずに細胞を4日間培養した後、NSC34細胞は長い神経突起の存在を特徴とする分化したような表現型を示しました。 4日目に、薬剤を細胞に添加した。 Tun (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州) および EFV (Bristol-Myers Squibb、米国ニューヨーク州) 溶液を 10 倍の濃度で調製し、DMEM に溶解しました。
24 時間後、細胞を 4 mg/mL MTT 溶液で 3 時間インキュベートすることにより細胞生存率を評価しました。形成された青色のホルマザン結晶をDMSOに溶解し、マイクロプレートリーダー(Elx800、Bio-tek、Winooski、VT、USA)で570nmの吸光度を測定した。
2.7.ヌクレオフェクション
GFP、GRP78、HAPARK、マウス sh-eGFP、マウス sh-PINK1 (ID 68943、Tebu-bio)、マウス sh-Hspa5 (ID 14828、Tebu-bio) を発現させるために、100 万個の細胞に 2 µg のプラスミドをトランスフェクトしました。 ／または、メーカーの推奨に従い、Amaxa Nucleofector II TM (Lonza、バーゼル、スイス) および Nucleofactor V キット (Lonza) を使用したマウス sh-IP3R (ID 16440、Tebu-bio)。
静的サイトメトリー分析では、コラーゲン 10% でコーティングされた {{0}} ウェル プレートに細胞を播種しました。培養後、細胞を4% PFAで固定し、PBSで2回洗浄し、保存するか、PBS、0.3% (v/v)Triton X-100および10%のウシ胎児血清を含むブロッキング緩衝液をその後添加しました。 3日間の細胞培養後、DMEMに溶解した薬剤を添加しました。
これらの実験では、1 μM Tun (Sigma-Aldrich)、10 μMCCCP (Sigma-Aldrich)、5 μM CsA (Sigma-Aldrich)、または 10 μM BAPTA-AM (Sigma) を使用しました。処理の5時間後、免疫細胞化学のために細胞を4% PFAで固定するか、改変RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EGTA)中でホモジナイズしました。 、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、プロテアーゼおよびホスファターゼ カクテル) を免疫ブロッティングに使用します。免疫組織化学は、サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋０．３％（ｖ／ｖ）トリトンＸ｛｛２５｝｝および１０％ウシ胎児血清を含むブロッキング緩衝液でインキュベートすることによって実施した。
以下の一次抗体とインキュベートしました: ウサギ抗 IP3R (1:200、Abcam)、マウス抗 HA (1:2000、Abcam)、マウス抗 GRP78 (1:200、Sigma-Aldrich)、およびウサギ抗 HSP60 (1:500、Antibodies-online)。上記のように MTT によって生存率を評価するために、処理を 24 時間放置しました。
2.8.ミトコンドリアのスーパーオキシド生成とΔψM の測定
細胞は、処理の最後の 30 分間、スーパーオキシド分析の場合は 2.5 μM MitoSOX、ΔψM 分析の場合は 2.5 μMTMRM (両方とも Molecular Probes および Invitrogen 製) とともにインキュベートされました。蛍光をIX81オリンパス顕微鏡で検出し、静的サイトメトリーソフトウェアを使用して定量した。
2.9.酸素消費量の電気化学的測定
細胞 (HBSS 中 1 mL あたり 1 × 106) を 37 °C の気密チャンバー内で撹拌しました。測定は Clark 型 O2 電極 (Rank Brothers、ケンブリッジ、英国) を使用して行われ、Dup.18 データで記録されました。 5-車両または Tun による治療直後の取得装置 (WPI)。
2.10.ミトコンドリアと細胞質の分別
細胞を溶解緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５０ｍＭ スクロース、プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）のカクテル）中で、氷上でポッターホモジナイザーを用いてホモジナイズした。
溶解物を2000×gで5分間遠心分離した後、上清を10,000×gで12分間遠心分離した。上清は可溶性画分 (S2) とみなされ、サイトゾルタンパク質とミクロソームが含まれています。
ペレット (P2) は濃縮ミトコンドリア画分であり、改変 RIPA 緩衝液 (50 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EGTA、1% NP{{8}) に再懸濁されました。 ｝｝、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼおよびホスファターゼカクテル）およびタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって測定した。次に、サンプルをウェスタンブロット用に処理しました。
2.11.透過型電子顕微鏡
脊髄 L{{0}}L5 セグメント (1- mm スライス) を 2% (w/v) PFA と 2.5% (v/v) グルタルアルデヒド (EM グレード) の固定液に浸しました。 0.1 M PBS、pH 7.4 に溶解し、揺動台上に 2 時間置き、その後 1% (w/v) PFA で固定し、続いて 1% (w/v) 四酸化オスミウムで後固定しました (TAAB Lab ）０．０８％（ｗ／ｖ）ヘキサシアノ鉄酸カリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳで２時間培養した。
脱イオン水で 4 回洗浄し、続いてアセトンで脱水しました。前述のように、すべての手順は 4 °C で実行されました [33]。サンプルを EPON 樹脂に埋め込み、60 °C で 48 時間重合させました。
Leicaultracut UCT ミクロトームでサンプルを処理して半薄切片 (1 μm) を取得し、1% (w/v) トルイジン ブルー水溶液で染色し、光学顕微鏡で検査して MN が豊富な前角領域を特定しました。
超薄切片（70 nm）をダイヤモンドナイフで切断し、コーティングされたグリッド上に置き、従来の酢酸ウラニルおよびレイノルズクエン酸鉛溶液と対比した。
最後に、GatanUltrascan ES1000CCD カメラを備えた透過型電子顕微鏡 (Jeol 1400) で切片を観察しました。条件ごとに 3 つのスライスを選択し、セクションごとに 3 つの MN を分析し、ImageJ ツールを使用して MN の総面積と比較した核の面積を測定しました。
2.12.バイオインフォマティクスと統計学
分散分析 (ANOVA) を使用して、正規性の仮定を満たすデータについて、さまざまな実験グループ間の値を比較しました。グループ間の差異は、一元配置分散分析、続いてテューキーの事後多重範囲検定、またはスチューデントの t 検定を使用して分析されました。すべての統計分析は、GraphPad Prism5 ソフトウェアを使用して行われました (n=3–5; 有意性については p < 0.05)。
3. 結果
3.1.文章
3.1.1. GRP78過剰発現のプロテオーム解析により、主な標的がミトコンドリアであることが明らかになった
GRP78の過剰発現によって媒介される神経保護につながる分子機構を特定するために、我々は比較ラベルフリープロテオミクス分析を実施し、以前に神経保護作用があることが判明していたGRP78（Ad-GRP78）の過剰発現について、アデノウイルスに感染した関節リウマチ損傷動物間の定量的および定性的差異を特定した。 MN の、またはコントロールとしてのベータ-ガラクトシダーゼ (Ad-β-Gal) [20]。
私たちの研究室で実施された以前の研究によると、損傷後7日（dpi）が分析の選択された時点でした[20、25]。遠位軸索切断および坐骨神経の縫合後の再生モデルと我々の変性RAモデルとの間の以前の比較では、RA後に分岐前変性事象が出現する7 dpiまではシグナル伝達事象が類似していることを観察した[20,25]。
L{3}}L5 脊髄セグメントの核後画分の LC-MS/MS ラベルフリー分析により、他のサンプルや研究で以前に報告されているように、タンパク質あたり少なくとも 2 つのペプチドを含む 1420 個のタンパク質が同定されました [25] 。
RA損傷動物では、ウイルスに感染していないRA損傷動物と比較して、Ad-GRP78またはAd-β-Galの過剰発現により、それぞれ合計566個および732個のタンパク質またはペプチドが有意に変化した(p < 0 .05）（表S1およびS2）。
両方のリストを比較したところ、22個の0がAd-GRP78の過剰発現により独自に変化していることがわかりました（表S3）。Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery（DAVID）ツールを使用してこれらのタンパク質に機能アノテーションを付けることで、データセット内の最も重要な生物学的機能 (FDR < 0.05) [34,35]。
GRP78の過剰発現により、ミトコンドリアのプロセス、機能、および構成要素に関与するタンパク質のレベルに差異が生じました（表S4A〜C、図S1A〜C）。これらのデータの遺伝子オントロジー (GO) 用語と KEGG 経路強化分析により、Ad-GRP78 に感染した動物では、ミトコンドリアの外側および内側の面からのタンパク質、呼吸複合体のタンパク質、そしてマトリックスタンパク質。
プロテオミクス リストで明らかになったタンパク質レベルの違いを確認しました。たとえば、GRP75 は上方制御され (p < 0.05)、複合体 V のサブユニット (CV ) は下方制御されていました (p=0.03)。予想どおり、GRP78 グループに含まれます (図 1A)。
リスト全体で最も下方制御されたのは、2-オキソグルタル酸/リンゴ酸キャリアタンパク質 OGC (SCL25A11)、MT-ND3 (リンゴ酸-アスパラギン酸シャトルに関与し、ミトコンドリア マトリックス内の NADH プールを再生して複合体を形成する腫瘍抑制因子) でした。 I 機能）、複合体 I の NADH デヒドロゲナーゼ サブユニット 3、ガンマアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ ABAT、複合体 III のユビキノール - シトクロム C レダクターゼ サブユニット。対照的に、アップレギュレートされたタンパク質はほとんどありませんでした (図 1B)。
1つの上方制御されたタンパク質は予想通りGRP78であり、他の上方制御されたタンパク質は主に原形質膜に存在し、場合によっては興奮性シナプスのミトコンドリアにも存在するアミノ酸トランスポーターEAAT2と、ミトコンドリアβの最後の3ステップを触媒するヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼHADHAであった。 -長鎖脂肪酸の酸化。
機能的なミトコンドリアの影響を確認するために、ミトコンドリア内の他のタンパク質またはミトコンドリア機能関連タンパク質がプロテオミクスリストから修飾されているかどうかを調査するために分析を拡張しました（図1C）。
我々は、融合に関与するミトコンドリアの保存されたダイナミン関連 GTPase 視神経萎縮 1 (OPA1) [36] が下方制御されていることを観察しました (p < 0.1)。ミスフォールドポリペプチドの選択的分解を媒介するATP依存性プロテアーゼであるLONP1は増加する傾向を示したが、ユビキノンNDUFA9、抗酸化応答エレメントを含む遺伝子を調節する転写因子NRF2、または他のダイナミンのレベルには差が観察されなかった。ミトフシン 2 (MFN2) など、注入に関与する関連 GTPase [36]。
ミトコンドリア内で見られる変化の包括的な概要を図 1D のスキームに示します。損傷したミトコンドリアは物質交換のために融合することができ、ミトコンドリアの分裂により損傷したミトコンドリアの分離とその後のミトファジーが可能になるため、ミトコンドリアの動態はストレス応答にとって重要です[37]。
下方制御されたタンパク質の多くがミトコンドリアに局在し、MFN2およびL/S OPA1形態の比率を分析することによってミトコンドリア融合活性に関して明らかな変化が観察されなかったことを考慮して（図1C）、ミトファジーに関連するマーカーを調査しました。
古典的に、ミトコンドリアのオートファジー依存性分解は脱分極後に起こり、通常、ミトコンドリア外膜でのホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）誘導性の推定キナーゼ 1（PINK1）全長の蓄積の増加によって引き起こされます。
その後、リング間 E3 ユビキチンタンパク質リガーゼ Parkin が、ユビキチン化によって脱分極したミトコンドリアのミトコンドリア外膜タンパク質をマークするために募集されます [38-41]。図 2A の上部は、パーキン レベルの変化はありませんが、7 dpi での対照と比較して、同側の L{10}}L5 脊髄セグメントにおける RA 損傷によって産生された全長 PINK1 が大幅に減少していることを示しています。対照的に、GRP78の過剰発現は、非関連タンパク質-Galの対照発現と比較して、パーキンを減少させたが、RA後のPINK1レベルを2倍にした(図2A、下)。
全長PINK1の上方制御はマイトファジーの誘導と一致しており[42]、パーキンの減少は残りのミトコンドリアタンパク質によって観察される細胞小器官の解体の進行した状態に関連している可能性がある。
我々は、ミトコンドリアと、コアマクロオートファジー機構の重要な構成要素であり、マイトファジープロセスに必要な微小管関連タンパク質1A/1B軽鎖3（LC3）陽性涙点との共局在をさらに調査する[43]。
共焦点顕微鏡を使用して、7 dpiでGRP78を過剰発現する損傷を受けたMNにおいてのみ、抗COX IVを使用して標識したミトコンドリアの、RA後のLC3-陽性涙点との共局在の有意な増加を観察しました（図2B）。
我々は、透過型電子顕微鏡を用いたサンプルの分析により、GRP78を過剰発現している場合にのみ、損傷を受けたMNにおけるマイトファジーの存在を確認した。
私たちは、ミトファジーの特徴であるミトファゴソームに似た、ミトファジー[37]に飲み込まれたミトコンドリアを含む豊富な空胞と、Ad-GRP78動物のMN内のミトコンドリアに密接に関連するいくつかのER槽を観察しましたが、Ad{3}}Gal RA損傷動物ではそれらを検出できませんでした。 5 dpi のラットサンプル (図 2C)。
図 1. RA 損傷動物における GRP78 の過剰発現はミトコンドリアタンパク質を標的とします。 （A）GRP78対GRP78のL4-L5脊髄セグメントにおけるGRP78、GRP75、およびCVタンパク質レベルの平均倍率変化（±SEM）を示すイムノブロットおよび棒グラフ。
- RA損傷ラットでGalを7 dpi過剰発現。レベルはアクチン値に対して正規化されました(n=4; * p < 0.05 vs.Ad- -Gal、スチューデントのt検定)。 (B) Ad- -Gal 群と比較して 7 dpi で GRP78 を過剰発現する RA 損傷動物の L4-L5 脊髄セグメントのプロテオミクス分析によって得られたミトコンドリアタンパク質の倍率変化のヒストグラム。 (C) アクチンに対して正規化された NDUFA9、LONP1、NRF2、MFN2、OPA-1 の平均倍率変化 (± SEM) を示すイムノブロットおよび棒グラフ。 (グループ間に有意差なし。スチューデントの t 検定)。 (D) RA損傷動物のL4-L5脊髄セグメントにおけるGRP78の過剰発現によってタンパク質が変化したミトコンドリアの模式図。7dpiで黄色（減少）または青色（増加）で強調表示されています。
図 2. GRP78 を過剰発現するラットでは、RA 後にマイトファジーが in vivo で調節されます。 （A）RA損傷マウスとRA損傷マウスのL4-L5脊髄セグメントにおける、アクチンレベルに対して正規化されたタンパク質レベル（平均±SEM）のPINK1およびPARKの倍率変化分析のイムノブロットおよび対応する棒グラフ。
コントロール (上)、または Ad{{0}}Gal および Ad-GRP78 グループ (下) から 7 dpi で表示されます。 (n=4; * p < 0.05、スチューデントの t 検定)。 (B) 左、7 dpi で AAVrh10-GFP または AAVrh10-GRP78 グループの髄腔内注射を受けた RA 損傷動物の同側部位の代表的な MN の顕微鏡写真。サンプルを COX IV (赤) および LC3 (緑) で染色し、蛍光 Nissl (青) で対比染色しました。
スケール バー=10 μm、デジタル ズームインセット 10 倍。
共局在は AAVrh10- GRP78 グループでのみ観察されることに注意してください。右、COX IVとLC3の共局在ドットの%の分析を示す棒グラフ。 COX IV と LC3 の共局在の平均 ± SEM (n=4; ** p < 0.01、スチューデントの t 検定)。 (C) 脊髄の MN 内でミトコンドリアが区別される代表的な透過型電子顕微鏡画像: a、対照動物のミトコンドリアを示す MN 細胞質の画像。 b、Ad- - gal グループの RA 損傷ラットの MN 細胞質の画像。 c、赤い星印で示した、飲み込まれたミトコンドリアの一部を伴う、Ad-GRP78群のRA損傷ラットのMN細胞質の画像。 d、より高倍率の画像が(C)に示されており、大きなミトコンドリアとERの接触が指摘されています。スケールバーは図に示されています。
まとめると、これらの結果は、GRP78 過剰発現が RA 後のミトファジン切断 MN を誘導する可能性があり、それが神経保護を促進している可能性があることを示唆しました。
3.1.2. GRP78の過剰発現は損傷したミトコンドリア機能を回復する
次に、この損傷は以前に報告されているように [20,26]、これは新規神経保護剤をスクリーニングするための信頼できる方法であるため、ER ストレスの in vitro モデルを使用してミトコンドリアに対する GRP78 過剰発現の影響をさらに調査しました [2,44]。 ]。
このモデルは、N-アセチルグルコサミン-脂質中間体の形成を引き起こすERストレス誘発物質であるツニカマイシン（Tun）を使用しており、それによって新しく合成されたタンパク質のグリコシル化を防ぎ、タンパク質のミスフォールディングを引き起こします。分泌経路の停止が RA 後の神経変性プロセスの鍵であることも報告されているため、これを使用しました [26]。
我々はまず、NSC34運動ニューロン様細胞を適切なベクターでヌクレオフェクションするとGRP78が産生されることを検証しました（図3A）。これらの細胞では、GRP78 の発現により、Tun を含む培地での生存が大幅に向上しました (図 3B)。
Tun 処理は通常 GRP78 自体を誘導しますが、この内因性過剰発現はかなり遅れて (24 時間までに) (図 S2) ます。また、我々は、RA損傷後のMN死亡のいくつかの特徴を再現することを以前に報告した別のin vitroモデルにおいて、GRP78の過剰発現が神経保護効果を有するかどうかを判定できるかどうかも疑問に思った[26]。
このモデルは、微小管の重合を妨げるノコダゾールによって誘発される細胞骨格損傷に基づいています。 GRP78 の発現により、ノコダゾールの存在下で培養された細胞の生存率も増加しました (図 3B)。
次に、小胞体ストレスを受けた NSC34 細胞において、MitoSOX を使用したミトコンドリア内の活性酸素種 (ROS) の生成、テトラメチルローダミン メチル エステル (TMRM) を使用したミトコンドリア膜電位 (Δψm)、および O2 消費率を測定することにより、ミトコンドリアの機能を評価しました。 GRP78過剰発現の有無にかかわらず。
陽性対照として、3 つのパラメーターすべてを変更する有糸分裂毒性物質であるエファビレンツ (EFV) を使用しました [45]。 Tun添加後、MitoSOXレベルが徐々に増加し、24時間までに統計的有意性に達し、ビヒクル処理対照と比較してEFV処理細胞では処理後1時間からROS生成が有意に増加したことを観察しました（図S3A）。
GRP78 の過剰発現により、Tun または EFV 処理の 24 時間後に、GFP 発現細胞と比較してミトコンドリアの ROS レベルが大幅に低下しました (図 3C)。 Δψm は、Tun 治療の 5 時間後と 24 時間後、および EFV 治療の 24 時間後に崩壊しました (図 S3B)。このパラメータの回復は、Tun または EFV 処理細胞における GRP78 の過剰発現によって達成されました (図 3D)。
GFP を発現する細胞では、Tun 添加後の 80 分間の分析中に O2 消費速度が減少しましたが (傾き -0.063,R2=0.98)、O2 消費量は減少しました。 Tunの存在にもかかわらず、GRP78-過剰発現細胞では安定でした（傾き-0.221、R2=0.99）（図3E、左）。
5 時間後、GRP78- 過剰発現細胞では呼吸は正常になりましたが、GFP 発現細胞では著しく低下しました (図 3E、右)。まとめると、これらの結果は、GRP78 が ER ストレスまたは有糸分裂毒性によって引き起こされるミトコンドリアの機能不全を軽減することを示唆しています。
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