Herba Cistanche エキスは、脱共役タンパク質の誘導の可能性により、ラット心臓のミトコンドリアのグルタチオン状態と呼吸を強化します

導入

以前に虚血状態だった心筋の再灌流は、活性酸素種 (ROS) 産生の増加、Ca の増加など、一連のミトコンドリアの変化を引き起こします。2+これらはすべて、壊死および/またはアポトーシス媒介細胞死を引き起こす可能性があります (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998)。 ミトコンドリアは決定において重要な役割を果たすためしたがって、虚血/再灌流(I/R)チャレンジ後の心筋細胞の運命は、ミトコンドリアの構造的および機能的完全性の保存に向けて、心筋I/R損傷に対する保護を目標とすべきである。 心臓の収縮機能はほぼ完全にミトコンドリアで生成される ATP に依存しているため、I/R チャレンジ後のミトコンドリアのエネルギー代謝の維持は特に重要です。 生きていても収縮していない心筋細胞は、ほとんど役に立ちません。

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Herba Cistanche、全草を乾燥させたものカンクイYC Ma (Orobanchaceae) は、主に中国北部および北東部の砂漠地帯に生育する寄生植物です。 ハーブ・シスタンシュは、中国医学では「陽を元気にする」ハーブとして分類されており、腎臓の欠乏、女性の不妊、老人患者の腸の乾燥から生じる便秘に処方されています（Chen、1998）。 私たちの研究室での以前の研究では、メタノールがヘルバ・シスタンケのエキス心筋ATP生成能力を増加させ(Leung & Ko, 2008)、ラットの心筋I/R損傷を防ぎます(Leung, 2006)。 ATP生成能力の刺激は、ミトコンドリアの電子輸送の増強と並行して行われた(Leung & Ko、2008)が、Herba Cistanche治療によってもたらされるI/R傷害に対する心臓保護は、心筋ATP枯渇の減少と関連していた(Leung、2006)。 本研究では、ヘルバ・シスタンケの心臓保護作用におけるミトコンドリアの役割を明らかにするために、ラットの心臓におけるミトコンドリアのグルタチオン状態、Ca2+含有量、膜電位、および呼吸数に対するヘルバ・シスタンケ治療の影響を調査しました。 。

材料と方法

ハーブ素材

Herba Cistanche は、地元 (香港を拠点とする) ハーブ販売業者 (Lee Hoong Kee) から購入しました。 このハーブは供給者によって認証され、引換券標本 (HKUST00301) が香港科技大学 (HKUST) 生化学学部に寄託されました。 ハーブのメタノール抽出は、そのような抽出物がミトコンドリアATP生成を促進し、ラットの心臓のI/R損傷から保護することを示した以前の研究に基づいて行われました（Leung、2006; Leung & Ko、2008）。 簡単に説明すると、前述のように (Leung & Ko, 2008)、Herba Cistanche (400 g) を小片に切り、300 mL のメタノール中で 60 度で 2 時間加熱還流することにより抽出しました。 この手順を２回繰り返した。 プールした抽出物を減圧下で溶媒を蒸発させることによって乾燥させた。 粗薬の量に関して収率は４２％（ｗ／ｗ）であった。 抽出物は使用するまで 4 度で保管されました。 中国のハーブは伝統的に経口摂取のために水で抽出されますが、我々の以前の研究ではサンプルの処理と保存の便宜のためにメタノールが使用され（Yim & Ko、2002）、メタノール抽出があらゆる点で満足のいくものであることがわかりました。

動物の世話と薬物治療

成体のメスの Sprague-Dawley ラット (8 ～ 10 週齢、200 ～ 230 g) を、約 22 度、12 時間の暗/明サイクルで湿度制御された部屋に飼育し、餌と水を自由に摂取させました。 動物をランダムに異なるグループに割り当て、各グループに 5 匹の動物を割り当てました。 ラットはそれを受け取りましたハーブエキス{{0}.2 g/mL、水溶液) 0.5 g/kg または 1.0 g/kg を 3 日間連続して胃内投与。 対照（未処置）動物には水のみを与えた。 最後の投与から 24 時間後、生化学分析のために麻酔をかけた動物から心室組織を採取しました。 すべての実験プロトコルは、HKUST の研究実践委員会によって承認されました。

ミトコンドリア画分の調製

細かく刻んだ心臓心室組織（~{{0}}.6g）を10-倍（w/v）過剰の氷冷ショ糖緩衝液[0.32Mショ糖、1mMエチレンジアミン四酢酸）中でホモジナイズしました。 (EDTA)、50mM トリス/HCl; pH 7.4] テフロンガラスホモジナイザーを使用し、4000 rpm、25 ～ 30 ストロークで行います。 ミトコンドリアペレットは、800×g、4度で30分間の遠心分離によって組織ホモジネートから調製され、純度は、以前に記載されているように、それぞれ上清およびペレット中のコハク酸デヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの相対比活性を測定することによって決定された(Evans, 1992年）。 ミトコンドリアペレットを1mLの均質化緩衝液に懸濁した。

ミトコンドリアの還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンレベルの測定

ミトコンドリアの還元型グルタチオン（GSH）レベルは、Griffith（198{{17}）を改変したプロトコールで、5,59-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）とグルタチオンレダクターゼ（GR）を使用して酵素的に測定されました。 })。 ミトコンドリア画分のアリコート (210 μL) を 90 μL の 10% (v/v) 5- スルホサリチル酸 (SSA) と混合しました。混合物を600×gで10分間遠心分離した。 酸化型グルタチオン (GSSG) レベルを測定するために、微量遠心管内で 100 μL 量の SSA 上清を 10 μL の 20% (w/v) 2- ビニルピリジンおよび 10 μL の 60% (v/v) トリエタノールアミンと混合しました。 各チューブを室温で少なくとも 1 時間放置しました。 リン酸緩衝液（０．１Ｍ、５ｍＭ Ｎａ ２ ＥＤＴＡを含む；ｐＨ７．５）中に０．６３ｍＭ ＤＴＮＢおよび０．０５３ｍＭ ＮＡＤＰＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を含む反応混合物を、３０℃で２分間プレインキュベートした。 SSA サンプル上清 (総グルタチオン) または GSSG サンプルのアリコート (30 μL) を 96- ウェル マイクロタイター プレートのウェルに加え、0.525U/次に、GR mLを加えた。 412nmでの吸光度変化を分光光度計で5分間監視した。 GSHおよびGSSGの濃度は、標準としてGSHおよびGSSG[3%(w/v)SSAに溶解]を使用した検量線から推定し、nmol/mgタンパク質として表した。 GSH レベルは、総 GSH 量から GSSG 量の 2 倍を差し引くことによって推定されました。

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ミトコンドリアのCa2+含有量の測定

ミトコンドリアの Ca{{0}} 含有量は、Ca2+- 感受性蛍光プローブ、Fluo-5N AM エステル (Molecular Probes、オレゴン州ユージーン) を使用し、Victor2 マルチラベル カウンターを使用して測定しました。 (モデル 1420; PerkinElmer、トゥルク、フィンランド)、Menze et al. (2005)。 Ca2+ 解離定数 (Kd 値) は、1 ～ 1000 μM の濃度範囲で有効な Ca2+ キャリブレーション キットを使用して決定されました。 キットメーカーのデータによると、推定 Kd 値は 90 ～ 100 μM であり、高い信頼性があります。 ミトコンドリア画分のアリコート（25μL）（最終濃度0.5mgタンパク質/mL）を25μLのインキュベーションバッファー{100mM KClおよび30mM MOPS [3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸]と混合しました。 96-ウェル黒色マイクロタイタープレートでpH7.2}。 混合物を25度で15分間インキュベートした。 次いで、25μLのジギトニン(50μg/mL)および25μLのFluo-5N AMエステル(0.005%(w/v)プルロニックF-127中1μM)を添加した。 ジギトニンは膜透過を促進することにより、蛍光色素のミトコンドリアへの侵入を媒介しました。 ラット心臓ミトコンドリア標本中の Fluo-5N レベルが、ジギトニンの存在下で 20- 倍増加することを発見しました。 反応混合物を25度で30分間インキュベートし、励起波長488nmおよび発光波長532nmで蛍光読み取り値を測定した。 ミトコンドリアの Ca2+ 含有量は検量線を使用して推定され、μmol/mg タンパク質として表されました。

ミトコンドリア膜電位の測定

膜電位 (ΔΨm) は、Bonavita らの方法を修正した方法によって評価されました。 (2003) は、蛍光色素である親油性カチオン性プローブ 5,596,69- テトラクロロ-1,193,39-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド（一般に JC-1 と呼ばれます）を使用しています。 ミトコンドリア画分のアリコート（50μL）（1mgタンパク質/mLに調整）を、50μLの基質溶液（6mMピルビン酸および6mMリンゴ酸を含む）、25μLの前処理アデノシン二リン酸（ADP）（30mM）溶液、暗所で 3 μM JC-1 25 μL を加えます。 ΔΨm 値は、Victor2 MultiLabel Counter を使用して、535nm (FL1) と 580nm (FL2) での蛍光を測定することによって得られました。 JC-1 はミトコンドリア内で凝集体を形成し、高い FL2 蛍光値をもたらし、正常なミトコンドリア電位を示します。 ΔΨm の損失は、FL2 蛍光の減少 (JC-1 凝集の程度は低い) と、それに伴う FL1 蛍光の増加 (JC-1 モノマーから) につながります。 データは、FL1/FL2 蛍光値の比として表されました。 ΔΨm 崩壊剤であるカルボニル シアン化物 m-クロロフェニルヒドラゾン (CCCP) を使用してアッセイを検証しました。

ミトコンドリア呼吸の測定

ミトコンドリア呼吸数は、Clark 型酸素電極を備えた Hansatech Oxygraph-Plus 装置 (米国フロリダ州サラソタ) を使用して 37 度で測定しました。 ミトコンドリア画分（0.6mg タンパク質/mL）を、125mM KCl、20mM MOPS、10mM Tris、0.5mM エチレングリコール四酢酸（EGTA）、および 2mM KH2PO4 を含む呼吸緩衝液に懸濁しました。 pH7.2。 37℃で2分間インキュベートした後、各サンプルに50μLの基質溶液（5mMのピルビン酸塩および5mMのリンゴ酸塩）を加えました。 呼吸数は、1 mM ADP の存在下 (状態 3) およびすべての ADP から ATP へのリン酸化後 (状態 4) で測定されました。 状態 3:状態 4 の呼吸数の比率は呼吸制御指数であり、呼吸とリン酸化の間の結合の強さを示します (Javadov et al., 2005; Kawabara et al., 1997)。 基質溶液の添加前に、状態 1 の呼吸数を状態 2 の呼吸の開始まで測定し、状態 2 の呼吸数を ADP の添加前に推定しました。

統計分析

データは、複数のグループを比較するために一元配置分散分析 (ANOVA) によって分析されました。 p 値が 0.05 未満の場合、最小有意差 (LSD) 値を使用して 2 つのグループ間の有意差を特定しました。

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結果

図 1 および 2 に示すように、メタノールによる処理ヘルバ・シスタンケのエキス({{0}}.5 または 1.0g/kg/日×3) は、用量依存的な GSH レベルの増加 (11 ～ 30%) と GSH レベルの減少によって証明されるように、ラットの心臓におけるミトコンドリアのグルタチオン状態を大幅に強化しました。 GSSG レベル (31%)。

Herba Cistanche 治療は、対照と比較して、ラット心臓のミトコンドリア Ca2+ レベルを用量依存的に減少させました。 抑制は1.0 g/kgの用量で41%でした（図3）。

Herba Cistanche 治療は、FL1/FL2 比の減少 (14 ～ 16%) で証明されるように、ミトコンドリア ΔΨm を増加させました。 CCCP (100 μM) は、FL1/FL2 比の増加で示されるように、ΔΨm の崩壊を引き起こしました (図 4)。

ヘルバ シスタンケ トリートメント対照と比較して試験動物における状態 3 の呼吸率 (84%) が有意に高いことから明らかなように、ミトコンドリア呼吸が強化されました (表 1)。 状態2と状態4の呼吸レベルはそれぞれ47%と80%増加しましたが、状態4の呼吸の刺激は、脱共役タンパク質2/3の阻害剤である1mMグアノシン-5'-二リン酸によって完全に抑制されました。 Herba Cistanche 治療は、状態 3/状態 4 の呼吸数の比によって推定される呼吸制御指数に影響を与えませんでした。

議論

Herba Cistanche で処理したラットの心臓から単離されたミトコンドリアは、GSH レベルの増加と GSSG レベルの低下によって示されるように、グルタチオン状態の増強を示しました。 ミトコンドリアのグルタチオン酸化還元状態の維持は、I/R損傷に対する心臓保護にとって重要です(Chiu & Ko, 2003)。 サイトゾルの Ca2+ 含有量は、心筋虚血中に内膜 Ca2+ ユニポーターによる取り込みを介して増加し (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990)、ミトコンドリア Ca2+ の増加につながります。 } 累積。 私たちの結果は、Herba Cistanche 抽出物による治療がミトコンドリアのグルタチオン酸化還元状態を強化し、ミトコンドリアの Ca2+ レベルを低下させ、心筋 I/R 損傷に対する保護を与える可能性があることを示しています (Leung、2006)。 1.0 g/kg という高用量での Herba Cistanche 治療が GSSG および Ca2+ レベルをさらに低下させることができないのは、グルタチオンの酸化還元電位とカルシウムの状態に影響を与える自己制限的な調節機構の存在に関連している可能性があります。ミトコンドリアで。

ミトコンドリアは、電子輸送により内膜を横切る電気化学的プロトン勾配を生成します。 この勾配は、ATP シンターゼによって ADP を ATP にリン酸化するために使用されます。 培養心筋細胞の損傷後の低酸素/再酸素化の場合のように、ミトコンドリア膜電位の低下は (Chiu et al., 2008)、ATP 生成の減少をもたらします。 心筋ミトコンドリア膜電位を増加させる可能性のある Herba Cistanche 治療は、特に虚血後の再灌流中に ATP 生成を促進する可能性があります。 繰り返しになりますが、なぜミトコンドリア膜電位に対するヘルバ・シスタンケ治療の効果が用量依存性ではないのかは、自己制限的な調節機構の存在によって説明される可能性があります。

酸素消費量で評価すると、Herba Cistanche 治療により、ラット心臓ミトコンドリアの状態 3 の呼吸数が大幅に増加しました。 この発見は、ミトコンドリア ATP 生成能力の in vitro および situ 測定から得られた結果と一致しています (Leung & Ko、2008)。 興味深いことに、Herba Cistanche 治療は心筋 ATP の定常状態レベルを低下させましたが (データは示されていません)、この治療はミトコンドリア ATP 生成を促進しました。 非共役呼吸の関与により、これらの矛盾した観察が説明される可能性があります。 非共役酸化的リン酸化は、プロトンがミトコンドリア内膜を通ってミトコンドリアマトリックスに戻るときに起こり、電子伝達鎖によって形成された膜電位が消散します。 これにより、ATP 形成を促進するプロトン推進力が減少します (Garvey、2003)。 結果として、ミトコンドリア内の Ca2+ 濃度と ROS 産生は劇的に減弱します (Teshima et al., 2003)。 この示唆は、Herba Cistanche で治療した心臓におけるミトコンドリア Ca2+ レベルの減少を示した本研究の結果と一致しています。 脱共役呼吸に関しては、Herba Cistanche 処理により脱共役タンパク質 (UCP) の合成が誘導される可能性があります。 UCPは酸化的リン酸化の共役を解除することが知られており、トランスジェニックマウスの心臓におけるUCP1の発現はI/R誘発性心筋損傷から保護された(Hoerter et al., 2004)。 UCP の脱共役効果は、プリンヌクレオチド二リン酸および三リン酸 (ADP、ATP、グアノシン二リン酸 (GDP)、GTP など) によって阻害されました (Echtay et al., 2002)。 本研究では、膜電位や呼吸数などのミトコンドリアパラメータが、ADP（基質として）の存在下で測定されました。 したがって、UCP の脱共役効果は抑制されました。 しかし、ミトコンドリアの状態 4 の呼吸速度を ADP の非存在下で測定した場合、この速度は未処理の対照の心臓よりも Herba Cistanche で処理した心臓から調製したミトコンドリアの方が高かった。 状態 4 の呼吸数は、F1 F0 -ATPase が関与しない機構を介してプロトンがミトコンドリア マトリックスに漏れ戻るときのミトコンドリアによる酸素消費を反映しています (Garvey、2003)。 Herba Cistanche によって誘発される状態 4 の呼吸の増加に UCP が関与している可能性は、この増加が GDP によって抑制されたという発見によって裏付けられています (Bento et al., 2007)。

結論として、Herba Cistanche による治療は、ラットの心臓においてミトコンドリアのグルタチオン状態を高め、ミトコンドリアの Ca2+ レベルを低下させ、ミトコンドリアの膜電位と呼吸数を増加させる可能性があります。 ミトコンドリアのグルタチオンの状態と機能的能力の強化、および推定上の UCP の誘導は、ミトコンドリアのグルタチオンの状態と機能的能力の増強は、ヘルバ シスタンケ トリートメントI/R損傷後。

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