超音波支援抽出を使用してピーナッツ殻から分離された生物活性化合物の美白および抗しわ効果
Mar 19, 2022
連絡先：ali.ma@wecistanche.com
Da Hye Gam 1、Ji Woo Hong 1、Jun Hee Kim 1、Jin Woo Kim 1,2,3、*
概要：応答曲面法を使用して、ピーナッツ殻抽出物のDPPHラジカルスカベンジング活性（RSA）、チロシナーゼ活性阻害（TAI）、およびコラゲナーゼ活性阻害（CAI）を含む従属変数を同時に最適化するための超音波支援抽出（UAE）条件を最適化しました。 抽出時間（5. 0〜55。0分、X1）、抽出温度（26。0〜94。0◦Cを含む主な変数の影響、X2）、およびエタノール濃度（0。0パーセント〜99.5パーセント、X3）が最適化されました。 各条件からの実験値に基づいて、最適条件の予測のために二次回帰モデルが導出されました。 独立変数の決定係数（R2）は0。89〜0。96の範囲であり、回帰モデルが予測に適していることを示しています。 重ね合わせ法に基づいて最適なUAE条件を予測する際に、抽出時間31.2分、抽出温度36.6°C、エタノール濃度93.2％が特定されました。 これらの条件下で、RSAは74.9パーセント、TAIは50.6パーセント、CAIは86。8パーセントと予測され、実験値とよく一致しています。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、ピーナッツ殻抽出物がチロシナーゼB 16-F0細胞の関連タンパク質-1およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-3遺伝子。 したがって、美白ピーナッツ殻抽出物のタンパク質および遺伝子発現レベルでの抗しわ効果、および結果は、ピーナッツ殻が美白しわ防止効果。 この研究に基づいて、副産物と考えられていたピーナッツの殻は、健康的な食品、医薬品、化粧品の開発に使用できます。
キーワード：ピーナッツシェル; 最適化;美白; 抗しわ; 抗酸化剤;チロシナーゼ; コラゲナーゼ; ヒトチロシナーゼ関連タンパク質-1（TRP -1）; マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）
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1.はじめに
メラニンは、表皮のメラノサイトのメラノソームから合成される茶色または黒色のポリマー色素です。 その主な機能は、皮膚を保護するために紫外線（UV）を遮断することです。 あるいは、その過剰な産生は、肝斑、ほくろ、シミなどの色素黒化を引き起こす可能性があります[1–3]。 チロシナーゼは、自己酸化および重合反応を触媒する主要な酵素であり、これにより、チロシンはジヒドロキシフェニルアラニンを介してドーパキノンに変換され、メラニン生合成中にドーパクロメート処理によってメラニンを生成します[4]。 したがって、それは、メラニン産生を阻害することによって減少または減衰させるために広く使用されています。チロシナーゼ化粧品の美白効果を高めるための活動[5]。 急速な工業化とクロロフルオロカーボンの使用の増加は、地球の保護オゾン層に深刻なダメージを与え、その結果、より多くのUVが地面に到達し、皮膚を露出させました。 その結果、この紫外線の増加は、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種（ROS）の活発な生成を人体に誘発します。 このような種は、チロシンの継続的な酸化を促進し、メラニンの生成を増加させました。 この点に関して、研究は積極的に行われていますチロシナーゼ活動と開発のためのROSの除去美白薬剤[6]。コラーゲンは真皮の90％を構成する主要な細胞外マトリックスです。 コラーゲンは皮膚を保護して弾力性を与え、皮膚の機械的剛性、抵抗、結合組織の結合、細胞の増殖と分化に関与します[7]。 コラーゲンなどの細胞外マトリックスを構成するタンパク質は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などのコラゲナーゼによって分解され、しわ、弾力性の低下、皮膚のたるみを引き起こします[8]。 ROSによって発現されるさまざまなタイプのMMPは、コラーゲン鎖、皮膚結合組織を加水分解し、その異常な架橋を生成して、コラーゲンの分解を増加させ、しわの形成を加速します[9]。 このため、ROS生成の低減によるメラニン生成とコラーゲン分解の抑制が美白としわ防止の主な焦点となっています[10]。美白化粧品としてのアルブチン、コウジ酸、リノレン酸、抗白剤としてのレチノール、ガレート、アデノシン-しわ化粧品は、近年広く使用されています。 しかし、これらの材料の使用は、光と熱の存在下での不安定性、および皮膚刺激や接触性皮膚炎などの副作用のために制限されています[11]。 従来の美白成分やしわ防止成分の欠点を克服するための天然抗酸化物質への関心の高まりとともに、植物由来の抽出物は、肌にやさしく安全な生物活性化合物を開発するために積極的に使用されてきましたホワイトニングおよび抗しわ化粧品[12,13]。
植物から生物活性化合物を抽出するために現在使用されているさまざまな抽出方法があります。 しかし、天然資源、特に植物からの生物活性化合物の抽出は、主に溶媒、熱水、ソックスレー抽出法で行われており、抽出効率の低さ、成分の分解、安定性の低さ、操作コストの高さなど、さまざまな欠点があります。 [14]。 したがって、超音波支援、マイクロ波支援、および超臨界抽出を含む抽出方法が最近テストされました[15]。 特に、超音波は周波数が約20 kHz以上の音波であり、液体の圧縮、キャビテーション、再反射を引き起こし、短時間で分子運動を最大化して高い抽出効率を実現します[16]。 さらに、超音波は、その短い抽出時間が生物活性化合物の分解を最小限に抑え、抗酸化剤で天然成分を抽出するための効果的な方法として評価されているという点で有利です。ホワイトニング、および多くの植物やハーブからの抗しわ特性[17]。 超音波支援抽出（UAE）の効率を高めるには、抽出条件の最適化が不可欠であり、最適化プロセスは、実験的方法または統計的方法のいずれかで実行できます。多変量実験の場合、一度に1つの要因のみが、インタラクティブ効果の決定に制限があります。 一方、RSMは、多変量実験における変数間の相関に関する統計情報、最小数のサンプルを使用した効果的な実験、および回帰モデルの有効性と適合性を評価するための重要な数学的および統計的手法を提供します。統計ベースの最適化の場合、フルファクター設計、Box-Behnken設計、中央複合設計（CCD）などのさまざまなRSM設計が広く使用されています。 その中でも、CCDは非常に効率的であるため、必要な実行回数を最小限に抑えながら、実験の可変効果と全体的な実験誤差に関する多くの情報を提供します[18]。したがって、多くの既存の研究では、CCDはプロセスの開発、改善、最適化に広く使用されています。天然物からさまざまな抗酸化剤やその他の代謝物を抽出するための条件。
ラッカセイ（Arachis hypogaea）は、マメ科に属する一年生植物です。 韓国、インド、中国、米国を含む世界50カ国以上で栽培されています[19]。 ピーナッツは、タンパク質（25％）、脂質（47％）、炭水化物（16％）のほか、ミネラル、ビタミン、ニコチン酸、不飽和脂肪酸、オレイン酸の豊富な供給源です[20]。 それらは、ナッツ、バター、食用油などの未加工または加工製品として消費されます。 世界の年間ピーナッツ生産量は合計で410万トンと推定されており、ピーナッツの殻はピーナッツの総重量の35％から40％を占めています[21]。 年間150万トン以上のピーナッツの殻が副産物として廃棄されていると推定されています。 しかし、ピーナッツの殻の一部しか動物飼料として使用されておらず、そのほとんどが焼却または埋め立てられており、廃棄コストや環境問題を引き起こしていることを考えると、副産物の問題を克服するには、ピーナッツの殻を使用して高付加価値の材料を製造する必要があります[22 ]。 抗酸化剤に関する以前の研究は、ピーナッツ皮膚抽出物の抗炎症および抗肥満活性が報告されていることを示しています[23,24]。 しかし、これまでのところ、改善のための機能性化粧品材料の製造に関する研究はありません。ホワイトニングピーナッツの殻からの生物活性化合物を使用したしわ防止効果。 したがって、この研究では、超音波支援抽出（UAE）を使用してピーナッツの殻から生物活性化合物を抽出し、それらの抗酸化、美白、および抗しわ効果を確認し、さらに応答表面法（RSM）を使用して最適なUAE条件を提示し、抽出物の機能を向上させました食品、化粧品、医薬品としての使用の可能性を確認するため。
2.結果と考察
2.1。 RSMモデルのフィッティング
この作業では、UAEに影響を与える重要な変数を決定するために、予備的な1要素ずつの実験を使用してCCDの主な変数として抽出温度、抽出時間、およびエタノール濃度を選択しました（表1）。
次に、3-変数と5レベルのCCDを使用した中心点での3つの複製を含む、17の実験実行が構築されました。 原因不明の変動の影響を最小限に抑えるために、実験順序をランダム化することにより、実験誤差を最小限に抑えました。DPPHラジカル捕捉活性（RSA）の実験結果と予測結果は、チロシナーゼ活性阻害（TAI）およびコラゲナーゼ活性阻害（CAI）を表2に示します。
CCD実験条件の17回の実験実行と実験結果の間の相関を決定するために、これら3つの変数の最適レベルを予測するために重回帰モデルが提案されました。 実験データに重回帰分析を適用することにより、従属変数（Y）とテストされた変数は、次の2次回帰方程式によって関連付けられました（表3）。
分散分析（ANOVA）は、実験データを分析するための統計的検定です。 モデルの変数に関する仮説をテストしたり、分散成分を推定したりするために、データセットの全変動を特定の変動源に関連付けられた構成要素に分割します[25]。 応答表面分析とANOVAを使用して、係数を決定し、モデル項の統計的有意性を評価し、応答変数の領域全体を最適化することを目的とした実験データの数学モデルを適合させました[26]。 モデルによって確立されたように、回帰モデルによる実験応答と予測応答の関係を決定するために使用された相関係数（R2）は、0 .8862〜0。9622の範囲でした。 これは、分析されたプロセス変数が独立変数の88.6パーセント以上を説明していることを示唆しています。 Design-Expertソフトウェアを使用して二次回帰方程式の係数を計算し、モデルの適合性をANOVAでテストしました。 二次回帰方程式の単項係数値によると、表4にリストされており、独立変数の主な効果の優先順位は、エタノール濃度（X3）>抽出温度（X2）>抽出時間（X1）です。
2.2。 RSAに対する抽出条件の影響
表2は、さまざまなUAE条件によるRSAの実験データを示しています。ピーナッツ殻抽出物のRSAは、7.6％〜89.9％の範囲で測定されました。 最も高いRSAは、次の抽出条件で特定されました。抽出時間55。0分、抽出温度60。{{10}}◦C、エタノール濃度5 0。0パーセント（実行＃1 0）。 抽出時間30。0分、抽出温度60.0°C、エタノール濃度0.0％で、最低のRSA 7.6％が実験値として特定されました（実行＃13）。 。 重回帰分析を適用することにより、実験データと応答は二次回帰方程式によって関連付けられました（表3）。 統計分析により、回帰モデルのR2は0.9308（p=0。0027）であることが明らかになりました。これは、この方程式が実験条件の結果の93.0％を説明できることを示しており、モデルが非常に重要であり、正確に予測するために使用できることを意味します。応答関数。
RSAに対する他の変数の固定レベルでの個々のUAE変数の影響が予測され、図1aに示されています。 RSAは、すべてのUAE変数が増加するにつれて増加し、その後減少する傾向があります。 エタノール濃度は3つのUAE変数の中でRSAに最大の影響を及ぼしましたが、抽出時間と抽出温度はRSAに最小の影響を及ぼしました。 この結果は、表4に示すように、エタノール濃度がRSAに対してより有意な効果（p= 0。0002）を示したANOVAの結果と一致しています。RSAの独立変数間の相互作用効果は、3Dを使用して視覚化されました。応答表面曲線。 抽出温度と抽出時間は、エタノール濃度の固定レベルで同時に変更されました（図2A）。 2つの変数（抽出温度と時間）が増加すると、RSAは最大レベルまで増加し、その後再び減少しました。 最高のRSAは56.1°Cの抽出温度で得られました。したがって、ポリフェノールなどの抗酸化能を持つ生物活性化合物の抽出は、56.1°Cまでの温度でリグニンなどの植物壁成分の破壊とともに増加することを示唆しています。 ただし、高温では、抗酸化成分の分解または重合によりRSAが低下しました。 図2B、Cは、RSAが抽出時間または温度の影響を大きく受けなかったのに対し、RSAはエタノール濃度の影響を大きく受けたことを示しています。エタノール濃度は61.0％のエタノール濃度で最も高く、再び低下しました。 この結果は、キムらによるメドハギの熱水抽出実験の結果と一致しています。 RSAは抽出温度よりもエタノール濃度の影響を強く受け、RSAはエタノール濃度範囲60％〜70％で最大でした[27]。 これらの結果は、ピーナッツ殻のUAEでの単一溶媒抽出には、二成分溶媒（水とエタノール）の抽出効率がより効果的であることを示しています。
2.3。 TAIに対する抽出条件の影響
チロシナーゼ表皮の地下層でチロシンを酸化することによりメラニン生成を促進する酵素であり、この酵素の阻害は美白 [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >抽出温度（p <{{0}}。0598）>抽出時間（p <0.4329）。これにより、エタノール濃度の影響がTAIで最も重要であることが確認されました。
TAIに対するUAE条件の影響を比較するために、摂動プロットを使用して、中心点に2つの変数を固定することにより、TAIに対する個々の変数の影響を評価しました。図1bに示すように、TAIは以前のRSA実験とは異なるパターンを示しました。 エタノール濃度が増加するにつれて増加しましたが、抽出時間はTAIに大きな影響を与えませんでした。 エタノール濃度に伴うTAIの有意な比例増加は、ANOVAの結果によって説明できます。 TAIは、エタノール濃度の1次項（X3）の影響を大きく受け、（p<0。05）2次項は統計的に有意ではないため、taiとエタノール濃度の間に強い比例関係があります。 3d応答曲面曲線は、抽出温度（x1）、抽出時間（x2）、およびエタノール濃度（x3）の影響を受けた、二次回帰方程式とtaiの結果をグラフで表したものです。="" 図3aは、taiに対する抽出時間とエタノール濃度の相互作用の影響を視覚化したものです。="" その結果、抽出時間はtaiに有意な影響を示さなかったが、エタノール濃度はtaiと強い比例関係にあることが確認された。="" 同様に、図3bに示すように、taiは抽出温度よりもエタノール濃度に依存しており、エタノール濃度が99.5％に増加すると、最高のtaiが達成されました。="" 最大taiのuae条件を調査する際、最大tai条件値は3="" {{2="" 0}}。0分、26.3°c、および99.5パーセントであると予測されました。="" この結果は、中村らによって報告された結果と類似しています。="" [31]柚子の葉の生物活性に関する研究では、エタノールの20.0％〜80.0％を抽出溶媒として使用した場合、taiはエタノール濃度の増加に比例して増加し、80％エタノールを使用した抽出で最大値を示しました。="">美白ピーナッツの殻や他の植物からの影響。
2.4。 CAIに対する抽出条件の影響
Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >エタノール濃度（p=0 .0240）>抽出時間（p=0 .8505）、したがって、抽出温度とエタノール濃度の影響がCAIに有意であったことを示しています。
図1cは、2つの変数が固定され、CAIに対する1つの変数の影響を視覚化した摂動プロットを示しています。 CAIに対する3つの変数すべての効果は類似していることが示され、3つの変数は有意な効果を示し、各独立変数が増加するにつれてCAIが増加およびその後減少しました。 私たちの研究では、2次回帰方程式を使用してCAIの2つの独立変数の相互作用を視覚化するために、3D表面応答曲線が開発されました（図4）。 エタノール濃度を中心点に固定した場合、CAIに対する抽出時間と温度の影響を図4Aで評価しました。 2つの変数が同時に変化すると、CAIは33.4分と76.8°Cに増加し、最大CAIが92.8パーセントになった後に再び減少しました。 図4B、Cに示すように、CAIは64.3％のエタノール濃度で最も高い値を示し、その後徐々に減少する傾向を示しています。これは、64.3％のエタノールからなる二成分溶媒が抽出溶媒としてより適していることを示しています。 この結果は、水とエタノールの二成分溶媒が、ツメレンゲからの生物活性化合物の抽出において水よりも高いCAIを示したことを報告した以前の研究と一致しています。これは、50％エタノールが抽出に有利であることを示唆しています。美白材料[34]。 二次回帰モデルによって予測されたピーナッツシェル抽出物の最大CAIは94.5％であり、抽出時間45.1分、抽出温度93.6°C、エタノール濃度42.3％の条件下で得られました。 私たちの研究で得られたCAIは94.5％でした。これは、Ohらによって報告された緑茶抽出物のCAI値の39.4％と40.3％の2倍以上の効果です。 [35]。
2.5。 最適な抽出条件
酸化防止剤、美白しわ防止効果はすべて化粧品にとって重要な機能であり、UAEの条件を最適化する際にこれら3つの機能を同時に最大化できる条件を導き出す必要があります。 図5は、二次回帰方程式によって導出された等高線グラフの各最適条件をオーバーラップすることにより、RSA（Y1）、TAI（Y2）、およびCAI（Y3）を同時に最大化できる最適化手順を示しています。 3つの変数を最適化するための独立変数の範囲は、抽出時間5。0〜55。0分、抽出温度26に制限されていました。{{1 0}}〜94 。0◦C、および0。0パーセント〜99.5パーセントのエタノール濃度（表5）。 個々の最適な抽出条件によると、最適なUAE条件は、抽出時間31.2分、抽出温度36.6°C、エタノール濃度の93.2％であり、上記の条件下では、RSAは74.9％、TAIは50.6％、CAIは86。8パーセントが予測されました。 予測されたRSA、TAI、およびCAIの値を検証のための実験から得られた値と比較した場合、検証テストの値は予測値と同様であり、値はそれぞれ78.2パーセント、52.3パーセント、および87.7パーセントでした。
2.6。 SEとUAEの比較
UAEの抽出効果を確認するために、UAEおよびソックスレー抽出（SE）技術を使用して生成されたピーナッツ殻抽出物のRSA、TAI、およびCAIを比較します。 SEを70◦Cで4時間の抽出時間で99.5％のエタノールを使用して一般的なSE条件下で実施した場合、RSA、TAI、およびCAIは75.5％、60.2％、および74.4％であることがわかりましたが、そうではありませんでした。最適なUAE条件下で得られた結果とは大きく異なりますが、SE条件をUAEの最適条件である31.2分と93.2パーセントのエタノールに等しく設定すると、RSA、TAI、およびCAIはそれぞれ62.0、28.3、および45.6パーセント減少しました。最適な条件下でUAEと比較。 ピーナッツの殻から有用な材料を製造する際の超音波の利点は、溶媒消費量が少なく、抽出時間が短いため、高い生産性と工業化に適したプロセスとして評価されました。
2.7。 MMP-3およびTRP-1のmRNA発現
哺乳類のメラノサイトでは、メラニン形成とコラーゲン加水分解はそれぞれTRPとMMP遺伝子によって制御され、TRP{{0}}とMMP-3はメラニン形成とコラーゲン加水分解の調節の主な遺伝子として知られています。 したがって、B 16- F 0細胞の全細胞溶解物のRT-PCR分析を実施し、最適な条件下（31.2分、36.6度、93.2パーセント）でUAEから生成されたピーナッツ殻抽出物の効果を調べました。 MMP-3とTRP-1のmRNA発現について研究した。 図6に示すように、ピーナッツを用いて遺伝子発現実験を行った場合、ピーナッツ殻抽出物はB 16-F0細胞におけるMMP-3およびTRP-1の発現を有意にダウンレギュレーションしました。 0〜1 mg/mLの殻抽出物濃度範囲。 ピーナッツシェル抽出物は、1。0mgでMMP-3とTRP-1の発現をそれぞれ6.1-倍と8.7-倍減少させました。 /mL。 これらの結果は、ピーナッツ殻抽出物がMMP3の不活性化からMMP-1の不活性化によってB16F0細胞のコラーゲン分解を阻害し、MMP-9[36]の協力を妨げることを示唆しています。 既存の研究は、植物抽出物による治療が、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ERK）をリン酸化することにより、小眼球症関連転写因子（MITF）の発現を阻害することを示しています。 したがって、ピーナッツ殻抽出物によるメラニン生成の抑制効果は、チロシナーゼERKおよびMITFの発現阻害による活性[37]。 したがって、ピーナッツ殻抽出物は、TRP-1およびMMP-3のmRNA発現レベルを低下させました。これは、ピーナッツ殻抽出物がコラーゲン分解およびメラニン形成に対して強力な阻害活性を有し、美白しわ防止効果。
3.材料と方法
3.1。 材料と試薬
ピーナッツの殻は3月2日019にNonghyupmart（高敞、全羅北道）から購入し、乾燥オーブン（FC 49、ラボハウス、ソウル、韓国）を使用して60°Cで24時間乾燥させました。乾燥重量は一定のままでした。 乾燥したピーナッツの殻をフードプロセッサー（Hanil HMF -3800、ソウル、韓国）を使用して粉砕し、600 µmsieveを通過させました。 エタノールはSamchunChemical（95.0％v / v、ソウル、韓国）から購入しました。 Folin–Ciocalteu試薬、没食子酸（97％）、およびケルセチンはMerck（Kenilworth、NJ、USA）から購入しました。 2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）、アスコルビン酸、および3、4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン（L-DOPA）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、 MO、USA）。 この実験で使用された他のすべての化学物質は分析グレードであり、Sigma-Aldrichから購入しました。 すべてのストック溶液は、aMilli-Q精製システム（Millipore、バーリントン、バーモント州、米国）を使用して精製脱イオン水で調製しました。
3.2。 超音波支援抽出およびソックスレー抽出
粉末ピーナッツ殻（1 g）を抽出容器に入れ、それぞれ1 0 mLの溶媒を入れ、ボルテックスミキサー（VM -10、Daihan Scientific Co.、Ltd.、Wonju、Korea）を使用して混合しました。 1分。 抽出は、外部冷蔵バスサーキュレーター（CDRC8、大韓科学株式会社、韓国原州）を使用して、超音波抽出器（250 W、SD-D250H、大韓科学株式会社、韓国原州）で水を循環させることによって実行されました。 ）デジタルタイマーと温度コントローラー付き。 抽出は、デジタルタイマーと温度コントローラーを備えた超音波装置を使用して実行されました。 サンプルは、40 kHzの動作周波数で、さまざまな実験期間と温度で超音波処理されました。 次に、抽出物を10、000 rpmで10分間遠心分離しました（236R、Labogene、ソウル、韓国）。 遠心分離後、サンプル量を5 mLにし、分析前に0.2 µmmメンブレンフィルターでろ過しました。 ソックスレー抽出では、粉末ピーナッツ殻（5 g）を、ソックスレー抽出器で最高温度70°Cで4時間（8サイクル）99.5％エタノールを使用して100mLで連続抽出しました。 超音波支援抽出技術は、ブドウ種子からの油の抽出において非常に効率的であることが示されました。これは、油とポリフェノールの両方の従来の抽出方法と比較して、油/ポリフェノールの収率がより低い溶媒消費量とより短い時間で得られるため、同様でした。抽出時間。
3.3。 実験計画
実験計画は、RSMの一種であるCCDを使用して実行され、実験の実行回数を最小限に抑え、要因間の相互作用を研究しました。 TheDesign-Expert®ソフトウェア8.0（State-Ease、City、MN、USA）は、実験の設計、データ分析、および抗酸化剤を含む生物活性化合物の抽出を最大化するための抽出条件の最適化に使用されました。美白、およびピーナッツの殻からのしわ防止効果。 実験はCCDに従って設計され、提示された3つの独立変数の範囲と中心点の値は、予備実験の結果に基づいていました（表1）。 CCDは、ピーナッツの殻からのRSA、TAI、CAIなどの応答を最大化するための最適なUAE条件を予測するために適用されました。 独立変数として、選択された3つの変数は、抽出時間（X1）、抽出温度（X2）、およびエタノール濃度（X3）でした。 再現性を推定するために、中心点で3回の反復を行って、合計17回の実験を実行しました。 式（1）に示すように、2次回帰モデルを使用して実験データを近似し、応答変数を予測するために適用しました。
Y= 0 + 1X1 + 2X2 + 3X3 + 11X12 + 22X22 + 33X32 + 12X1X2 + 13X1X3 + 23X2X3（1）
ここで、Yは予測された応答です。 0は定数（インターセプト）です。 1、2、および3は、線形効果項の回帰係数です。 11、22、および33は2次効果の項です。 12、13、および23は、それぞれ相互作用効果の項です。 応答表面分析とANOVAを使用して、モデル項の回帰係数と統計的有意性を決定し、実験の数学的モデルを適合させました[38]。
3.4。 DPPHラジカルスカベンジングアクティビティ（RSA）
ピーナッツシェル抽出物のRSAは、Pereira-Caroetal。 [39]。 0。0メタノール中の1mMDPPH（95パーセント）の溶液を調製し、1.25mLを0.25mLの希釈抽出物に添加しました。 RSAは、UV-Visspectrophotometer（UV1650PC、島津製作所、京都、日本）を使用して、20分間のインキュベーション後に517nmでの吸光度を測定するように決定されました。 ブランクは蒸留水を使用して調製し、RSAは以下に従って計算しました（式（2））：
RSA（パーセント）= {1 −Abs（サンプル）/ Abs（コントロール）}×100（2）
3.5。 チロシナーゼ活性阻害（TAI）
TAIは、Joらによる基質としてL-DOPAを使用する修正された方法に従って実行されました。 [40]。 サンプルを200µLのL-DOPAおよび200 µLのリン酸カリウム緩衝液（pH 6.8）および200 µLのL-DOPAと混合しました。チロシナーゼ（125 U / mL）を試験管に加え、37°Cで20分間インキュベートしました。 UV-Vis分光光度計を使用して475nmでサンプルの吸光度を測定し、結果をコントロールと比較しました。 各濃度について、酵素活性は、阻害剤を含まない緩衝液を使用したアッセイの酵素活性と比較したパーセンテージとして計算され、TAIは以下の式に基づいて計算された。 （式（3））：
TAI（パーセント）= {1 −Abs（コントロール）− Abs（サンプル）/ Abs（コントロール）}×100（3）
ここで、Abs（コントロール）はバッファーとコラゲナーゼの吸光度です。 Abs（サンプル）は、バッファーとコラゲナーゼとサンプル/標準の吸光度です。
3.6。 コラゲナーゼ活性阻害（CAI）
抽出物のCAIの測定は、WünschとHeindrichの方法を変更することによって実行されました[41]。 基質4-フェニルアゾベンジルオキシルカルボニル-Pro-Leu-GlyPro-Arg（FALGPA）を10mLバッファーに1.2mg/ mLまで溶解し、125 µLの溶液を加えて60分間インキュベートしました。 37°Cで。 コラゲナーゼをバッファーに溶解して0.4mg/ mLにし、75 µLの酵素溶液をバッファー溶液に加えました。 酵素と基質の混合物を37°Cの水浴で30分間インキュベートし、75 µLの20％クエン酸（w / v）を添加して反応を停止しました。 1.5 mLの酢酸エチルを添加した後、酢酸エチル層を分離し、320 nmで吸光度を測定しました。阻害率は、次の式に従って計算しました。
CAI（パーセント）= {1 − [Abs（コントロール）− Abs（サンプル）] / Abs（コントロール）}×100（4）
ここで、Abs（コントロール）はバッファーとコラゲナーゼの吸光度です。 Abs（サンプル）は、バッファーとコラゲナーゼとサンプル/標準の吸収率です。
3.7。 細胞株の維持と培養
メラニン産生B16-F 0メラノーマ細胞は、Korea Cell Line Bank（KCLB、Chongno、Seoul、Korea）から入手し、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Sigma-Aldrich、St。ウシ胎児血清（FBS、10％、ウェルジーン、京山、韓国）およびペニシリン-ストレプトマイシンの抗生物質溶液（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO、米国）を補充したルイ、MO、米国）。 トリプシン-EDTA（Gibco、Grand Island、NY、USA）を細胞のトリプシン処理に使用しました。 使用したすべての材料は細胞培養グレードのものでした。
3.8。 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
RT-PCRを実行して、MMP-3およびTRP-1遺伝子の発現レベルの変化を測定しました。ホワイトニングしわ防止効果として、B 16- F 0細胞を、無血清DMEM中のさまざまな濃度のピーナッツ殻抽出物で処理した24-ウェルプレートで培養し、24時間インキュベートしました。 未処理の細胞対照は、実験中、試験群と同じ条件下で維持された。 細胞からのRNA分離は、AccuPrep®Universal RNA Extraction Kit（Bioneer、Daejeon、Korea）を使用して行いました。相補DNAは、AmfiRiert Platinum cDNA合成MasterMix（GenDEPOT、Barker、TX、USA）を使用して合成しました。 CFX 96 touch PCR System（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用してRT-PCR分析を行い、mRNAレベルを測定しました。 使用したプライマーは次のとおりです。MMP-3センス、{{1 0}} AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC -30およびアンチセンス、50- TACATGAGCGCTTCCGGCAC -30; およびTRP-1センス、50- GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30およびアンチセンス、50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30。 上記の適切なプライマーセットを使用して、次のサイクリング条件を使用してそれぞれの遺伝子を増幅しました：94°Cで5分間、続いて95°Cで5秒間、60°Cで30秒間を25サイクル（forMMP -3） 、および60°Cで30秒間（TRP -1の場合）、72°Cで30秒間延長。 PCR産物を1％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、Gel Doc TM XR plusSystemおよびQuantityOneソフトウェア2.0（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して視覚化しました。 ハウスキーピングタンパク質である-アクチンは、これらのタンパク質の発現レベルが一定のままであるという仮定の下で、ローディングコントロールとして使用されました。
4.結論
この研究では、ピーナッツの殻の農業副産物から生物活性物質を回収して使用し、複数の用途で付加価値のある成分を開発するために、補完的なアプローチが採用されました。 まず、UAEプロセスを最適化することにより、抗酸化作用、美白作用、しわ防止作用を備えた生物活性化合物の抽出効率を高めることを試みました。 したがって、この研究では、UAEを使用して生物活性化合物を効率的に生産しました。美白ピーナッツの殻からのしわ防止効果と統計ベースの最適化を適用して、RSA、TAI、およびCAIを同時に最大化します。 アラブ首長国連邦の条件はCCDを使用して最適化され、ピーナッツの殻から生物活性化合物を抽出する際には、溶媒と濃度の選択を考慮する必要があることが確認されました。 応答曲面を重ね合わせることにより、3つの従属変数の曲線、31.2分の抽出時間、36.6°Cの抽出温度、および93.2パーセントのエタノール濃度がUAEの最適条件であると決定されました。 ピーナッツ殻抽出物のRSAは非常に高く、指標であるTAIとCAIの増加が期待できることが確認されています。美白それぞれ、しわ防止効果。 アラブ首長国連邦の条件の最適化により、ピーナッツシェルでの生物活性物質の生成の増加、およびピーナッツシェル抽出物の美白および抗しわ活性の増加が確認されました。チロシナーゼコラゲナーゼ活性のダウンレギュレーション。 これに基づいて、MMPおよびTRPの発現レベルに対するピーナッツ殻の効果を評価し、遺伝子発現レベルで白色化および抗しわ効果があるかどうかを評価しました。ピーナッツ殻抽出物の白色化および抗しわ効果は、 mRNAの発現とMMP-3およびTRP-1のタンパク質発現の阻害。 したがって、ピーナッツ殻抽出物は効果的であることが示されていますホワイトニングタンパク質発現と遺伝子レベルでのしわの改善。 アラブ首長国連邦を使用したピーナッツシェル抽出物は、高い抗酸化作用と優れた美白効果および抗しわ効果を備えており、ピーナッツシェルに天然の化粧品および食品原料として大きな可能性をもたらします。 さらに、UAEを使用した生物活性化合物の製造は、従来のプロセスと比較して高い製造収率と低い処理コストを考えると、化粧品、食品、および医薬品の製造の商業化プロセスに適用できると考えられています。
