細胞老化のマーカーである高P16INK4aは、ループス腎炎の腎障害、障害、転帰に関連しています
Mar 24, 2022
前書きループス腎炎（LN）は、全身性エリテマトーデス（SLE）の重篤な合併症であり、糸球体基底膜への免疫複合体または自己抗体の沈着とそれに続く炎症細胞の動員によって開始されます。腎障害不可逆的な線維症を引き起こし、腎機能の喪失をもたらします。 LNは、高用量のコルチコステロイドおよびその他の免疫抑制剤で治療されます。 それにもかかわらず、患者の3分の1は腎機能、5％-10％が最終段階を開発しています腎疾患したがって、新しい治療標的と同様に、タイムリーな治療のエスカレーションまたは変更を可能にする予後マーカーが熱心に求められています。テロメア侵食、酸化ストレス、慢性炎症などの刺激によって引き起こされる細胞老化は、最終的に不可逆的な成長につながります細胞老化科学の主要な特徴であるpl6Naタンパク質（CDKN2A）を含むサイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤の蓄積による停止老化細胞は代謝的に活性を維持し、β-ガラクトシダーゼ活性のアップレギュレーションや獲得を含む多くの形態学的および生理学的変化を受けます炎症誘発性、線維化促進性の老化に関連する分泌表現型（SASP）の発現。」 組織の修復とリモデリング（例えば、胚発生中）には不可欠ですが、細胞老化は、癌だけでなく、加齢に関連した慢性疾患にも悪影響を与える可能性があります。 pl6Nkまたはβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞が観察されています腎臓老化と特定の腎臓病、および組織学的病変と関連していた腎臓減損。 -ガラクトシダーゼ陽性細胞の存在は、MRL/lprlupus傾向のあるマウスの程度のタンパク尿と相関していました。 ただし、細胞老化はまだ明確に陽性のLNで示されていません。 ここでは、pl6kaの発生を報告します。 活動性LNの（n =40）患者からの腎臓生検における細胞、およびその関連腎障害および機能障害。
キーワード：腎臓機能; 腎臓病; 腎臓生検; 腎障害; 腎臓
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方法：患者と腎臓生検患者は、Cliniques Universitaires Saint-Luc（ブリュッセル、ベルギー）のリウマチ科で募集されました。 全員が1982年に改訂されたSLEのACR分類基準を満たし、生検で証明されたLNを持っていました。 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腎生検は、1996年1月から2019年11月の間に診断目的で収集された残存体材料でした。推定糸球体濾過率（eGFR）値は、慢性腎臓病疫学コラボレーション（CKD-EPI）式を使用して計算されました。 人間の研究に関するベルギーの規制と一致して、残留体材料の使用には患者の同意は必要ありませんでした。
組織学および免疫組織化学SLEのISN/RPS2003分類腎臓生検、半定量的硬化症スコア、および国立衛生研究所（NH）活動指数（AI）と慢性指数（C）は医療記録から取得されました。 抗CD8（C8 / 144B、Dako）および抗p16INK4（E6H4、Roche Ventana CINtec Histology）およびPicrosirius Red（PSR）染色による免疫トレーニングを5μmFFPE連続切片で実施しました。 スライドは、SCN400スキャナー（Leica Biosystems、ドイツ）またはPannoramic共焦点スライドスキャナー（3DHistech、ハンガリー）で20倍の倍率でデジタル化されました。 著者V2017.2（Visi Biopharm、デンマーク）を使用して、切片の表面全体のコンピューター支援定量化を実施しました。 示されている結果は、組織のμm²あたりのpl6KまたはCD8-陽性細胞の数です。 半定量的PSRスコア（スケール：2-6）は、3つの（盲検化された）スコアラーからの中央値（糸球体および間質性線維症）スコアです。 詳細については、オンライン補足方法1、オンライン補足図1を参照してください。統計分析統計分析は、GraphPad Prism V.9.1で実行されました。0：2グループ比較のMann-WhitneyまたはWilcoxonマッチドペア符号順位検定、マルチグループ比較のKruskal-Wallis、およびSpearmanの順位相関係数。
結果：活動性LN患者の腎生検におけるp16k4-陽性細胞免疫組織化学によりp16Nkタンパク質を評価しました腎臓偶発的腎炎（n =31）および再発（n =9）を含む活動性LNの40人の患者から診断時に採取された生検。 人口統計、生物学、および臨床データは、オンライン補足表1.p16INkAに要約されています。 陽性細胞はすべて検出されましたが、サンプル間でかなりのばらつきがありました。事実上まったくない細胞から時折散在する細胞、強い陽性領域まで（図1A、オンライン補足図2A-D）。 pl6染色の定量化により、LN生検の不均一性が確認されました（範囲：1.76×10〜-260×10〜、中央値：14.7×10-細胞/μm）（図1B、C）。染色細胞にはメサンギウム細胞が含まれます。糸球体の内皮細胞またはポドサイト、ボーマンカプセルの壁側上皮細胞、近位または遠位尿細管細胞、および間質細胞（図ID）。ただし、pl 6-陽性細胞の密度（μmあたり）は糸球体でよりも有意に高かった。間質（図1C）では、これらの値（サンプルあたり）は有意な正の相関を示しました（r =0。7591、p<0.0001)(online supplemental="" figure="" 3).="" importantly,="" pl6ka="" accumulation="" was="" not="" associated="" with="" patient="" age,="" gender,="" or="" ethnicity="" (online="" supplemental="" figure="">
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p16 "K4は、ベースライン時および治療後5年の腎機能障害に関連していますp16INKEa陽性は障害と有意に関連していた腎機能：eGFR患者からの生検<60 at="" the="" time="" of="" sampling="" had="" significantly="" higher="" pl6inf-positive="" cells/μm²,="" and="" conversely,="" samples="" with="" high(="">75パーセンタイル）p16aは、ベースラインeGFRの大幅な低下と関連していました（図2AB）。 eGFRとの関連は、糸球体および間質性pl6aの両方に当てはまりました（オンライン補足図5A、B）。 興味深いことに、高い糸球体p16は、主に魅力を反映する有意に高いタンパク尿（尿タンパク/クレアチニン比）とも関連していましたが、そうではありませんでした（オンラインの糸球体損傷、間質性pl6ka精神図5C、D）。 との関連とは対照的に、貧しい人々とは関連していませんでした腎機能、血清抗二本鎖DNA抗体またはC3レベルなどの全身性疾患の、またはISN / RPS分類を伴うpl6NK4aパラメーター（オンライン補足図6A-D）。 SLEとLNの診断期間が長い患者の生検、および腎炎の発症と比較して再発では、わずかに（有意ではないが）高いpl6kが観察されました（オンライン補足図7A、B）。 重要なことに、インシデントLN症例のみの分析は、pl6とeGFRの関連を支持し（オンライン補足図7C）、腎疾患の期間だけに依存しているわけではないことを示唆しています。 最後に、ベースライン生検での高いp16Nkiaは、治療後5年（ただし1年ではない）でのeGFRの低下とも関連しており、長期的な不良を予測する可能性があることを示唆しています。腎臓進化（図2C、D）。
図1アクティブなLNの患者からの腎臓生検におけるp16NK43-陽性細胞。（A）LN腎臓ベースライン生検からのFFPE連続切片のp16、CD8およびPSR染色。 概要（左パネル）、クローズアップ（右）、糸球体内のp16陽性細胞、糸球体周囲CD 8-陽性細胞、および同じ糸球体のボーマン嚢内およびその周辺のコラーゲン沈着物を示しています。 （B）p16xaの定量化（陽性細胞/μm²はサンプル間の不均一性の程度を示しています。 （C）p16の定量化< （positive="" cells/um²）="" in="" glomerular="" vs="" interstitial="" areas="" of="" the="" same="" samples.p-value:="" wilcoxon="" matched-pair="" signed-rank="" test.="" (d)="" representative="" image="" from="" a="" sample="" showing="" p16-positive="" cells="" within="" glomeruli="" (#),="" in="" bowman's="" capsules="" (filled="" star),="" proximal="" tubules(filled="" arrow),="" distal="" tubules(arrow)="" and="" dispersed="" in="" the="" interstitium="" (arrowhead).ffpe,="" formalin-fixed="" paraffin-embedded;="" ln,="" lupus="" nephritis;="" psr,="" picrosirius="">
p16NK43は、腎CD8*T細胞浸潤およびp16Ma線維症に関連していますCD8tTリンパ球はLN腎臓に浸潤する主要な免疫細胞型であり、それらの存在は腎疾患重症度pl6-の高い生検では、CD8t T細胞の浸潤が有意に高いことがわかりました（図3A）。 それらはまた、線維症の増加と有意に関連していた：コラーゲン
PSR染色の半定量的スコア、および神経病理学者によって提供された硬化症およびNH CIスコアに反映される沈着（図3B-D）。 対照的に、NIH AIスコアは、p16INK4aのグループ間で有意差はありませんでした（データは示していません）。 興味深いことに、組織切片を調べると、特定のLN生検（図IA、オンライン補足図2）。 したがって、私たちは。 各糸球体の周囲30μmの半径内にあるCD8*T細胞の数、そのボーマン嚢の厚さ、およびその中のpl6k陽性細胞の数を定量化しました（オンライン補足図1）。 これは、すべてのサンプルにわたって、3つの連続したセクションに表示されるすべての糸球体で行われました。 高いpl6K4-陽性細胞蓄積を伴う糸球体は、糸球体線維症を反映して、有意に高いペリゴ黄斑CD8 T細胞（図3E）、およびボーマン嚢の厚さの増加を示しました（図3F）。
討論これは、細胞老化の主要な特徴であるpl6NaがLNの疾患の重症度に関連していることを示す、大規模な一連の患者における最初の実証です。 pl16タンパク質のIHCは、ex vivoでの老化を評価するために広く使用されており、他の重症度と関連付けられています腎臓老化および誘発された腎症のマウスモデルにおけるpl6-陽性細胞の選択的排除は、さらに、線維性病変を軽減し、改善することが示されている。腎機能、'で重要な役割を示唆している腎臓病因。 LNで細胞老化が起こる理由は不明です。 LN腎臓の炎症性、酸化性環境は、細胞ストレスの原因となる可能性があります。 いくつかの炎症誘発性因子が老化誘導に関与しており、SLE15患者の骨髄間葉系幹細胞の老化表現型に関連している14インチのインターフェロン-B3私たちの研究は、pl 6-陽性細胞の存在量とLNの重症度との有意な関連を強調していますが、より大きなコホートでの細胞老化の追加マーカーの使用は、LNでの関連性を確認するために不可欠です。 細胞老化が疾患の進行に寄与するかどうか、そしてどのように寄与するか（またはそれが単に組織損傷を反映するかどうか）はまだ調査されていません。 老化細胞に典型的な線維化促進性、炎症誘発性セクレトーム（SASP）を介して有害な効果が発揮される可能性があります。 この仮説に沿って、pl6Nk陽性細胞、線維症、およびLN腎臓におけるCD8*T細胞浸潤の間の緊密な空間的共分布について説明します。 別の病原性メカニズムは、例えば、機能的に無能な細胞の蓄積を伴う可能性がある。腎臓前駆細胞（RPC、ボーマン嚢の糸球体にある頭頂葉上皮細胞のサブセット）。腎臓細胞サブセット、「老化RPCは組織修復を妨げる可能性があります。」最後に、SASPは老化細胞のクリアランスのために免疫系（CD8t Tリンパ球を含む）8に関与するのに特に適していますが、後者は阻害することによってプロセスを混乱させる可能性があります細胞老化細胞」「老化細胞の持続性（圧倒的または免疫応答の阻害による）は、正の影響から負の影響へのバランスを崩すことが示唆されています。」 LNの病因におけるpl6Nk陽性細胞の役割。 これは、特発性肺線維症および糖尿病性腎疾患において有望な結果を示した老化細胞除去薬ダサチニブとケルセチン（DQ）を使用した最初のオープンラベルパイロット研究である治療に重要な影響を与える可能性があります。最後に、高いベースラインpl6INk4と障害のあるものとの関連腎機能治療開始から5年後のことは、それが疾患の重症度の有望な予測因子である可能性があることを示唆しています。 これらのマーカーのベースラインからlyearは、いずれかの時点のみよりも治療反応をよりよく反映する可能性があります。
