腎臓結石の形成を予防および軽減する方法は？

詳細情報：ali.ma@wecistanche.com

パートⅠⅡ：腎結石形成の初期段階でTGF-1/Smadシグナル伝達によって活性化されるリン脂質スクランブラーゼによって調節されるホスファチジルセリンの外転

Xiu Guo Gan1・Hai Tao Xu1・Zhi Hao Wang

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序章

尿路結石症は、人間に影響を与える最も一般的な疾患の1つであり、複数の泌尿器科合併症に関連しています[1]。 伝えられるところによると、シュウ酸カルシウム（CaOx）は培養腎尿細管細胞を損傷し、その後、細胞膜ホスファチジルセリン（PS）がinvitroで内層から外層に反転して重要な役割を果たします。腎臓結石フォーメーション[2]。 同様の発見が、細胞レベルで実施されたさまざまな研究[3-6]によって報告されています。 ただし、CaOxを介した損傷によって引き起こされる尿細管細胞のPS外部化の根底にあるメカニズムは不明であります。 以前の研究では、高濃度のシュウ酸カルシウムが活性酸素種（ROS）の過剰産生を引き起こし[7]、これが尿細管細胞のPS外在化に寄与し、CaOx結晶の核形成と成長をもたらすことが示されています[8]。 ROSと脂質過酸化は、リン脂質スクランブラーゼ（PLSCR）[9]を強力に活性化しますが、グルタチオン、コエンザイムQ10、またはイデベノン（合成コエンザイムQ10ホモログ）などのROSスカベンジャーへの曝露は、多嚢胞性腎疾患におけるPLSCRの活性化を低下させます[10]。 。 細胞膜に固定されているPLSCR[11]は、濃度勾配に沿って膜の両側でPSの急速な双方向移動を触媒することができる3つのリン脂質反転酵素の1つとして機能します[12]。 生理学的条件下では、細胞膜は非対称状態にあり、PLSCRは膜に影響を与えません[13]。 しかし、真核細胞の損傷に続いて、PLSCRが活性化され、PSを内層から外層に移動させます[14,15]。 さらに、チャイニーズハムスター卵巣K1細胞でのPLSCRの過剰発現は、PSの外在化を刺激し、アポトーシス中の細胞表面へのPSの外向きの動きを促進すると報告されています[16]。 したがって、PLSCRはROSの活性化を介して尿細管細胞膜のPS外在化にも関与していると仮定しました。

シュウ酸塩が誘導するROS産生の潜在的な分子メカニズムは、TGF - 1 / Smadシグナル伝達の誘導を介して発生します。これは、ROSの産生に役割を果たす可能性があります[17,18]。 実際、TGF - 1 / Smadシグナル伝達は、糸球体腎炎、腎間質性線維症、腎結石症などの無数の腎疾患に関与していると報告されています[19]。 さらに、TGF - 1で処理された単核細胞は、PSの内層から外層への反転を引き起こすことにより、細胞膜でPS外部化を示します[20]。 ただし、私たちの知る限り、TGF - 1/Smadシグナル伝達と尿細管細胞膜のPSeversionとの関係は不明なままです。 TGF - 1は、ラットの初期段階でPLSCRを活性化することにより、尿細管細胞膜のPS外転に関与していると仮定しました。腎臓結石ROSによって媒介される形成。

したがって、TGF - 1 / Smadシグナル伝達がROS活性化を介してPSの外在化を刺激するかどうか、およびTGFが尿細管細胞膜のPLSCRを初期段階で活性化するかどうかを調査しました。腎臓結石invitroおよびinvivoでの開発、それによっての病因の理論的基礎を築く腎臓結石形成。

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材料および方法

初期のCaOx腎結石形成のラットモデル

体重200±20gの清潔な3-月齢のオスのウィスターラット60匹が、ハルビン医科大学の実験動物センターから提供され、室温（22度±2度）および50-70パーセントの湿度で飼育されました。 適応繁殖の3日後、それらはランダムに3つのグループ（20匹のラット/グループ）に分けられました—コントロール、腎臓結石、 と腎臓結石プラスSB431542（TGF - 1 / Smadシグナル伝達経路阻害剤）。

腎臓結石形成は、腎尿細管細胞損傷後の初期の病理学的変化として開始されます[21,22]。 この傷害のプロセスを研究するために、初期段階のラットモデル腎臓結石標準化されたアプローチがまだ報告されていないため、フォーメーションが確立されました。 尿細管細胞損傷後の初期の変化を観察するために、Lietらによって報告された方法を適用しました。 [23]。 簡単に言えば、対照群のラットは強制経口投与により毎日2 mLの蒸留水を投与されたが、腎臓結石グループには、1パーセントのエチレングリコール溶液と1パーセントのNHCl溶液2mLを強制経口投与により毎日投与しました。 のネズミ腎臓結石さらに、SB431542グループにSB431542共溶媒（5 mg / kg、S1067; Selleckchem、上海、中国）を7日ごとに腹腔内注射しました[24]。 食料と水は自由に与えられた。 14日目に、ラットを麻酔薬の過剰摂取（ペントバルビタールナトリウム、200 mg / kg、腹腔内注射による）で安楽死させ、腎臓を切除しました。 左腎臓は、その後のタンパク質検出のために液体窒素ですぐに保存されました。 右腎臓を固定し、脱水してパラフィンワックスに包埋しました。 すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。 実験手順は、ハルビン医科大学の第一付属病院の動物実験使用倫理委員会によって承認されました（承認番号：2020005、ハルビン、中国）。

腎臓組織の結晶形成

組織サンプルはピッツォラート法[23]を使用して染色し、CaOx結晶を偏光光学顕微鏡（Sinico Optical Instrument Co.、深セン、中国）で観察しました。 ピッツォラート陽性領域は、ImageJ 1.49v（National Institutes of Health、USA）を使用して、断面の全組織面積のパーミル年齢として測定および表現されました。

フローサイトメトリーによるinvivoでの尿細管細胞膜のPSの検出

腎上皮細胞のPS曝露は、前述のように[2]、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識アネキシンV染色アッセイを使用して評価しました。 細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス、東京、日本）で（各グループで）観察されました。 PSの外在化の量は、アネキシンV陽性細胞のパーセンテージとして決定されました。 サンプルのアネキシンV蛍光は、フローサイトメーター（488nm励起/530nm発光;Beckman Coulter、Brea、CA、USA）を使用して測定しました。

ウエスタンブロッティングによる尿細管細胞膜のTGF- 1およびSmad7レベルの測定

凍結組織サンプルを回収した後、天然膜タンパク質抽出キットProteoExtract（M-PEK）（MERCK Co.、Kenilworth、NJ、USA）を使用してタンパク質を抽出し、Bio-Radタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定しました。キット（Hercules、CA、USA）メーカーの指示に従ってください。 続いて、4 0 ugのタンパク質を8％SDS-ポリアクリルアミドゲル（スタッキングゲル100 V、分離ゲル200 V）に電極定電流300mAで1時間ロードしました。 ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレン（Kexing Co.、Beijing、China）に転写し、5％スキムミルクパウダーで37度で1時間ブロックし、羊抗ラットTGF 1（ ab208466; Abcam、Cambridge、UK）およびSmad7（66,478; Proteintech、Wuhan、China）抗体[25]。 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒツジ二次抗体を添加し（1：400;中杉金橋株式会社、北京、中国）、37度で1時間インキュベートしました。 増強された化学発光試薬（Abcam）を使用してシグナルを検出した。 Gel-Pro 4.0ゲル光学密度分析ソフトウェアを使用して陽性バンドを分析し、累積光学密度（IOD値）を測定しました。R値は次のように相対タンパク質含有量を表します。R=参照IOD値PLSCR（ターゲット）/ GAPDH（参照タンパク質）の参照IOD値。

細胞培養とRNA干渉

腎上皮細胞株（MDCK細胞、CCL34、継代53-90; ATCC、マナサス、バージニア州、米国）は、抗生物質（1 0 {{1 {{14}）を添加したダルベッコの改変イーグル培地で培養しました。 }}} U / mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシン;LifeTechnologies、Carlsbad、CA、USA）および10％ウシ胎児血清（Life Technologies Co.）、37度、5％CO、雰囲気、0.25％で継代培養トリプシンおよび1mMエチレンジアミン四酢酸（Life Technologies Co.、CA、USA）。 細胞をCaOx（0.5 mM; Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、USA）で2時間処理し、0.5mMCaOxと100ug/mL中和抗TGF- 1抗体（R＆D Systems、ミネアポリス）で処理しました。 、MN、USA）2時間。 すべての実験は3回行った。

PLSCRin PS外転の役割を決定するために、腎尿細管上皮細胞にPLSCRsiRNAをトランスフェクトしました[26]。 siRNAはAnhuiGeneralBiological System（安徽省、中国、表1を参照）によって設計および合成されました。LipofectamineTM20 00（Sunshine Biotechnology Co.、Ltd.、Shanghai、China）は、製造元の指示に従ってトランスフェクションに使用されました。 。 トランスフェクションの24時間後、細胞をトリプシンで消化し、1000×gで5分間遠心分離し、PBSで2回洗浄し、再度遠心分離しました。 上澄みを廃棄し、ペレットをPBSに懸濁して、密度1×10度細胞/mLの単一細胞懸濁液を形成した。 FAM（カルボキシフルオレセイン）発現の陽性率は、フローサイトメトリーで測定した場合、93％±5％でした。 TGF 1とPLSCRの関係をさらに評価するために、細胞を0.5mMCaOxまたは10ng/mL TGF - 1で2時間処理し、続いてPLSCRsiRNAをトランスフェクトしました。

ウエスタンブロッティングによる腎尿細管細胞膜のPLSCRレベルの測定

タンパク質は、天然膜タンパク質抽出キットProteoExtract（Chemical Book Co.、北京、中国）を使用して抽出し、タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイキット（Noble-Ryder Co.、北京、中国）を使用して決定しました。 続いて、4 0 ugのタンパク質を8％SDS-ポリアクリルアミドゲル（スタッキングゲル100 V、分離ゲル200 V）に300mAの定電流で1時間ロードしました。 ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレン（Kexing Co.、Shenzhen、China）に転写し、5％スキムミルクで37°Cで1時間ブロックし、ヒツジ抗ラットPLSCRモノクローナル抗体（1：200、 PAB781HuO1; Abcam、広州、中国）。 次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒツジ二次抗体を添加し（1：400）、混合物を37℃で1時間インキュベートした。 メンブレンを洗浄した後、増強された化学発光試薬（アブカム、広州、中国）でシグナルを検出した。 Gel-Pro 4.0gel光学密度分析ソフトウェアを使用してポジティブバンドを分析し、IOD値を測定しました。R値は上記のように相対的なタンパク質含有量を表しています。

表1PLSCRのsiRNA配列

膜ホスファチジルセリン分布の測定

細胞膜のPS反転の量は、Kimetal。[27]によって記述された蛍光消光法を使用して決定されました。 蛍光プローブとしてニトロベンゼン-2-オキサ-1、3-ジアゾール（NBD、上海、中国）を使用した私たちの研究チーム[2]。 細胞膜の外層にあるPSをNBDで標識した後、細胞を5mMイソフルロフェートを含むPBSで培養しました。 その後、シュウ酸カルシウム（1。0 mM）を含むPBSを添加し、細胞を37℃でインキュベートした。 等量の細胞懸濁液を10分ごとに排出し、RF -5000分光蛍光光度計（島津製作所、京都、日本）を使用して蛍光強度を記録しました。 分光蛍光光度計の設定は次のとおりです。530nmの発光波長に対して10nmのスリット幅。 470nmの励起波長に対して5nmのスリット幅。 次に、50年代の平均蛍光値（FT）を記録しました。 細胞の外層からのNBD蛍光を消光するためにジチオナイト溶液を使用した後、平均減少蛍光強度（FD）も記録されました。 その後、1パーセント（w / v）Triton X -100を添加して、細胞膜を透過性にしました。 次に、細胞膜の内層からのNBD蛍光を消光し、蛍光強度（FO）を記録しました。 内側小葉のNBD-PSのパーセンテージは、後で次の式を使用して計算されました：内部化されたNBD-PSのパーセント-年齢=100×[（FD-FO）/（FT-FO）]。

PSの外在化の割合は、NBD-PSの内在化の測定に使用された原理に従って決定されました。 外小葉中のNBD-PSのパーセンテージも、次の式を使用して計算されました：外​​小葉中のNBD-PSのパーセンテージ=100×[（FT-FD）/（FT-FO）]。

統計分析

連続変数は、平均±標準偏差として表されます。 ノンパラメトリックの対応のある順位和検定、t検定、およびカイ2乗検定が使用されました。 すべての分析は、SPSSソフトウェア19。0（SPSS、Inc.、Chicago、IL、USA）を使用して実行されました。 Pでの結果<0.05 were="" considered="" statistically="">

結果

TGF - 1/Smadシグナル伝達はinvivoでPSの外部化を刺激します

ラットモデルの腎組織における結晶形成

初期段階のラットモデルを確立する腎臓結石形成、エチレングリコールおよび塩化アンモニウムをラットの胃に2週間投与した後、各腎臓切片をデジタル顕微鏡で検査した。 対照群の標本では、14日目に結晶形成なしで正常な腎尿細管構造が観察されました（図1A）。 腎臓組織から腎臓結石グループは顕微鏡検査で観察され、尿細管は目に見える微結晶で拡張しているように見えました。 CaOx結晶の時折の蓄積がいくつかの尿細管で観察され、初期段階のラットモデルの確立に成功したことを示しています腎臓結石尿細管細胞損傷の形成と生成。

腎尿細管細胞膜におけるPSの存在

細胞表面のPSに結合する蛍光分子であるアネキシンV-FITCは、PSの再分布を検出するために広く使用されています。 私たちの研究では、正常なコントロールのMDCK細胞、腎臓結石、 と腎臓結石さらに、SB431542グループが共焦点レーザー顕微鏡で観察されました（図1B）。 PS反転率は腎臓結石対照群と比較した群（P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">腎臓結石さらに、SB431542グループは、PS外部化の基礎レベルが肝臓結石グループ（P<0.05, fig.="" 1c,="">

TGF- 1およびSmad7レベルの測定

のTGF- 1レベル腎臓結石グループはウエスタンブロッティングによって定量化されました。 典型的なウエスタンブロットは、TGF- 1レベルのデンシトメトリー分析とともに図2Aに示されています。 値はコントロールの値に正規化され、チューブリンに対するTGF- 1の比率として表されました。 エチレングリコールとNHClの添加は、対照細胞と比較してTGF - 1レベルを有意に増加させ、Smad7レベルを減少させました（図2A）。 ただし、SB431542にエチレングリコールとNHを加えた処理では、エチレングリコールとNH、Clで処理したセルと比較して、TGF - 1レベルが大幅に低下し、Smad7レベルが上昇しました。

TGFはinvitroで尿細管細胞膜のPLSCR活性を活性化します

PLSCR

PLSCRのレベルはウエスタンブロッティングによって評価されました。 細胞をCaOxで2時間処理した。 PLSCRレベルは、コントロールセルではごくわずかでしたが、CaOxグループでは大幅に増加しました（P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

NBD-PS内向き運動障害

PLSCR活性を評価するために、尿細管上皮細胞膜におけるPSの内向きおよび外向きの動きを測定しました。 PLSCRが原形質膜の外側の小葉から内側の小葉へのPSの動きに影響を与えるかどうかを評価するために、蛍光標識PS（NBD-PS）を原形質膜の外側の小葉に統合し、その内部移行を監視しました（図3）。 対照群とCaOx群のMDCK細胞によって内在化されたNBD-PSの量は、それぞれ約46.2パーセントと17.8パーセントでした。 したがって、CaOxグループの細胞におけるPSの内在化の速度は、対照グループの細胞のそれよりも有意に低かった（P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

図1コントロール、腎臓結石、腎臓結石に加えてSB431542グループで結晶形成とPS外在化が観察されました。

（A）14日目の腎組織における結晶形成。 矢印は微結晶構造を示しています。 （B）MDCK細胞は共焦点レーザー顕微鏡で観察されました。

（C）外転率のフローサイトメトリープロット。 （D）反転率（パーセント）。 三角形はPを示します<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">腎臓結石グループ

強化されたNBD‑PSの外向きの動き

PSの外向き輸送がシュウ酸塩の影響を受けるかどうかを判断するために、MDCK細胞をNBD-PSで細胞内標識し、例-マイクリーフレットへの移動の程度を確認しました。 インキュベーション培地には、表面に発現したNBD-PSを迅速に抽出するウシ血清アルブミン（1％w / v）が含まれていました。 NBD-PSの約34.5％がコントロール細胞の外側の小葉に移動しましたが、CaOxグループの細胞の外側へのPSの移動速度は、内側に標識されたNBD-PS全体の速度と比較して75.3％に増加しました。対照群の細胞（P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

図2コントロール、腎臓結石、腎臓結石に加えてSB431542グループでのTGF - 1 / Smad発現、および尿細管細胞膜でのPLSCR発現.

（A）TGF - 1/Smad式。 （B）相対リン脂質スクランブラーゼ（PLSCR）レベルおよびGAPDH.Pの発現に正規化された発現を伴う代表的なブロット<>

三角形はPを示します<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

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