ヒト羊膜間葉系幹細胞は、腸内微生物叢と腸管免疫との相互作用を調節することにより、同種HSCT後のAGVHDを軽減する
Oct 18, 2023
抽象的な
同種造血幹細胞移植後の急性移植片対宿主病（aGVHD）は、最も厄介な課題の 1 つです。 腸内細菌叢の異常は aGVHD とともに進行する可能性があり、間葉系幹細胞 (MSC) には aGVHD に対する有望な治療可能性があります。 ただし、hAMSC が aGVHD 緩和中に腸内微生物叢に影響を与えるかどうかは不明のままです。 したがって、我々は、aGVHDにおける腸内微生物叢と腸管免疫を調節するヒト羊膜由来MSC（hAMSC）の効果とその根底にあるメカニズムを定義しようとしました。 ヒト化aGVHDマウスモデルとhAMSC治療を確立することで、hAMSCがaGVHDの症状を大幅に改善し、T細胞サブセットとサイトカインの免疫不均衡を逆転させ、腸管バリアを回復することを発見した。 さらに、腸内細菌叢の多様性と組成は、hAMSC で処理すると改善されました。 スピアマンの相関分析は、腸内細菌叢と密着結合タンパク質、免疫細胞、サイトカインとの間に相関があることを示した。 私たちの研究は、hAMSCが腸内細菌叢の正常化を促進し、腸内細菌叢と腸の関門である免疫との相互作用を調節することによってaGVHDを軽減することを示唆しました。
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キーワード
急性移植片対宿主病・羊膜間葉系幹細胞・腸内細菌叢・腸管バリア・腸管免疫
導入
同種造血幹細胞移植（allo-HSCT）の主な利点は、患者と患者の間のゲノム多型の違いから生じるペプチドの認識によって引き起こされる移植片対白血病（GVL）効果による強力な抗腫瘍反応です。ドナー。 しかし、急性移植片対宿主病（aGVHD）は、同種反応性ドナーT細胞による攻撃によるレシピエント組織の損傷の発生を中心に展開し、同種HSCTにおける生命を脅かす重大な合併症を表します[1、2]。 腸内微生物障害は炎症反応を誘発し、炎症関連疾患と相関していることが報告されています[3、4]。 多くの研究は、腸内微生物叢の混乱が同種HSCT後のaGVHDを引き起こす必須の要因であり、治療の新たな標的となることを示している[5、6]。 具体的には、aGVHD における腸内細菌叢の異常は、通常、腸内細菌の多様性の喪失と日和見病原体の増殖によって特徴付けられます [6]。 消化管GVHDでは、粘膜バリアの損傷により宿主抗原提示細胞とドナーT細胞の活性化が開始され、寛容原性制御性T-細胞を犠牲にして病原性タイプ-1およびタイプ-17パラダイムに沿ったT細胞分化が最高潮に達します。セルパターン[7]。 主に 16S リボソーム RNA (16S rRNA) 配列決定に基づいて、複数の種の腸内微生物叢が GVHD と関連しており、例えば酪酸産生クロストリジウム菌が上皮バリア機能の維持と急性 GVHD の軽減に関連していることが示されました [8] ]。 間葉系幹細胞 (MSC) は、その自己複製能と多系統分化能、および免疫調節特性により、過去 10 年間で大きな注目を集めてきました [9]。 MSC は、激しい炎症の存在下でバランスの取れた炎症性および再生微小環境から損傷した組織を可能にすると考えられており、免疫に基づく疾患の治療に広く使用されており、最も成功した臨床応用は GVHD 治療に関係しています [10]。 ヒト羊膜間葉幹細胞 (hAMSC) は、胚性幹細胞のような分化能力と成体幹細胞のような免疫調節特性を有する周産期幹細胞です。 典型的なMSCと同様の表現型を共有するhAMSCは、他のソースからの幹細胞と比較して、組織取得の容易さ、非侵襲性および安全性、豊富な細胞収量、および倫理的および道徳的論争が非常に低いため、幹細胞の有望なソースとなっています。 ヒト AMSC は免疫原性が低く、腫瘍原性がないという利点があり、細胞治療に理想的な細胞源となっています [11、12]。 インビトロ実験により、hAMSC は骨髄由来 MSC よりも高い増殖能力と優れた長期増殖能力を示すことが確認されています [13、14]。 多くの研究により、hAMSC が炎症性腸疾患、変形性関節症、自己免疫疾患などの多くの炎症性疾患を改善する可能性があることが実証されています [11]。 我々の最近の研究では、hAMSC がエフェクター T 細胞と Treg 細胞のバランスを調節することによって aGVHD を改善することが示されました [15]。 しかし、GVHD における腸内微生物障害に対する hAMSC の効果とメカニズムは不明です。 ここでは、aGVHD および腸内微小生態系に対する hAMSC の潜在的な影響を調査することを目的としています。 これは、aGVHDのhAMSCs治療後の腸内微生物叢と腸免疫との相関関係を明らかにする最初の研究となる。
材料と方法
hAMSC の分離、培養、および同定
hAMSC は以前に記載されているように抽出されました [15]。 3 継代 (P3) 細胞は、CD34 (581、BD Pharmingen、米国)、CD45 (HI30、BD Pharmingen、米国)、HLA-DR (G46-6、BD Pharmingen) に対する抗体での染色による表現型の同定から採取されました。 、米国）、CD11b（ICRF44、BD Pharmingen、米国）、CD90（5E10、BD Pharmingen、米国）、CD73（AD2、BD Pharmingen、米国）および CD105（SN6、bioscience、米国）を分析し、フローサイトメーターで分析しました（ BD FACS Canto II)。 特定の誘導培地（BGscience、中国）を使用して細胞の多系統分化をチェックし、脂肪生成と骨形成分化についてそれぞれオイルレッド-Oとアリザリンレッドで染色しました。 継代 3 ～ 6 の hAMSC を実験に使用しました。
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ヒト PBMC コレクション
血漿サンプルは、書面によるインフォームドコンセントを得た健康なボランティアから入手しました。 ヒト末梢血単核球 (PBMC) を Ficoll-Hypaque (天津 Haoyang、中国) 密度遠心分離によって末梢血から単離し、PBS で洗浄し、赤血溶解緩衝液 (Solarbio、中国) に 4 度で 15 分間懸濁しました。 再度洗浄し、NPG マウスへの尾静脈注射用に PBS に懸濁します。
マウス
8〜10週齢、25〜30 gの雄および雌のNPGマウスをBeijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd.から購入し、一定の温度と湿度の12時間の明暗サイクルのSPF条件下で飼育しました。 すべての動物手順は、中国国家健康医学研究評議会の動物実験ガイドラインに従って、南方医科大学施設内動物管理使用委員会 (No. L2019132) によって承認されました。
急性GVHD動物モデルと治療
aGVHD マウス モデルは、以前に記載されているように確立されました [15]。 治療のために、移植後３日目に、マウス当たり５×１０ ５ 個のｈＡＭＳＣ（ここではｈＡＭＳＣグループ）およびＰＢＳ（ここではａＧＶＨＤグループ）を尾静脈を介して各マウスに注射した。 すべてのマウスモデルにおいて、マウスの罹患率と体重変化を 2 日ごとにチェックしました。 各マウスは、体重減少、猫背、毛の乱れ、皮膚病変、可動性の低下、下痢などの病理学的特徴についてスコアリングされ、その後、Cooke によって最初に記載されたものを応用した aGVHD 臨床スコアリング システムに従って等級付けされました [16]。 場合によっては、aGVHD グループのマウスが重度の aGVHD を患っており、治療後 3 日目の hAMSCs グループのマウスを屠殺し、末梢血と肝臓、脾臓、肺、腸などの標的臓器を採取しました。 これらのマウスの糞便は屠殺前に採取された。
GFP 標識 hAMSC と in vivo トレース
GFP 標識 hAMSC は、以前に記載されているように樹立および同定されました [15]。 簡単に言うと、レンチウイルスをベクターとして緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子をhAMSCにトランスフェクトしました。 500μLのPBSに懸濁した5×105個のGFP標識hAMSCを、尾静脈を介してaGVHDマウスに注射した。 24 時間後および 72 時間後、マウスを安楽死させて腸を採取し、凍結切片を作成しました。 DAPI 対比染色を使用してレシピエント細胞を区別しました。
病理組織学的評価
aGVHD 標的臓器は剖検時に収集され、ヘマトキシリン・エオシン染色 (H&E) 用にパラフィン包埋ブロックに処理されて 5- μm 厚の切片が生成されました。 組織学的スコアは、組織構造の破壊とリンパ球浸潤に基づいて評価されました[17]。 免疫組織化学では、切片を脱パラフィンし、再水和し、メタノール中の 3% H2O2 で 20 分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活性化しました。 次に、切片を抗原賦活化し、血清アルブミンで 1 時間処理しました。 続いて、切片をウサギ抗ヒト CD45 抗体 (EP322Y、Abcam、英国) または ZO-1 抗体 ((EPR19945-296、Abcam、英国) とともに 37 度で 1 時間インキュベートしました。抗体は HRP 結合二次抗体 (Genentech、米国) で検出され、DAB で可視化され、陽性領域は Image J で分析されました。
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糞便微生物叢の 16S rRNA シーケンス
糞便ゲノム DNA は、メーカーのプロトコールに従って EZNA® 糞便 DNA キット (Omega BioTek、ジョージア州ノークロス、米国) を使用して、0.1 g の凍結糞便サンプルから抽出されました。 ゲノム DNA をテンプレートとして使用し、バーコードと PremixTaq (TaKaRa、中国) を備えた特異的プライマー (338F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'、および 806R: 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') を使用して増幅しました。細菌の 16S rRNA 遺伝子の V3-V4 超可変領域。 増幅と精製後、Magigene Technology Co., Ltd. (中国、広州) の Illumina Hiseq または Miseq ハイスループット シーケンス プラットフォームでサンプルの全ゲノムをシーケンスし、FASTQ 形式の生データを取得しました。 配列データ解析は主に Magichand プラットフォームを使用して実行されました。
フローサイトメトリー分析
マウスの aGVHD 標的臓器および末梢血を取得し、単細胞懸濁液に調製しました。 細胞は、CD3 (UCHT1、Biolegend、米国)、CD4 (RPA-T4、Invitrogen、米国)、CD8 (RPA-T8、Biolegend、米国)、CD25 (BC96、Biolegend、米国) またはアイソタイプ一致に対するモノクローナル抗体で染色されました。コントロール IgG (eBioscience、USA) を暗所、室温で 30 分間処理します。 次に、細胞を溶解バッファー (BD Pharm Lyse™) を用いて 4 度、暗所で 15 分間処理しました。 細胞内Foxp3（236A/E7、Invitrogen、米国）染色を、製造業者の推奨に従って行った（Fixation/Permeabilization Solution Kit; eBioscience）。 次に、フローサイトメーターで多色フローサイトメトリー分析を実行しました。
サイトカインの定量
マウスの血清および組織上清中のサイトカインのレベルは、Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2/Th17 サイトカイン キット (BD Pharmingen, USA) を製造者の指示に従って使用して測定しました。 簡単に説明すると、各上清サンプル 50 μL を、混合ヒト Th1/Th2/Th17 サイトカイン捕捉ビーズ 50 μL およびヒト Th1/Th2/Th17 PE 検出試薬 50 μL とともに室温、暗所でインキュベートし、その後懸濁しました。 3 時間後のフローサイトメトリー分析用。
定量的リアルタイム PCR
Trizol試薬（TaKaRa、中国）を使用して単離した後、総RNAをマウス結腸組織から抽出しました。 全RNAを鋳型として使用してcDNAを逆転写した。 -アクチンを内部参照として使用しました。 mRNA 発現は、次のプライマーを使用した qPCR によって測定されました: ZO-1-F, 5'-ACCACCAACCCGAGAAGAC-3'、および ZO- 1-R, 5'-CAGGAGTCATGGACGCACA-3 '; オクルディン-F、5'-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3'、およびオクルディンR、5'-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3'; -アクチン-F、5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'、および-アクチン-R、5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。 2-ct 法を使用して RNA 発現レベルを測定しました。
酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)
血漿中のD-LAおよびDAOのレベルは、ELISAキット(Jingmei、中国)を製造者の指示に従って使用して測定した。 簡単に説明すると、収集した血漿上清をそれぞれ96-ウェル特異的抗体でコーティングしたプレートに入れた。 吸光度は、マイクロプレートリーダー (Multiskan MK3、Thermo Fisher Scientific) を使用して 450 nm で記録しました。
統計分析
データは平均値 ± SD として表示されました。 独立したサンプルの t 検定を実行し、GraphPad Prism8.0 を使用して視覚化しました。 16S rRNA シーケンス データ分析は、Magichand プラットフォーム (http://cloud.magigenecom/）。 R パッケージ (v3.6.3) により腸内細菌叢と免疫の相関分析を行い、相関行列を表示しました。 P値<0.05 were considered statistically significant. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, n.s. not signifcant.
結果
hAMSCの同定
hAMSC は、培養中で多角形または線維芽細胞様の形態を示し (図 1A)、MSC 特異的マーカー CD90、CD105、および CD73 の表面発現については強く陽性でしたが、CD34、CD45、HLA-DR、および CD11b については陰性でした (図 1A)。 .1C）。 多系統分化に関しては、我々の結果は、hAMSCが脂肪細胞および骨芽細胞への分化を示したことを示しました（図1B）。
hAMSCはマウスのaGVHD症状を大幅に軽減する
我々はまず、aGVHDに対するhAMSCの治療効果を評価した。 ａＧＶＨＤ群と比較して、ｈＡＭＳＣは、体重減少の顕著な減少（図２Ｂ）およびａＧＶＨＤ臨床スコアの減少（図２Ｃ）によって証明されるように、ａＧＶＨＤを有意に改善した。 さらに、hAMSCs グループは、aGVHD マウスと比較した場合、有意に高い生存率を示しました (図 2D)。 病理学的組織学分析により、aGVHD が重篤な組織損傷と白血球浸潤を引き起こすことが示されました。 H&Eによって実証されたように、hAMSCは、aGVHD標的臓器における組織破壊および外因性T細胞の浸潤を軽減した(図2E)。 一貫して、IHC の結果は、hAMSC が異常な病理学的症状を改善することも確認しました (図 2F)。 これらの結果は、hAMSC が aGVHD マウスの aGVHD 症状を改善する可能性があることを示唆しました。
hAMSCはaGVHDマウスの宿主免疫に影響を与える
hAMSC が aGVHD を低下させる根本的な免疫調節機構を理解するために、末梢血および標的臓器における T 細胞の活性化と増殖を測定しました。 フローサイトメトリーアッセイにより、hAMSC が血液および標的臓器内の CD3+CD4+T 細胞および CD3+CD8+T 細胞の数を顕著に阻害することが明らかになりました（図 3A、 B)。 さらに、hAMSC群のマウスの血液および標的臓器におけるCD4+CD25+Foxp3+Tregの割合は、aGVHD群よりも有意に高かった（図3C）。 。 次に、サイトカインプロファイルに対する hAMSC の影響を調査しました (図 4)。 hAMSC の投与により、aGVHD グループと比較して、標的臓器および血液中の IL{10}A、IFN-、TNF、IL-6、および IL{13}} レベルが明らかに低下しました。脾臓のTNFレベルを除いて。 その間、肝臓内のIL-10レベルに加えて、hAMSCs治療マウスは標的臓器および血液中のIL-10およびIL-4レベルの大幅な増加を示しました。 まとめると、hAMSC は、T 細胞サブセットの免疫不均衡とサイトカインストームを逆転させることにより、aGVHD において保護的な役割を果たしました。
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hAMSCはaGVHDマウスの腸バリア損傷を改善した
hAMSC が aGVHD の腸関門を修復できるかどうかを調べるために、まず hAMSC が腸に移動できるかどうかを観察しました。 図５Ａに示すように、ＧＦＰ標識ｈＡＭＳＣは、ｈＡＭＳＣへの注射後に腸内で検出され、腸内に生着および浸潤することができた。 次に、小腸組織の組織病理学的評価を設計しました。 aGVHD グループでは、腸が侵食および壊死し、腸絨毛が明らかに破壊され、絨毛が壊れ、大量の白血球が腸粘膜、粘膜下層、固有層に浸潤していました。 腸絨毛は規則的に配置されており、hAMSCs 処理後に腸絨毛の破損や絨毛上皮の剥離はありませんでした (図 5B)。 免疫組織化学によっても、aGVHD 群の腸内でヒトリンパ球浸潤が観察されたが、hAMSC 処理によりその浸潤が減少することができた (図 5C)。 腸粘膜の完全性に対する hAMSC の保護効果を評価するために、免疫組織化学を行って ZO-1 に対する効果を検出しました。 hAMSCs治療群では、密着結合タンパク質ZO-1の発現レベルがaGVHD群と比較して有意に増加した（図5D）。 また、腸のタイトジャンクションタンパク質（TJ）のmRNA発現レベルと、D-乳酸（D-LA）およびジアミンオキシダーゼ（DAO）の血漿レベルを調べて、腸のバリア機能と腸の透過性を決定しました。 静脈内投与すると、hMASC は、TJ の重要なタンパク質である ZO{9}} およびオクルディンの mRNA 発現レベルを大幅に増加させることができました (図 5E、F)。その一方で、D-LA および DAO のレベルは減少しました (図 5G、図 5G、図 5G)。 H)。 したがって、aGVHDが発生すると、腸のタイトジャンクションタンパク質の減少と腸の透過性の増加により腸のバリアが損傷します。 一方、hAMCS は腸管バリアの破壊を著しく逆転させる可能性があります。
図 1 hAMSC の表現型および機能的特徴。 (A) 継代 0 から 3 までの hAMSC の代表的な顕微鏡写真 (染色なし、100 倍)。 (B) hAM SC の多系統分化能。 hAMSCの脂肪細胞分化（左）はOil Red-Oで染色し、hAMSCの骨芽細胞分化（右）はアリザリンレッドで染色しました（染色、100倍）。 (C) CD90、CD105、および CD73 については陽性であるが、CD34、CD45、CD11b、および HLA-DR については陰性である hAMSC を示すフローサイトメトリー分析
図 2 hAMSC は NPG マウスの aGVHD を軽減しました。 (A) aGVHD マウスモデルにおける hAMSC の投与スケジュールを示す概略図。 (B) さまざまなグループ (n=10) における体重の変化。 (C) 異なるグループ(n=10)におけるaGVHD臨床スコア(体重減少、前かがみの姿勢、毛皮の乱れ、皮膚病変、可動性の低下および下痢に基づく)。 (D) 異なるグループ間での生存 (n=10)。 (E) H&E 染色 (400 倍) および組織学スコア (組織構造の破壊およびリンパ球浸潤に基づく) (n=4) の代表的な顕微鏡写真。 (F) 免疫組織化学の代表的な顕微鏡写真 (400 倍) および CD45 陽性領域の割合 (n=4)。 値は平均値±SDとして表示されました。
図 3 hAMSC は、in vivo での Treg 生成または増殖を増強しながら、ドナー T 細胞の増殖を阻害しました。 (A) CD3+CD4+T 細胞 (n=6) のフローサイトメトリー分析、(B) CD3+CD8+ のフローサイトメトリー分析T 細胞(n=6)、(C) CD4+CD25+Foxp3+Treg (n=6) のフローサイトメトリー分析。 値は平均値±SDとして表示されました。
図 4 hAMSC は炎症誘発性サイトカイン IL-17A、IFN-α、TNF、IL-6、IL-2 を下方制御し、抗炎症性サイトカイン IL-10 および IL を上方制御しました生体内では-4 (n=5)。 値は平均値±SDとして表示されました。
aGVHD マウスにおける hAMSC 治療後の腸内細菌叢の変化
16S rRNA の配列決定は、さまざまなマウスのグループから単離された糞便細菌 DNA で実行されました。 OUT、Chao1、およびShannonインデックスを含む多様性インデックスは同様の傾向を示し、hAMSCs処理マウスはaGVHDグループと比較して有意に高い多様性を有する微生物叢を保有しました（図6A）。 Un加重ユニフラク距離、マンハッタン距離、およびブレイ・カーティス計量距離に基づく主座標分析（PCoA）により、差が有意ではなかったにもかかわらず、2つのグループのプロット上に分散したデータ点が得られました（図6B）。 続いて、腸内細菌叢の状況を評価して、2 つのグループ間の潜在的な組成の違いをさらに調査しました。 合計 773 の OTU が計算され、hAMSC グループは aGVHD グループと比較してより高い OTU を持ちました (図 6C)。 門レベルでの細菌組成に関しては、ファーミクテス属とバクテロイデス属が 2 つの最も主要な門でした (図 6D)。 また、2 つのグループ間の腸内細菌叢の分析のための比較ヒートマップも整理しました (図 6E)。 オドリバクター属とルミノコッカス属_1は、腸の恒常性を維持するために重要な微生物であるhAMSCグループ内で比較的高い存在量を示しました（図6F、G）。 どの細菌が hAMSC 治療によって変化し、aGVHD に対する疾患の進行に影響を与えたかを確認するために、効果サイズ (LEfSe) の線形判別分析 (LDA) を使用して高次元のクラス比較を実行し、細菌群集の優位性における顕著な違いを検出しました。 2つのグループ。 (図 6H、I) に示すように、連鎖球菌科 (連鎖球菌科および連鎖球菌属)、パルディバクテラ科、F0058、およびデルフティアは、aGVHD グループにおける腸内細菌叢の異常に寄与する主要な種類の細菌でした。 それにもかかわらず、有益な細菌であるラクノスピラ科、ローズブリア属、ルミノコッカス科、ルミニクロストリジウム属、オシリバクター属、およびクロストリジウム属（クロストリジウム綱およびクロストリジウム目）は、hAMSC 群において相対的な富化を示し、これは hAMSC を介した aGVHD の軽減と関連している可能性があります。 まとめると、腸内微生物叢の多様性と構成は、hAMSC 投与後に改善され、体に有益な全体的な傾向に移行しました。
カンカ チューブロサ - 免疫システムを改善する
hAMSCは腸内細菌叢と腸免疫間の相互作用を調節する
腸内細菌叢と腸粘膜バリアとの潜在的な関係を理解するために、属レベルでの TJ と腸内細菌叢との相関関係をスピアマンの相関分析によって分析しました。 図7に示すように、ZO-1と有益な細菌であるルミノコッカス科_UCG.014、ムリバキュラム、ルミノコッカス_1、およびルミニクロストリジウム_9の間には正の関係がありました。 有益な細菌であるローズブリア、オドリバクター、ルミノコッカス_1、ルミノコッカス科_UCG.014 の相対的な存在量は、オクルディンと劇的な正の相関関係を示しました。 次に、スピアマンの順位相関法により腸内細菌叢と腸管免疫障壁との相関解析を行った（図７）。 私たちは、ローズブリア、ムリバキュラム、ルミノコッカス _1 の増加が CD3 +CD4+ T 細胞の割合と負の相関があることを観察しました。 さらに、有益な細菌であるルミノコッカス_1とルミニクロストリジウム_9の増加はTregの割合と正の相関があり、一方IL-17とは負の相関がありました。 Lactobacillus および Candidatus_Arthromitus の量は IFN-α と負の相関がありました。 ムリバキュラムの存在量とIL-2の間には負の相関関係があった。 カンジダトゥス_サッカリモナスの増加とエシェリヒアの減少。 赤癬菌の存在量はIL-10レベルと正の相関があった(図7)。 相関分析の結果は、hAMSCが宿主の炎症環境を改善し、腸内細菌叢の調節に関連する可能性のある腸の恒常性を調節し、その結果aGVHDを予防することを示した。
図 5 hAMSC は、aGVHD マウスの腸バリア機能不全を改善しました。 (A) 腸に浸潤した GFP 標識 hAMSC。 (B) 腸の H&E 染色 (400 倍) および組織学スコア (組織構造の破壊およびリンパ球浸潤に基づく) (n=4) の代表的な顕微鏡写真。 (C) 腸の免疫組織化学 (400 倍) および CD45 陽性領域の割合 (n=4) の代表的な顕微鏡写真。 (D) 腸の免疫組織化学 (400 倍) および ZO-1 陽性領域 (n=4) の割合の代表的な顕微鏡写真。 (E) ZO-1 およびオクルディン (n=3) の mRNA 発現レベル。 (F) D-LA および DAO の血漿レベル (n=4)。値は平均値±SDとして表示されました。
議論
高度な微生物分析により、宿主と腸内細菌叢の間の複雑な相互作用について新たな洞察が得られました[18]。 腸内細菌叢はアロ HSCT 後に変化する可能性があり、aGVHD と密接に関連していることから、腸内細菌叢が aGVHD 治療の新たな標的となる可能性があることが示唆されています [5]。 私たちの最近の研究を含む多くの研究で、aGVHDに対するMSCの治療効果が調査され、確認されています[15、19、20]。 しかし、この期間中の腸内細菌叢への影響はまだ不明です。 この研究では、aGVHD に対する hAMSC の影響とその潜在的なメカニズムを in vivo で調査しました。 以前の研究[15、21-23]と一致して、我々の結果は、aGVHD症状の軽減と生存期間の延長によって証明されるように、hAMSCがマウスのaGVHDに対して好ましい保護効果を有することを示した。 また、hAMSC が aGVHD における Treg 生成を増強しながらドナー T 細胞の増殖を減少させることにより免疫抑制効果を示すことも実証しました。 一方、hAMSCは、炎症反応を阻害するために、生体内で炎症促進性サイトカインを下方制御し、抗炎症性サイトカインを上方制御することができる。 腸関門は、腸上皮細胞の単層で構成される緻密な構造であり、健康な状態ではその完全性を維持し、管腔微生物叢の転座を防ぎます[24]。 同種HSCT中、前処置療法は腸関門に損傷を与えるが、これはaGVHD発症の初期段階であり、関門を越えた細菌の移動を可能にし、腸管免疫恒常性の破壊につながるためである[24、25]。 蓄積された証拠は、MSCが組織修復能力を持っていることを示しており、これは大腸炎マウスの腸関門の完全性を修復することが証明されている[26]。 ZO-1 やオクルディンなどのタイトジャンクションタンパク質は腸のバリア機能に重要な役割を果たしており、障害のある腸のバリアを越えた腸内細菌叢の転座は炎症を引き起こします [27]。 D-LAは腸内細菌由来であり、DAOは主に腸粘膜に集中します。 したがって、高濃度の血漿 D-LA および DAO は腸管透過性および腸管バリア機能の変化を部分的に反映している可能性があります [28]。 現時点では、hAMSCの投与後、TJの発現レベルが劇的に増加するのに対し、D-LAおよびDAOの血漿レベルは大幅に減少することがわかり、hAMSCが腸管バリア機能不全を改善し、腸管透過性を回復できることが示されました。 腸は、aGVHD によって最も深刻な影響を受ける臓器の 1 つであり、研究により、細菌、特に腸内微生物叢が aGVHD の病因と発症において中心的な役割を果たしていることが明らかになりました [5、6]。 以前の研究で報告されているように、同種HSCT患者の細菌多様性の喪失は、aGVHDによる死亡率の増加と関連していた[29、30]。 日和見病原体である腸球菌やプロテオバクテリアによる糞便の支配も、GVHDの増加と関連している[6、31]。 過去数十年にわたり、腸内細菌叢と炎症性疾患におけるMSC治療との相関関係にますます注目が集まってきました。 MSC は、関節リウマチ、敗血症、炎症性腸疾患の腸内細菌叢の異常を改善することが証明されています [32-34]。 hAMSC が aGVHD を改善するメカニズムをさらに調査するために、腸内細菌叢に対する hAMSC の影響を調査しました。 現在の研究では、hAMSCs 投与は、移植なしと比較して微生物群集の多様性にかなりの効果を示し、hAMSCs 治療後に腸内細菌叢の量が変化する可能性があることを示しています。 しかし、おそらく両方のグループのサンプルサイズが小さかったこと、または hAMSC の治療サイクルが不十分だったため、多様性測定値には有意な差はありませんでした。 属レベルでの比較ヒートマップを使用した分析では、hAMSC の投与により、腸内細菌叢における抗炎症特性を持つ短鎖脂肪酸 (SCFA) 生産者である有益な細菌であるオドリバクターとルミノコッカス_1の存在量が増加することが示されました [35] 、36]。 hAMSCs 移植を介して根底にある優勢な細菌を特定するために、2 つのグループ間で LEfSe 分析を実施しました。 aGVHD グループと比較して、hAMSC 治療は、ラクノスピラ科、ロゼブリア属、ルミノコッカス科、ルミニクロストリジウム属、オシリバクター属、クロストリジウム属など、抗炎症作用に関連するいくつかの有益な微生物の存在量を大幅に増加させました。これらはすべて腸内細菌叢の代謝産物である SCFA の産生に有益であると記載されています。 37–42]。 したがって、我々の観察は、hAMSC投与後、腸内微生物叢のバランス異常が改善され、これは多様性の改善と有益な細菌の相対量の増加によって明らかであることを示しました。
図 6 aGVHD マウスにおける腸内微生物叢の変化。 (A) -多様性の比較。 (B) -多様性の比較。 (C) OTU のベン図。 (D) 門レベルでの相対的な細菌の存在量。 (E) 属レベルでの種の存在量のヒートマップ。 (F) 属レベルでのオドリバクターの相対存在量。 (G) 属レベルでのルミノコッカス_1の相対存在量。 (H) LEfSe 分析に基づく分岐図。 (I) aGVHD グループと hAMSC グループの間で差次的に豊富な特徴から計算された LDA スコア。 (AI) 1 グループあたり n=3 匹のマウス。 値は平均値±SDとして表示されました。
aGVHD は、腸管バリアの完全性の破壊とそれに続く腸内微生物叢とその構成要素の転座によって開始される複雑な炎症過程です。 抗原提示細胞による損傷関連分子パターンおよび病原体関連分子パターンの認識は、T細胞の活性化やサイトカインストームなどの炎症促進反応を誘導し、腸管バリア損傷を悪化させ、aGVHDの発症を促進する[24、43]。 一方、腸内微生物叢およびSCFAなどの微生物叢由来の代謝産物は、腸バリアの完全性と腸の恒常性の維持、粘膜免疫系の形成、微生物成分や代謝産物による宿主防御のバランスをとる上で重要な役割を果たしている[24、44]。 。 腸関門における宿主と腸内微生物叢の間の相互連絡は、粘膜および全身の免疫反応を調節し、病理学的状態では GVHD を引き起こす可能性があります [6、45、46]。 これは、腸内微生物叢がタイトジャンクションタンパク質の発現に密接に関連していることを示唆しています[47]。 本研究は、TJ ZO-1 とオクルディンの mRNA 発現が、有害な細菌の相対量と負の相関を示す一方、有益な細菌とは正の相関を示すことを示し、腸内細菌叢が腸内細菌の完全性を維持するのに重要であることを示しています。腸のバリア。 さらに、腸内微生物叢も腸の免疫バリアを維持するのに非常に重要です[47]。 私たちは、一部の善玉菌は CD3+CD4+T 細胞の割合と負の相関があるが、Treg の割合と正の相関があることを観察しました。 今回、我々は、有益な細菌（主にSCFA産生菌）は炎症促進性サイトカインと負の相関があるが、抗炎症性サイトカインと正の相関がある一方、有害な細菌は逆の相関があることを明らかにした。 要約すると、治療間の腸内微生物叢の有意な違いは、腸内微生物叢と腸の関門である免疫の間の相互作用の全体像を示唆しました。 私たちの実験では、議論する価値のある制限がまだいくつかありました。 第一に、私たちの研究では、aGVHD における免疫、腸バリア、腸内細菌叢に対する hAMSC の影響を調査しましたが、根底にあるメカニズムはさらなる研究でまだ検証される必要があります。 第二に、腸内微生物叢、腸管バリア、免疫間の因果関係に対処するには、腸内微生物叢の枯渇と糞便微生物叢の移植が必要です。 第三に、微生物叢由来の SCFA および他の代謝産物に対する hAMSC の影響を調査するさらなる研究が必要です。 結論として、私たちの研究は、hAMSCが腸内微生物叢の正常化を促進し、腸内微生物叢と腸のバリアである免疫との相互作用を調節することによってaGVHDを軽減することを示唆しました。 私たちの研究は、aGVHDにおける腸内微生物叢と腸管免疫を調節するhAMSCの効果とその根底にあるメカニズムを体系的に定義した最初の研究です。
図7 腸内細菌叢と腸管免疫の相関分析。 スピアマンの相関分析は、2 つのグループ間の 15 の異なる腸内微生物叢の相対存在量 (属レベル) と TJ の mRNA 発現レベル、免疫細胞の割合、および腸内のサイトカインの濃度との間で行われました。 スピアマンの r 値の範囲は -0.5 (青) から 0.5 (赤) です。
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