ヒト TH17 細胞はガスダーミン E 細孔に関与して、NLRP3 インフラマソーム活性化時に IL-1 を放出します

自然免疫応答は記憶などの適応特性を採用できることが示されています。 T 細胞が自然免疫シグナル伝達経路を利用してエフェクター機能のレパートリーを多様化するかどうかは不明です。 ガスダーミン E (GSDME) は、パイロトーシス性細胞死を実行し、潜在的な癌チェックポイントとして機能することが示されている膜孔形成分子です。 本研究では、ヒト T 細胞が GSDME を発現していること、そして驚くべきことに、この発現が持続的な生存能力と関連しており、アラーミン インターロイキン (IL)-1 の放出に再利用されていることを示します。 この特性は、カンジダ アルビカンスに対する特異性を持つヒト ヘルパー 17 型 T 細胞のサブセットに限定されており、T 細胞固有の NLRP3 インフラマソームと、連続するカスパーゼ-8、カスパーゼ{{6}のタンパク質分解カスケードの関与によって制御されています。 }}、および T 細胞受容体刺激後の GSDME 切断およびプロ IL-1 型のカルシウム認可カルパイン成熟。 我々の結果は、T 細胞における GSDME 細孔形成が型破りなサイトカイン放出のメカニズムであることを示しています。 この発見は、T 細胞の機能レパートリーと機構的装置についての理解を多様化し、抗真菌免疫にも影響を及ぼします。

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ヘルパー T 細胞 (TH 細胞) は、異なるサイトカインの分泌を介して抗原特異的なエフェクター応答を実行する重要な細胞です。 特に、ヘルパー 17 型 T 細胞 (TH17 細胞) は、転写因子 RAR 関連オーファン受容体 (ROR) によって制御される、その特徴的なサイトカイン IL-17A の分泌を通じてその抗真菌機能が認識されています。 t1。 それらは自己免疫疾患の発症の主な原因でもあります2。 TH17 つの細胞は機能的不均一性を示すことが以前に認識されています 3。 炎症促進機能または抗炎症機能は、IL-17 とインターフェロン (IFN) または IL-10 のそれぞれ異なる共発現を介して発揮されます 4-7。 全体として、これは TH17 細胞の二元論の概念を形成し、治療用途における 2 つの機能的な TH17 細胞の結果間の二分法を制御するシグナルと分子標的の研究を刺激しました 3,4,8,9。 しかし、TH17 細胞の病原性細胞運命と免疫調節性細胞運命の正体とメカニズムの基礎については、まだ解明されていません。 IL-17産生を超える追加のまだ見つかっていないエフェクター機構も、抗真菌または抗菌の標的特異性を持つTH17細胞で機能する可能性があります。 IL-1 サイトカインは、そのうち IL-1 と IL-1 が最も著名なメンバーであり、重大な炎症作用を及ぼします。 抗原提示細胞（APC）から放出されると、それらは急速な先天性炎症反応を誘導するだけでなく、共通の IL-1R1 受容体への結合による TH17 細胞極性化と T 細胞の病原性を促進することで適応免疫を調整します4,10,11 。 これも以前に記載されている IL-1- 非依存性 TH17 細胞プライミングにより、抗炎症性 TH17 細胞が産生されます 4。 したがって、生来の細胞源からの IL-1 は、抗炎症性 TH17 細胞運命の二分法に対するスイッチ因子として機能します。 他のほとんどのサイトカインとは異なり、IL-1 サイトカインはシグナルペプチドを欠いているため、従来とは異なる小胞体 (ER) とゴルジ非依存性の機構によって分泌されます。

Pro-IL-1 は、細胞外空間に放出され、その受容体が結合する前に、酵素による切断を必要とします。 NLRP3 インフラマソームは、微生物感染と細胞損傷を組み立て、その後のプロ IL-1 切断のためにカスパーゼ -1 を動員する多量体サイトゾルタンパク質複合体です12。 IL-1の出口には、細胞死の炎症性形態であるパイロトーシスと呼ばれるプロセスにおけるカスパーゼ-1-媒介ガスダーミンD（GSDMD）の切断と孔形成も必要です13,14。 一方、IL-1 は、まだ十分に理解されていない規制チェックポイントを通じて、NLRP3 インフラマソームとは独立して処理されると考えられています10。 IL-1 と IL-1 の成熟と放出にはこれらの完全に異なる経路があるにもかかわらず、両方のサイトカインは自然免疫系の細胞によって共同して産生され、未確認のサイトカインの存在を示しています。共同規制ルート。 本研究では、ヒトTH17細胞のサブセットがNLRP3-依存性シグナル伝達カスケードに関与して、炎症誘発性IL-1の自己分泌放出に役立つGSDMEによる膜孔形成を誘導することを示す。 この発見は、ヒト T 細胞によるサイトカイン分泌の型破りな様式を明らかにし、したがって T 細胞の機能および機構のレパートリーを多様化します。

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結果

IL-1の産生はヒトTH細胞の特徴です

ヒト TH17 細胞サブセットの不均一性を調査し、異なる機能とその分子制御を明らかにするために、我々は、次の方法に従って末梢血から ex vivo で単離された活性化ヒト TH17 細胞の単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) を実行しました。ケモカイン受容体表面マーカーの独特の発現15。 均一多様体近似および射影（UMAP）による探索的分析と、すべてのTH17細胞のライデンクラスタリングにより、6つの個別のクラスターが特定されました（図1a）。 IL1A 発現 TH17 細胞の独特で希少な (6%) 集団がクラスター 1 に選択的に濃縮されました (図 1a、b)。 クラスター 1 のすべての遺伝子を他のすべてのクラスターと比較すると、IL1A が大幅に上方制御されていることが明らかになりました (補足表 1)。 IL-1 が T 細胞の標準的なエフェクター サイトカイン レパートリーに属しているとは考えられておらず、代わりに生来の危険シグナルを表していることを考えると、これは予想外でした 16。 ただし、IL1Aはクラスター1の上位の差次的発現遺伝子（DEG）の中に含まれていなかったため、TH17細胞の部分集団におけるその有意な上方制御を明らかにするには、より深い検索戦略が必要でした（補足図1）。 タンパク質レベルでは、TH17 細胞クローンも異なる IL-1 + と IL-1 – T 細胞クローンに分離されており、これにより、細胞内の単一細胞レベルでの IL-1 タンパク質発現の不均一性が裏付けられています。 TH17細胞集団（図1c）。 TH17細胞によるIL1A発現を他の免疫細胞タイプ、特に以前に報告されたIL-1の真正の産生細胞によるIL1A発現と比較するために、ヒト末梢血単核球（PBMC）の複数の公開scRNA-seqデータセットを調査した。 驚くべきことに、これは、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、単球、樹状細胞などの休止期PBMCのさまざまな免疫細胞タイプでのIL1A発現を明らかにしませんでした（補足図2a、b）。 単球であっても、特定のIL1A誘導刺激、特にリポ多糖（LPS）がこれらの細胞に適用されない限り（補足図2c、d）、IL1A産生能力が明らかにされない限り、単一細胞レベルではIL1A発現を示さなかった。およびIL1A発現と進行中の炎症性自然免疫応答との関連（補足図2e）。 興味深いことに、TH17細胞由来のIL1A+およびIL1A-細胞と単球の間の単一細胞トランスクリプトームのDEG比較では、遺伝子共発現（IL1AおよびCCL3）の重複がほとんど示されず、これはT細胞におけるIL1A制御の異なるモードを強く示唆していました。細胞と単球の比較（図1d）。 総合すると、これらの結果は、TH17 細胞サブセット内に IL{54}} 発現細胞の異なる部分集団が存在することを明らかにします。

IL{0}}を産生する TH17 細胞のサブセットは炎症促進性です

ヒト TH17 細胞における IL1A 発現の生理学的関連性を調査するために、scRNA-seq 後の IL1A+ 細胞と IL1A-TH17 細胞の不偏トランスクリプトーム比較を実行しました。 TH17 細胞で IL1A と共発現する遺伝子の遺伝子セット濃縮解析 (GSEA)、および DEG を使用した濃縮解析により、利用可能なすべての遺伝子オントロジー (GO) 用語を公平に調査した結果、IL1A と T 細胞の活性化および増殖との顕著な関連が明らかになりました (図2aおよび補足図3)。 この発見は、T 細胞の新しい状況における老化と細胞死にこれまで割り当てられていた IL-1 の役割に疑問を投げかけました 17。 濃縮分析により、「炎症」に関連するいくつかのGO用語の強い過剰表現も明らかになり、TH17細胞によるIL1A発現が炎症性疾患における役割を持つ病原性T細胞の同一性に寄与していることが示唆されました（図2a）。 この考えは、以前に報告された TH17 細胞機能全体に対する IL-1 の炎症誘発性スイッチ効果 4 と抑制効果を考慮すると、GO 用語「インターロイキンに対する細胞応答-1」の注釈が付けられた遺伝子の上方制御によって裏付けられました。 IL-10 発現における自己分泌 IL-1 の変化（拡張データ図 1a–c）。 すべてのクラスターにわたる IL1A+ 細胞と IL1A- TH17 細胞の直接比較により、IL1A+ TH17 細胞は炎症促進性のサインが大幅に増強されたものの、抗炎症性のサインは低下したことが実証されました (図 2b) 7。さらに、IL1A+ TH17 細胞が豊富なクラスター 1 は、 GSEAによって示されるように、他の5つのクラスターすべてに比べて、炎症促進性が著しく高く、抗炎症性が低いことが示されています（図2b）。 興味深いことに、抗炎症性TH17細胞サブセットと抗炎症性TH17細胞サブセットの一括トランスクリプトーム比較により、IL1Aが炎症性TH17細胞サブセットの中で最も上方制御される遺伝子の1つであることが明らかになった（図2c、dおよび拡張データ図2）。 代わりに、以前の報告によると予想されたように、IL10 は高度に下方制御されていました 4,7。 TH17細胞によるIL-1とIL{51}}の発現のこの相互相関は、フローサイトメトリーによってタンパク質レベルでも観察されました（図2e）。 DEGを用いた濃縮分析により、「関節リウマチ」や「炎症性腸疾患」などの自己免疫疾患のKEGG（京都遺伝子ゲノム百科事典）経路の過剰発現が実証され（図2f）、これはIL1A発現TH17の炎症誘発性の性質を裏付けました。細胞のサブセット。 実際、若年性特発性関節炎 (JIA) に苦しむ患者は、これまでその病因が先天性 IL-1 および IL-1 18 に関連付けられていた小児関節リウマチの高度な炎症性形態であり、19、顕著かつ強力な症状を示しました。健康な対照血液からのIL-17+ TH細胞と比較して、IL-17+ TH細胞によるIL-1の発現が上昇しました（図2g）。 以前に報告されたIFN-とTH17細胞病原性の関連にもかかわらず、対照ドナーの血液と比較して、JIA患者の血液からのIL-17+ TH細胞内ではIFN-増加は観察されなかった（図2g、右パネル）。 4. さらに、血液と一致する滑液の分析では、IL{72} TH 細胞の頻度が非常に高いことが実証され、先天性細胞を超えて、T 細胞も疾患関連 IL の関連細胞源である可能性があることが示唆されました。{{74} ｝ 炎症部位。

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IL-1 の発現は TH17 プログラムによって制御されています

IL-1の発現がT細胞の一般的な特性であるかどうかを調べるために、ケモカイン受容体の発現差に基づいてPBMCから個々のTH細胞サブセットを濃縮し（拡張データ図3）、それらのIL-1を比較しました。分泌。 IL-1はTH17細胞サブセットによって特異的に産生されましたが、TH1細胞サブセット、TH2細胞サブセット、または制御性T細胞（Treg細胞）によっては産生されませんでした（図3a〜c）。 驚くべきことに、抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体による刺激時のその分泌レベルは、LPSおよびナイゲリシンで刺激されたヒト単球の分泌レベルと一致し、ヒトTH17細胞が、その適応免疫のアイデンティティにもかかわらず、危険信号ILの主要な供給源として機能することを示している。 -1 (図 3a)。 細胞内IL-1タンパク質の発現は、新たに単離した休止TH細胞には存在しませんでしたが、T細胞受容体（TCR）の活性化によって誘導され、TH1、TH2、およびTreg細胞が豊富なTH細胞と比較してTH17細胞で有意に濃縮されました（図3b） 、c）。 以前の報告ではマウス T 細胞による IL-1 産生が除外されていたため、これらの発見はヒトの免疫系に特異的であると考えられます 16。 IL-1 と TH17 細胞サブセットとの独特の関連性は、このサイトカインの制御を機構的に分析することを私たちに促しました。 興味深いことに、TH17細胞のマスター転写因子であるROR-tの特異的阻害によりIL-1の発現が減少した（図3d、e）1。これらのデータは、IL-1の推定結合部位の存在と一致しています。 IL1Aプロモーターおよびエンハンサー領域のROR-tおよびROR-（拡張データ図4a、b）。 特定の TH 細胞サブセットの運命は、ナイーブ T 細胞刺激中の明確に分極するサイトカイン微環境によって決定されます。 TH17細胞分極条件（IL -1およびトランスフォーミング成長因子（TGF） - ）におけるナイーブT細胞プライミングでのIL -1の最も高い細胞内発現と分泌を観察しました（図3f、g）。 しかし、IL-1またはTGF-単独による単回処理では、ナイーブT細胞における有意なIL-1発現は起こらず、TH17細胞プライミングサイトカインの組み合わせによるTGFの新規誘導に対する相乗効果が強調された。 IL-1 (補足図4)。 対照的に、TH1 (IL-12) および TH2 (IL-4) 細胞プライミング条件では、極性サイトカインの非存在下での刺激下と比較して、IL-1 分泌は有意に変化しませんでした。 まとめると、これらの発見は、ナイーブ T 細胞が TH17 細胞極性サイトカインを通じて IL-1 を産生する能力を獲得することを示しています。 メモリーTH細胞はまた、IL-1およびTGF微小環境においてIL-1エフェクターサイトカインのさらなる有意な上方制御を示した（図3h）。

図1|ヒト TH17 細胞の異なるサブセットは IL-1 を発現できます。

TH 細胞サブセットの正体は、ケモカイン受容体の発現差に関連する明確な遊走特性によっても特徴付けられます 20。 私たちは、IL-1 の発現が CCR6+ では豊富であるが、CCR6- T 細胞では富化されておらず、CXCR3+ T 細胞と比較して CXCR3- T 細胞では減少していることを観察しました。 CCR4+ と CCR4- T 細胞間の IL-1 発現（図 3i）。 これらのデータは、IL{10}} 産生細胞が、IL{11}}産生細胞に以前に割り当てられた移動パターンを示すことを示しています15。 総合すると、これらのデータは、IL-1 がヒト TH17 細胞の固有の機能であることを一貫して示しています。

図2|IL-1 を産生する TH17 細胞は炎症誘発性です

図3|T細胞によるIL-1の産生はTH17細胞の運命に限定されています

カルパインはTH17細胞によるIL-1分泌の前提条件です

IL-1の分泌メカニズムを調べるために、TH17細胞をタンパク質輸出阻害剤ブレフェルジンA（BFA）で処理したところ、従来のサイトカインとは異なり、IL-1の分泌は影響を受けないことがわかりました。 IL-17A として (拡張データ図 5a–c)。 これは、T細胞によるIL-1分泌のための型破りなER-ゴルジ非依存性経路の存在を裏付けており、先天性細胞型に関する以前の報告と一致しています21,22。 IL-1 に以前割り当てられていたユニークな特性は、細胞質と細胞膜に同時に局在することです 23。 しかし、TH17細胞は単球とは対照的に、膜結合IL-1を示さないことがわかりました（拡張データ図5d）。 生物活性のある細胞外 IL-1 を生成するにはプロ IL-1 の切断が必要ですが、IL-1 は細胞死に受動的に放出され、IL に結合した後にその生物活性の潜在力を発揮することが知られています。 {19}}非切断型または切断型の RI 24. プロIL-1がヒトT細胞による制御放出のための細胞内プロセシングを受けるかどうかを調べるために、活性化TH17細胞の上清中のIL-1の全長および成熟型を評価しました。 分泌されたIL-1の潜在的な供給源として混入した単球を除外するために、2週間かけてTH17細胞クローンを生成し、イムノブロッティングの前にさらに5日間抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体でそれらを再刺激しました。 試験した6つのTH17細胞クローンすべてにおいて、培養上清中に切断型IL-1が優先的に濃縮されていることがわかりました（図4a）。 対照的に、TH17細胞溶解物は、予想どおり、未切断プロIL-1形態の優先的な濃縮を示しました（補足図5a）。 これらの結果は、T 細胞におけるデフォルトの IL-1 出口様式としての細胞壊死時のプロ IL-1 の受動的放出を除外しており、その代わりに、ヒト TH17 細胞がプロ IL-1 のための分子機構を備えている必要があることを示唆しています。 46}} 切断により、生来の細胞とは対照的に、生存可能な T 細胞によるこの強力な生物活性分子の制御された細胞外放出が可能になります（補足図 5b）。 ただし、これは、IL-1の生物活性プロフォームの遊離に対するT細胞壊死のさらなる寄与を排除するものではありません（補足図5a）。 異なる切断部位での Pro-IL-1 プロセシングは、いくつかのプロテアーゼによって触媒される可能性があります 17、25、26。 カルパインは、本明細書で同定した成熟IL-1 p17フラグメント26を生じさせることができるカルシウム依存性システインプロテアーゼです。 TH17細胞でカルパイン活性を検出しました。 抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体で活性化すると増加しました（図4b）。 薬理学的カルパイン阻害により、活性化されたTH17細胞による細胞外空間へのIL-1分泌が用量依存的に減少したため、TH17細胞によるIL-1分泌はT細胞固有のカルパイン活性に依存していました（図4c） 。 同様に、カルパイン阻害により、プロIL-1の細胞内蓄積が生じた(図4d)。 IL-1分泌のカルパインへの依存性を裏付けるために、クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復配列（CRISPR）-Cas9を使用して、ヒトTH17細胞のカルパインを遺伝的にノックアウトしました。 これにより、ヒトTH17細胞によるIL-1分泌におけるCAPN1ではなくCAPN2の役割が明らかになりました（図4e）。 対照的に、単球によるLPS/ナイゲリシン誘導性IL-1分泌はカルパインに依存しませんでした（図4f）。 これらのデータは、逆のカルパイン遺伝子発現パターンを示した樹状細胞とは対照的に、ヒトT細胞サブセットによるCAPN1ではなくCAPN2の優先的発現と一致しました（補足図6）。 TH17細胞におけるIL-1分泌は、細胞内カルシウムの蓄積とタプシガルギンによるサルコ-/ER Ca2+ATPアーゼの阻害により増加し（図4g）、（エチレンビス（オキシ窒化物）による細胞外カルシウムキレート化により減少しました） ）四酢酸（EGTA）（図4h）、カルパインのカルシウム依存性機能およびTCR依存性IL-1分泌と一致しています26。 これらのデータを総合すると、カルシウム依存性プロテアーゼ カルパインのタンパク質分解活性が、TCR 活性化ヒト TH17 細胞による型破りな IL{103}} 分泌の前提条件であることが実証されました。

TH17 細胞による IL-1 分泌は、NLRP3 インフラマソーム活性化によって調節されます

プロIL-1の成熟におけるカルパインの重要な役割にもかかわらず、切断されたIL-1の細胞外脱出につながるメカニズムは不明のままであったため、次に対処する必要がありました。 骨髄細胞による細胞外IL-1の放出は、NLRP3インフラマソームの活性化、カスパーゼ-1の非酵素活性、およびIL-1 16の放出と以前から関連していた27。 我々は、ヒトTH17細胞がNLRP3インフラマソームの分子足場を持っているかどうかをテストし、ヒトTH17細胞においてNLRP3およびアダプター分子であるCARD（ASC）を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質のタンパク質発現を発見した（拡張データ図6a、 b）。 我々は、ImageStream技術を使用したASCスペックの同定により、TCR活性化TH17細胞における進行中のインフラマソーム活性化を観察した（図5a、b）28、29。 驚くべきことに、ASCスペックの頻度の増加は、TH17細胞サブセットに独特に限定されていました（図5b、左）。 TH17細胞は、LPSおよびATPで刺激されたマクロファージのASCスペック形成にさえ近似しました（図5b、右）。 対照的に、TH1およびTH2細胞サブセットは、バックグラウンドのASCスペックレベルを表示しました（図5b、左）。 さらに、ASCスペックおよびNLRP3-スペックの形成は、特異的なNLRP3インフラマソーム阻害剤MCC950の存在下で完全に抑制され、TH17細胞における進行中のNLRP3インフラマソーム活性化の存在を実証しました（図5b、左および拡張データ図）。 6c)。 TH17細胞によるNLRP3インフラマソームの選択的関与は、TH17細胞極性サイトカインIL-1およびTGF-の存在下でのT細胞刺激に対するNLRP3転写物の強力な誘導によってさらに裏付けられました（図5c）。 重要なことに、TH17細胞によるIL-1分泌は、MCC950によるNLRP3インフラマソームの特異的阻害によって大幅に減少したため（図5d）、したがって、TH17細胞によるIL-1の分泌におけるNLRP3インフラマソームの重要な役割が実証されました。ヒトTH17細胞。 カスパーゼ-1は、NLRP3 インフラマソーム複合体の標準的なエフェクタータンパク質です30。 活性化されたヒトTH17細胞におけるプロカスパーゼ-1の発現を観察しました（図5e）。 しかし、LPSおよびナイゲリシンで刺激された単球での所見とは対照的に、ヒトTH17細胞溶解物では切断されたカスパーゼ-1は検出されませんでした（図5e）。 この観察は、IL-1促進サイトカイン刺激の存在下または非存在下で刺激されたTH17細胞にカスパーゼ-1 FLICA染色が存在しないことによって裏付けられました（拡張データ図7a-e）。 さらに、抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体でTH17細胞を5日間刺激した後、ELISAによってカスパーゼ-1の細胞外放出を除外しました（図5f）。 IL-1刺激IL-1の存在下でも、カスパーゼ-1分泌は誘導されず、休止単球と同じくらい低いままでした（図5f）。 Ac-YVAD-CMKによるカスパーゼ-1の薬理学的阻害は、IL-1によるIL-1誘導の有無にかかわらず、IL-1分泌を減少させなかった。 むしろ、カスパーゼ-1阻害によりIL-1分泌がわずかに上昇することが観察されました（補足図7a、b）。 重要なことに、TH17細胞は、CRISPR-Cas9-操作によるCASP1発現の枯渇においてIL-1分泌の変化を示さなかった（図5g）。 生物活性カスパーゼ-1の欠如と一致して、ヒトTH17細胞によるIL-1の分泌は観察されませんでした。 これは、LPS と ATP による刺激でカスパーゼ{100}依存性の IL{101} 分泌が示された単球の場合とは対照的でした（拡張データ図 7f）。 さらに、細胞内 IL{103}} は、TH17 細胞または TH17 細胞クローンの IL{104}} 極性化サイトカインによって検出または誘導できず、また、活性化 TH17 細胞では scRNA-seq 解析によって検出できませんでした（拡張データ図 7g、h、私）。 これは、単細胞レベルでIL-1とIL-1を共発現する単球の所見とは対照的であり、以前に示唆された両方のIL-1の分泌および推定上の共調節パターンと一致しました。サイトカイン (拡張データ図 7g)16,27。 累積的に、これらのデータは、NLRP3 インフラマソームの明らかな関与にもかかわらず、単球やおそらく他の自然免疫細胞とは異なり、ヒト TH17 細胞がカスパーゼ-1 および IL-1 とは独立して IL-1 を産生することを示しています。

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IL-1a は GSDME 細孔を介して TH17 細胞を出る

ガスダーミンは、炎症性メディエーターの放出を可能にする最近同定された孔形成エフェクター分子のファミリーに属しています 31。 我々のトランスクリプトーム分析により、炎症誘発性IL-1 -刺激を受けたTH17細胞サブセットにおけるGSDME発現の選択的上方制御が明らかになりましたが、ガストリンファミリーの他のメンバーは制御されないことが明らかになりました（図6a）。 GSDME 発現が初代 T 細胞でこれまで報告されたことがなかったことを考えると、これは驚くべきことでした。 対照的に、NLRP3 インフラマソームによって制御され、カスパーゼ-1の標的であることが知られているGSMDDは上方制御されず、非標準的なNLRP3インフラマソームシグナル伝達の考えを裏付けています。 GSDME は、自然免疫細胞に膜孔を形成し、アラーミンを細胞外に放出するための導管として機能し、GSDMD32 と同様にパイロトーシス性細胞死を開始する可能性があることが以前に示されています。 GSDME と TH17 細胞サブセットの関連をテストするために、TH17 細胞分極サイトカインが GSDME を共調節するかどうかを評価しました。 TGF- と IL-1 (TH17) の組み合わせのみが、IL-12 (TH1) または IL-4 (TH2) ではなく、逆転写定量的評価で GSDME 転写レベルを増加させました。 PCR (RT-qPCR) (図 6b)。 これは、GSDMEのプロモーター領域にTH17細胞関連転写因子ROR-およびBATF（塩基性ロイシンジッパー転写因子、ATF様）の推定結合部位が存在することによって裏付けられた（拡張データ図8a、b）33。 対照的に、GSMDD発現はT細胞分極サイトカインによって調節されませんでした（補足図8）。 この結果により、我々はヒト TH17 細胞における GSDME 発現をタンパク質レベルで評価するようになりました。 GSDME プロフォームは、TCR 活性化で誘導可能でした。 この適応免疫シグナルに応答したGSDMEタンパク質の誘導は予想外でしたが、GSDMEプロモーター領域におけるNFAT、FOS、JUN、RELAなどのTCRシグナル伝達応答性転写因子の推定結合部位の存在によってさらに裏付けられました（拡張データ図8a）。 、b）。 GSDME は、ポリクローナル刺激後 24 時間という早さで発現されました。 切断されたN末端細孔形成GSDMEは、TH17細胞のTCR刺激から3〜4日後の遅い時点で検出可能でした（図6c）。 全長 GSDMD は T 細胞活性化と同時に誘導されました。 対照的に、カスパーゼ-1およびIL-1分泌の欠如から予測されるように、GSDMD切断は観察されず、TH17細胞におけるGSMDDの役割はさらなる分析の余地がある（図6c）。 次に、GSDME細孔がTH17細胞におけるIL-1の細胞外放出の導管として機能するかどうかを調査することを目的としました。 したがって、CRISPR-Cas9テクノロジーでGSDMEをノックアウトし、ELISAによって上清へのIL-1の放出を経時的に監視しました。 GSDMDではなくGSDMEの不在は、TH17細胞によるIL-1の放出を有意に阻害した（図6d）。 これは、GSDME 細孔形成がヒト TH17 細胞による型破りな IL-1 放出のメカニズムとして機能することを明確に示しています。

図4|カルパインは、ヒト TH17 細胞による切断された IL-1 の放出の前提条件です

図5|型破りなNLRP3インフラマソーム活性化がヒトTH17細胞によるIL-1産生を調節する

カスパーゼ-8/3 GSDME 切断カスケードにより、NLRP3-依存性の IL-1 分泌が可能になります

次に、ヒトTH17細胞におけるNLRP3インフラマソーム活性化とGSDME切断の間の機構的クロストークの可能性を調査しました。 カスパーゼ-3は最近、GSDMEを切断することが示されており、これはNLRP3インフラマソーム相互作用物質であるカスパーゼ-8の標的となっている（参考文献34、35）。 実際、プロカスパーゼ-8とプロカスパーゼ-3の両方がTH17細胞で検出されました。 両方のカスパーゼの切断がTCR刺激時に発生し、GSDME切断に先行することがわかりました（図6e）。 対照的に、ナイゲリシンおよびLPSで刺激された単球では、カスパーゼ-8およびカスパーゼ-3の切断産物は検出されませんでした（図6e）。 T細胞によるGSDMEの切断とIL-1の分泌におけるこれらのカスパーゼの原因となる役割を確立するために、阻害剤Z-DEVDでカスパーゼ-3またはカスパーゼ-8の活性を薬理学的にブロックしました。それぞれ -FMK または Z-IETD-FMK。 Z-IETD-FMKによるカスパーゼ-8活性の阻害は、他の細胞型に関する以前の報告と一致して、下流の標的カスパーゼ-3の切断を無効にした36。 どちらの処理もGSDME切断を減少させながら、IL-1の分泌も抑制しました（図6f–iおよび拡張データ図9a、b）。 代わりに、カスパーゼ-1の阻害は、カスパーゼ-3またはGSDME切断には影響しませんでした（補足図9）。 これらのデータは、カスパーゼ-8-カスパーゼ-3-GSDME軸がTCR活性化時にヒトTH17細胞で機能しており、それがこれらの細胞におけるIL-1分泌を調節していることを明確に示した。 最終的にこのタンパク質分解切断カスケードとNLRP3インフラマソームとの関連を確立するために、刺激されたTH17細胞にMCC950を適用しました。これにより、実際、5日目にカスパーゼ-3とGSDME切断が大幅に減少しました（図6f、g）および拡張データ図9c)。 ただし、カスパーゼ-8切断の減少は、分析の同じ時点ではそれほど顕著ではなく、これは初期の活性化時間枠と一致していました（図6e、f）。 要約すると、個々の分子プレーヤーの標的阻害により、ヒトによる生物活性IL-1の細胞外放出に関与するタンパク質分解経路として、NLRP3インフラマソーム-カスパーゼ-8-カスパーゼ-3-GSDMEカスケードが確立された。 TH17細胞。

図6|NLRP3-casp8/3 切断カスケードは、IL-1 放出のための GSDME 細孔を引き起こす

TH17 細胞は GSDME 細孔にもかかわらずパイロトーシスに対して回復力があります

ガスダーミン細孔の形成は、さまざまな細胞型におけるパイロトーシス性の細胞死に関連していることが以前に報告されています 13、14、37。 我々は、細胞膜では切断された細孔形成N-GSDMEユニットの発現を発見したが、サイトゾルでは発現していないことを発見し、これがT細胞におけるGSDMEの細孔形成機能を裏付けた（図7a）。 驚くべきことに、GSEAによるGSDME無傷細胞とCRISPR-Cas9遺伝子編集GSDME欠損バルクヒトTH17細胞のトランスクリプトーム比較では、さまざまな形態の細胞死における差異が排除された。 ただし、注目すべきことに、GSDME欠損TH17細胞の影響を受けたプロセスと経路は、N-GSDMEによって形成される孔形成導管と一致して、主に膜貫通輸送を制御する遺伝子に関連していることが明らかになりました（図7bおよび補足図10）。 。 GSDME発現の存在と非存在に関して選択された個々のTH17細胞の単一細胞トランスクリプトーム比較は、増殖のための遺伝子セットの濃縮によりGSDME発現TH17細胞の生存率を裏付けました（図7c）。 私たちは最終的に、CRISPR-Cas9 遺伝子編集された、GSDME 欠損および GSDME が完全な TH17 細胞における TCR 刺激時の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) 放出に差がないことを実証することで、パイロトーシスに対するヒト GSDME 発現 TH17 細胞の回復力を検証しました（図.7d）。 次に、IL-1 + と IL-1 – TH17 細胞を生存率と増殖能に関して比較しました。TH17 細胞は、IL{{36 とは対照的に、IL-1 表面発現を示さなかったためです。 }}単球などの他の細胞系統の細胞を生成します（拡張データ図 5d）。 IL-1 + と IL-1 – TH17 細胞のこの比較には、自家製の IL-1 - 分泌アッセイの確立が必要で、分泌された細胞を捕捉することで IL-1 + - 生存可能な TH17 細胞を単離することができました。ホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸塩（PMA）とイオノマイシン刺激後に細胞表面に自己分泌IL-1を放出します。 表面IL-1の有無について選別した後、単一細胞として寄託されたTH17細胞のクローニング効率に差は観察されなかった（補足図11）。 この発見は、単細胞レベルでのIL-1 +およびIL-1 – TH17細胞の生存率と増殖における差異を除外しました。 さらに、さまざまな程度の細胞内IL-1発現に基づいてスクリーニングされたTH17クローンを再クローニングし、それぞれのクローニング効率をモニタリングしました。 GSDME による IL-1 放出がパイロトーシス性細胞死と関連している場合、T 細胞クローンにおける IL-1 発現と個々の再クローニングでの増殖クローンの頻度 (クローニング効率) の間には逆相関が見られます。予想された。 しかし、T 細胞の再クローニング効率は、TH17 細胞クローンにおける IL-1 の発現レベルとは無関係であり、代わりに、IFN-α の非存在下での IFN-α のさまざまな発現レベルに基づいて選択されたコントロール T 細胞クローンの効率と同様でした。 IL-1の共発現（図7e）。 重要なことに、IL-1 + TH17細胞クローンは、反復的なTCR再刺激サイクルでIL-1を再発現し続けました（図7f）。 したがって、再刺激時のそれぞれのクローン T 細胞集団からの IL{70} 産生細胞の細胞死に関連した損失は除外されました。 注目すべきことに、この発見は、誘導性IL-1に対するT細胞サイトカイン記憶を示している。 バルクIL-1 +とIL-1 – TH17細胞の間でトランスクリプトームの比較を実行し、IL-1 – TH17細胞と比較してIL-1 +の増殖遺伝子セットがさらに豊富であることを観察しました。クローン(図7g)。 IL1A+ 細胞と IL1A-TH17 細胞の単一細胞トランスクリプトームの比較により、増殖のトランスクリプトームの濃縮が裏付けられました。 これは、IL1A発現TH17細胞および炎症サインが豊富なライデンクラスター1と他のすべてのクラスターとの比較にも当てはまりました（図7h）。 フローサイトメトリー分析によると、IL-1 + TH17 細胞は、5 日間のポリクローナル刺激後の IL-1 - 対応する細胞よりも高い Ki67 発現を示しました (図 7i)。これは、ヒト TH17 細胞では IL{ {96}} の出口は、生来の細胞とは異なり、細胞死に関連しません。 累積的に、これらのデータは、単細胞レベルであってもIL-1産生と（パイロトーシス性）細胞死との関連性を排除し、ヒトT細胞が反復的なTCR再刺激によるIL-1産生のためのサイトカイン記憶を持っていることを実証している。 。

T 細胞由来の IL-1 は抗真菌による宿主防御に寄与します

ヒト TH17 細胞が先天性危険信号 IL-1 を生成し、その細胞外放出のために先天性シグナル伝達機構を再利用するという我々の発見は、適応免疫応答と自然免疫応答の区別を曖昧にし、したがって T 細胞の全体的な機能レパートリーを拡張します。 適応記憶応答の特徴として残っている重要な特徴は、TCR によって与えられた抗原特異性です。 したがって、我々は、ヒト TH17 細胞の IL-1 産生能力が特定の抗原特異性に限定されているかどうかを調査しました。 TH17 細胞は、C. アルビカンスおよび黄色ブドウ球菌抗原に特異的な細胞内に高度に濃縮されていることが以前に示されています 15。 興味深いことに、黄色ブドウ球菌特異的TH17細胞クローンよりもカンジダ・アルビカンス特異的によるIL-1の発現および分泌が有意に大きいことが観察された（図8a）。 次に、黄色ブドウ球菌ではなくカンジダ・アルビカンスを認識するナイーブT細胞が、その同族抗原によって刺激されてIL-1を選択的に産生するかどうかを調べた。 ナイーブ (CD45RA+ CCR7+ ) TH 細胞を、熱不活化 C. albicans または S. aureus 抗原でパルスするか、抗 CD3 および抗 CD28 モノクローナル抗体でポリクローナル刺激した自己単球と共培養し、7 日目にクローン化しました。同種異系フィーダー細胞を使用します。 １４日目に、上清のＥＬＩＳＡのために、すべてのクローンを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で５日間再刺激した。 驚くべきことに、我々は、ヒト分化中のTH17細胞において、C. albicansがde novo IL-1産生を誘導するが、黄色ブドウ球菌やポリクローナルTCR活性化は誘導しないことを発見した（図8b）。 したがって、エクスビボリコールとインビトロプライミングアプローチを組み合わせた本発明者らは、IL-1を産生する能力がカンジダ・アルビカンスに対するTCR特異性を有するT細胞に限定されることを確立する。 私たちは最終的に、C. albicans 特異的 TH17 細胞の IL-1 を産生する特有の能力が抗真菌宿主防御における生理学的役割と関連しているかどうかをテストしました。 このために、抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体によるポリクローナル再刺激後のヒト単球をヒトTH17細胞からの上清と5日間共培養しました。 フローサイトメトリーを使用して、単球によるFITC標識C. albicansの食作用の大幅な増加を観察しました。 重要なことに、TH17細胞上清によるC. albicansの食作用の増加はIL-1に依存しており、これは免疫吸着またはCRISPR-Cas後にTH17細胞上清にIL-1が欠如している場合、C. albicansの食作用が大幅に抑制されることで示されています。 {46}}はTH17細胞におけるIL-1の枯渇を標的とした（図8c）。 生細胞のインビトロイメージングにより、TH17細胞上清を含むIL-1 -の存在下で単球によるカンジダ・アルビカンスの取り込みと除去が増加することがさらに裏付けられました（図8d、ビデオデータ）。 総合すると、これらの発見は、TH17 細胞が、これまで考えられていたように IL-17 の産生を介してだけでなく、かなりの程度まで、独自の TH17 細胞サブセットの能力によって C. albicans 感染を除去することを強く示唆しています。 IL-1 を生成します。 累積的に、炎症誘発性IL-1の出口戦略としてT細胞におけるGSDME細孔形成を特定する発見と、NLRP3インフラマソーム-カスパーゼ-8-カスパーゼ-3軸によるGSDMEの調節を特定する新たな知見が明らかになった。抗真菌性 TCR 特異性を持つ TH17 細胞の炎症誘発性サブセットに関連する T 細胞サイトカイン分泌様式。 これは、抗真菌による宿主防御に関連し、慢性炎症性疾患の発症にも関与する可能性があるヒト TH17 細胞を調節するための新しい治療標的を提供します。

カンクサ-免疫システムを改善する

議論

要約すると、我々の発見は、T細胞集団の全体的な機能を多様化するヒトT細胞におけるこれまで知られていなかった生物学的経路とサイトカイン分泌様式を明らかにした。 われわれは、IL-1 の発現が、IL-17A との共発現、ROR-t による制御、TH17 細胞プライミングサイトカイン IL{{ 6}} と TGF-、およびその TH17 細胞関連ケモカイン受容体の発現プロファイルによる。 これらの所見は、本研究で記載されている IL1A エンハンサーおよびプロモーター領域における ROR-t および ROR- の結合部位の存在、および以前に報告された NLRP3 プロモーター領域における ROR-t 結合部位と一致します 39。 さらに、TH17 細胞プライミング サイトカインが NLRP3 および GSDME の発現を増加させることも観察しました。 したがって、ROR および BATF などの TH17 細胞運命のマスター調節因子、および複数の TCR 誘導性転写因子は、GSDME エンハンサー領域に推定上の結合部位を示しました。 したがって、TH17細胞分極は、IL-1発現だけでなく、その細胞外排出も促進した（拡張データ図10、グラフの概要）。 予想外なことに、NLRP3 インフラマソームが活性であり、TCR 活性化 TH17 細胞において IL-1 ではなく IL-1 を放出するために再利用されることがわかりました。 先天性細胞とは異なり、T 細胞は、NLRP3 インフラマソーム構成要素の集合を引き起こすことが知られている先天性危険感知に特化していません。 しかし、細胞質 Ca2+ の上昇は、NLRP3 インフラマソーム活性化のための生来の危険シグナル伝達を回避することが以前に示されています 16,40。 これは、カルシウム流動を伴うTCR活性化がヒトTH17細胞によるIL-1放出の要件であるという我々の発見と一致している。 私たちは、TH17 細胞がカスパーゼ -8 の関与を介して、別の NLRP3 下流シグナル伝達カスケードに関与していることを観察しました。 これは、カスパーゼ-1の切断が存在しないことで促進された可能性があります。これは、カスパーゼ-1とカスパーゼ-8のインフラマソーム動員が競合することが以前に実証されているためです34,41。 また、ヒト TH17 細胞ではプロカスパーゼ -1 と未切断の GSDMD も見つかりましたが、それらの NLRP3 インフラマソーム制御による切断や IL-1 産生の証拠はありませんでした。 それらの前駆体の発現は、まだ同定されていない代替刺激が適用された場合、古典的なNLRP3インフラマソームシグナル伝達とIL-1放出がヒトTH17細胞でも機能するのではないかという疑問を提起する。 これは、カスパーゼ-8-対カスパーゼ-1-に依存する逆調節機構が、T細胞によるIL-1対IL{61}}産生の二項対立を制御し、これまで示唆されていたNLRP3インフラマソームの役割を統合する可能性があることを示唆しているヒトTH1細胞42およびマウスTH17細胞43におけるIL-1の放出における。 私たちの研究の興味深い観察は、T 細胞における GSDME の発現と切断の同定でした。 これにより、膜孔を介した従来とは異なるサイトカイン分泌が T 細胞で起こり得ることが明らかになりました。 GSDME に最近割り当てられた機能のいくつかは、ピロトーシスとその後の腫瘍細胞死の促進および炎症性微小環境に関連しています 32,44。 驚くべきことに、我々は、GSDME欠損T細胞と比較して、GSDME発現TH17細胞が反復TCR刺激により保存された生存率と継続的な増殖を示すことを発見した。 IL-1 – T細胞と比較して、IL-1 +でも同じ結果が観察されました。 これまでIL-1の産生が老化の特徴、つまり複製が停止した細胞または死にかけている細胞の特徴であると考えられていたことを考えると、これらの発見は予想外であった45。 これは、危険信号 IL-1 が、同族抗原認識時に再興奮可能な T 細胞関連サイトカイン記憶の一部である可能性があるという考えを呼び起こします 46。 さらに、GSDME 細孔は、TH17 細胞が、そのサイズや電荷によって定義される IL-1 を超えて、まだ同定されていない追加の分子を放出できるようにする生理学的機能を果たしている可能性があります 47。 これは、GSDMEが完全であるか、またはCRISPR-Cas{88}}で改変されたGSDME欠損TH17細胞の公平なトランスクリプトーム比較の結果と一致しており、細胞死ではなく膜貫通輸送におけるGSDMEの複数の役割が明らかになった。 GSDME細孔を持つT細胞の生存能力と長期IL{92}}サイトカイン記憶が維持されるメカニズムは、今後も研究されるべきである。 さまざまな細胞源、特に先天性 APC からの IL-1 の入手可能性は、ヒトの健康と病気に対する T 細胞由来の IL-1 の相対的な寄与について疑問を引き起こします。 IL-1 + T細胞はT細胞系統内の小さなサブセットにすぎませんが、IL-1を産生する能力は定量的にはLPS刺激単球の能力に匹敵し、T細胞が機能できるという新しい概念を裏付けています炎症性ILの関連源として-1 . トランスクリプトーム解析および機能解析から得られた発見により、IL{100}} が TH17 細胞の炎症誘発性運命に関連していることが明らかになりました。 ヒト TH17 細胞の IL{102}} 部分集団は、炎症性病原性の増強と慢性炎症性疾患との関連性のトランスクリプトーム サインを示しました。 JIA 患者の循環 TH17 細胞による IL{104}} の発現の大幅な増強と、炎症を起こした滑液内での IL{106}} の局在の多さは、TH17 細胞の IL{106}} サブセットの病原性の可能性を裏付けています。 IL 産生 TH17 細胞と JIA の発症との厳密な因果関係はまだ確立されておらず、IL{108}} TH17 細胞の相対的な影響は今後の臨床試験で検証されます。 印象的な観察は、T細胞によるIL-1産生がTCR特異性を通じて配線されているということでした。 生来の細胞源による IL-1 産生は非特異的ストレス刺激によって引き起こされますが 16、ヒト TH17 細胞による IL-1 産生は C. albicans に対する TCR 特異性と関連していることがわかりました。 代わりに、黄色ブドウ球菌特異的 TH17 細胞は、IL-1 産生の大幅な減少を示しました。 これらの所見は、以前に報告されたように、C. albicans に特異的な TH17 細胞ではなく、黄色ブドウ球菌に特異的な TH17 細胞の生成における IL-1 の異なる要件と一致しており、したがって IL の重要な役割とも一致しています。{{126}ここで報告されているように、IL-1 発現の誘導には } が使用されます。 さらに、IL-1の分泌がTCR刺激とカルシウムシグナルに依存していることを発見し、TCRを介した特異的な適応免疫シグナル伝達との密接な関連性を強調しました。 TH17 細胞は、IL-17 の分泌を介して C. アルビカンス感染症の排除の主役であることが知られており、これは遺伝的または治療的 IL-17 欠損症における C. アルビカンス腸内細菌叢の異常によって例示されます 38。 TH17 細胞産物 IL-1 が C. albicans のクリアランスに関与していることを発見しました。これは、TH17 細胞上清中に IL が存在しないと、単球による C. albicans の食作用が大幅に減少するためです。 これは、抗真菌性 TH17 細胞エフェクター機能が、以前に示唆されているように IL{137}}A/F を通じてだけでなく、TCR 特異的な様式で IL{138}} を通じても発揮されることを示唆しています。 したがって、TH17細胞によるIL-1産生につながる分子経路の異常な制御が抗真菌による宿主防御の低下を引き起こしやすいかどうかは、今後テストする必要があるだろう。 累積的に、私たちの発見は、さまざまな炎症性疾患や抗真菌による宿主防御における IL 産生 TH17 細胞の寄与に関する体系的な研究への道を切り開きます。{142}} TCR-NLRP3 インフラマソーム-カスパーゼ-8-カスパーゼ-3-GSDME 軸は、TH 細胞における免疫シグナル伝達と運命指示のこれまで見過ごされてきたモードを表すだけでなく、病原性 TH17 細胞を破壊するための分子標的も提供しますID を取得したり、ホスト防御に利用したりできます。

図7|TH17 細胞は、GSDME 原形質膜孔にもかかわらず、ピロトーシスに対して回復力があります。

図8|TCR特異性はIL-1産生を制御し、カンジダ・アルビカンス除去に寄与する

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