イホスファミド毒性の調査は肝臓と腎臓に共通の上流調節因子を誘発する
Feb 28, 2022
ハン・ヒョンユン他
概要：
イホスファミドは、シクロホスファミドの合成類似体であるアルキル化剤であり、さまざまな固形がんの治療に使用されます。 この研究では、Good Laboratory Practiceガイドラインに基づいて、ラットに単回および複数回の腹腔内投与を使用してイホスファミドの毒性を評価し、追加のマイクロアレイ実験を行って毒物学的所見を裏付けました。 イホスファミドの単回投与（50 mg / kg）は、病理学的変化を誘発しませんでした。 一方、7日および28日連続投与群で重度の腎毒性が観察され、血中尿素窒素およびクレアチニンレベルが有意に上昇しました。 トックスリスト分析では、コレステロール合成関連遺伝子は主に肝臓で影響を受け、腎不全関連遺伝子は肝臓で影響を受けました。肝臓イホスファミド投与後。 さらに、インターフェロン調節因子7が、両方で変化した主要な上流調節因子として選択されました。肝臓と肝臓、およびユビキチン特異的ペプチダーゼ18、2を含むラジカルS-アデノシルメチオニンドメイン、およびインターフェロン刺激遺伝子15などの他の標的遺伝子と相互作用することが見出され、リアルタイムRT-PCR分析によってさらに確認されました。 結論として、腎臓に偏ったイホスファミド臓器毒性を再確認し、両方で同じように変化した遺伝子を特定しました。肝臓と肝臓。 イホスファミド誘発遺伝子と臓器毒性との正確な関係を明らかにするには、さらに包括的な毒性ゲノム研究が必要です。
キーワード：イホスファミド; 肝毒性; 腎毒性; 腹腔内毒性
1.はじめに
イホスファミドは、シクロホスファミドの合成類似体であるアルキル化剤であり、肉腫やリンパ腫などのさまざまな固形がんの治療に使用されます。 イホスファミドは、DNA複製とRNA産生を妨げる細胞周期非特異的抗がん剤です[1]。 イホスファミドは他の有毒なアルキル化剤と比較して比較的忍容性が高いですが、その臨床使用を制限する多くの生命を脅かす副作用と関連していることが知られています[2]。 イホスファミドの主な副作用には、急性を含むイホスファミドからの反応性毒性種に起因する重度の腎障害が含まれます肝臓 けが、間質性腎炎、出血性膀胱炎、およびファンコニ症候群[3]。 診療所では、初期の腎毒性を経験し、高用量のイフォスファミドによって誘発された1つの臓器不全を繰り返し、その後の臓器不全を引き起こした患者で、重度の多臓器毒性が報告されました[4,5]。
イホスファミド、アクロレイン、およびクロロアセトアルデヒドの毒性代謝物は、イホスファミド臓器毒性の主な原因因子です。 以前の研究は、主にイホスファミドの毒性代謝物、特にシトクロムP450（CYP）への変換に影響を与える要因に焦点を合わせていました[6]。 腎臓に比較的豊富なCYP3A4とCYP3A5は、イホスファミドの毒性変化を引き起こし、腎毒性を誘発します[7]。 アクロレインは、細胞内の反応性酸化遺伝子経路を活性化し、細胞小器官に損傷を与える可能性のある反応性の高いアルデヒドです。 クロロアセトアルデヒドは、ミトコンドリアの呼吸鎖における複合体Iの活性化の抑制を報告しました。これは、細胞内グルタチオン（GSH）の枯渇と細胞死につながる可能性があります[8]。
多臓器毒性研究は、毒性研究の特定の臓器を対象とするよりも、薬物の全身的影響を理解するのに役立ちます。 肝臓と腎臓は薬物の代謝と排泄に関与する主要な臓器であり、これらの主要な臓器は副作用の素因があります。 多くの場合、臓器毒性が続きます。 さらに、統合的な毒物学的評価は、システム内の薬物誘発毒性を理解および予測するのに役立つ可能性のあるさまざまな病理学的所見を提示する可能性があります。
多くの研究では、遺伝子発現プロファイルを使用して、化学物質の潜在的な悪影響を予測しています。 しかし、ほとんどの初期の研究は、限られた病理学的症状のみで、単一標的臓器毒性の評価に焦点を合わせていました[9]。 さらに、マイクロアレイベースの遺伝子プロファイリングと組み合わせることで、潜在的な薬物関連の毒性を防ぐことができる毒性の包括的なシステムレベルの理解が得られます[10]。 この点に関して、遺伝子発現プロファイリングを用いた統合的多臓器毒性学的アプローチは、システム内の薬物の毒性メカニズムを理解するには不十分な単一臓器毒性評価から得られた毒性データを克服するための毒性予測モデル研究で使用されてきました[11]。
この研究では、イホスファミドの毒性について説明します。肝臓と肝臓Sprague–Dawley（SD）ラットでの急性および反復暴露後。 肝臓と肝臓の両方でイホスファミドによって変化した共通の標的遺伝子を明らかにするために、支持的な遺伝子発現プロファイリングアッセイを実施しました。肝臓、統合的イホスファミド毒性への洞察を示唆している。
2.結果
2.1。 単回投与毒性試験
12.5、25、および50 mg / kgのイホスファミド群では毒性は観察されませんでした。死亡、毒性症状、体重変化、または組織病理学的所見は観察されませんでした。
一方、血液学研究では、網状赤血球（RET）の相対数と、好中球（NEUA）およびリンパ球（LYMA）の絶対数が用量依存的に減少しました。
2.2。 1週間の反復投与毒性試験
イホスファミド投与1週間後に全体の体重が減少し、100mg/kg群の体重減少の平均値は75mg/kg群よりも高かった（表1）。 一方、相対臓器重量は、イホスファミド投与群で徐々に増加しました（表2）。
イホスファミドIPを1週間連続投与すると、RBC、HGB、HCT、MCV、PLTなどの血液学的指標が用量依存的に抑制されました（表3）。 さらに、BUNとCREAは、イホスファミド群と比較した場合、対照群で1.2倍増加しました（表4）。肝臓けが組織病理学的研究によってさらにサポートされました。
75および100mg/ kgイホスファミド群のマウスの肝臓では組織病理学的兆候は観察されませんでした（図1A）。 一方、腎臓75および100mg/ kgのイホスファミド群では、尿細管変性/拡張（100 mg / kg群で1中等度）、単細胞壊死、尿路上皮過形成、限局性出血など、軽度から軽度の病理学的変化が見られました。 /混雑（表5）。 さらに、尿細管領域でのKIM-1発現の明らかな増加が肝臓100 mg / kgグループの（図1B）。
2.3。 4週間の反復投与毒性試験
死亡率は、50（5/10）および70（10/10）mg / kg投与群で、それぞれ21日および10日の連続投与後に観察されました。 さらに、相対的な臓器重量の増加に伴う体重の減少、肝臓、 と肝臓、すべてのイホスファミド治療群で、4-週間の反復投与毒性をサポートします。
血液学的および血清生化学的分析は、生き残った被験者に対して行われた。 RET、RBC、MONA、EOSA、およびLUCAを含むいくつかの血液パラメーターは、イホスファミド投与の4週間後に有意に減少しました。
対照群と比較して、生化学的分析は、4週間のイホスファミド投与後の統計的差異を示しました。 たとえば、ASTとCKのレベルは大幅に増加し、A / G比、GLU、およびGGTは、対照と比較した場合、50 mg / kgの治療群で減少しました（p <0>
2.4。 イホスファミド誘導遺伝子発現分析
イホスファミドによって誘発されたDEGは、肝臓で同定され、肝臓組織（表6）。 肝臓の場合、差次的に発現する遺伝子には、100 mg / kg BW /日で2672個の遺伝子が含まれ、1283個の遺伝子がアップレギュレーションされ、1389個の遺伝子がダウンレギュレーションされました。 腎臓では、401個の遺伝子が100 mg / kg BW / dayで差次的に発現し、149個の遺伝子がアップレギュレーションされ、252個の遺伝子がダウンレギュレーションされました。 肝臓と腎臓の両方で、ダウンレギュレーションされた遺伝子の数は、アップレギュレーションされた遺伝子の数よりも多かった。 これは、イホスファミド治療が遺伝子発現を阻害するように見えることを示唆している可能性があります。
生物学的機能分析の結果を表7に示します。1-週間のイホスファミド投与は、主に肝臓での臓器発達に関連する遺伝子を変化させることがわかりました。 の中に肝臓、免疫細胞の局在に関連する遺伝子がほとんど影響を受けていることが確認されました。
ＤＥＧの標準的な経路分析において、コレステロール合成および抗原提示経路関連遺伝子の変化は、肝臓と肝臓それぞれ組織（図2）。 さらに、LXE / RXRおよび急性期応答シグナル伝達は、肝臓と肝臓、それぞれ脂質ホメオスタシスと炎症性サイトカインシグナル伝達に関与していた。
肝臓毒性リスト分析では、コレステロール合成関連遺伝子が主に影響を受け、続いて急性期応答タンパク質が陽性であり、急性腎不全パネルが続いた（表8）。 さらに、腎リストの結果から、腎不全関連遺伝子は、可逆性糸球体腎炎バイオマーカーや急性腎不全パネルなど、一般的にイホスファミドの影響を受けていることが明らかになりました。
IPAナレッジベースに基づいて、一般的な上流レギュレーターは、イホスファミド治療後の肝臓と腎臓での遺伝子発現を調節します（図3）。 IRF7は、肝臓と腎臓の両方で変化する主要な調節因子であり、USP18、RSAD2、ISG15などの他の標的遺伝子と相互作用することがわかっています。 さらに、リアルタイムRT-PCR分析により、IRF7、USP18、RSAD2、およびISG15の発現が確認されました。 各遺伝子の変化の程度は肝臓と腎臓で異なっていたが、イホスファミド投与の1週間後、肝臓と腎臓の両方の組織で発現が抑制された。 RSAD2とUSP18は、それぞれ肝臓と腎臓でのイホスファミド治療によって遺伝子がほとんど変化しています。
3.ディスカッション
この研究では、複数の臓器における包括的なイホスファミド毒性が、GLP基準の下でラットのIP経路を介してさまざまな用量と曝露条件で調査されました。 診療所では、イホスファミドは、養子免疫療法と組み合わせた細胞毒性および免疫調節効果を伴う二峰性の抗腫瘍作用を発揮することができます[12]。 イホスファミドは主に腎経路によって排泄されることが知られており、用量の約80％は変化しない形であり、腎毒性はイホスファミドの一般的に知られている副作用であり、クロロアセトアルデヒドやアクロレインなどの代謝物がその臨床使用に関与しています[13、 14]。
本研究では、1-週間の反復毒性試験がイホスファミド由来の臓器毒性の調査に適していました。 1週間のイホスファミド投与は、用量依存的に血液指数を抑制しました。これは、典型的なイホスファミド由来の骨髄抑制を反映している可能性があります。 腎毒性に加えて、骨髄抑制が主要な用量制限イホスファミド毒性の1つであり、白血球減少症は一般に血小板減少症よりも重症であることがいくつかの報告で示されています[15,16]。 イホスファミド腎毒性はファンコニ症候群を引き起こす可能性があり、近位尿細管機能に障害があり、不可逆的な損傷を引き起こし、毒性代謝物であるアクロレインが出血性膀胱炎を伴う尿路毒性を引き起こします[17]。 これは、本研究の結果と一致している。 組織病理学的研究では、腎臓と肝臓を調べて、イホスファミド由来の病理学的変化を調べました。 75および100mg/ kgのイホスファミド投与群の両方で、腎盂領域の尿路上皮過形成を伴う尿細管変性および拡張の広い領域が検出されました。 さらに、腎近位尿細管損傷分子であるKIM -1の発現は、イホスファミド関連の腎毒性の存在を裏付けました。 一方、肝臓では最小限の門脈周囲空胞化のみが観察された。 さらに、AST値とALT値は用量依存的に減少しましたが、変化は基準範囲内でした[18]。 肝酵素レベルが低下するより深い理由は、さらに研究する必要があります。 イホスファミドは肝毒性と関連することはめったにないアルキル化剤であると一般に認められており、特にドキソルビシンなどの他の化学療法薬と組み合わせた場合に肝障害を誘発することが報告されているのはごくわずかです[19]。
最近、ハイスループット技術を用いた毒物学における遺伝子発現データの目覚ましい進歩により、毒性研究で十分に大きなデータセットが生成され、化学毒性予測に遺伝子プロファイルを適用する多くの試みがなされてきました[10,20]。 本研究では、イホスファミド投与によるトランスクリプトーム応答を解析するためにマイクロアレイ解析を行い、倍率変化が1.5以上のDEGを標的遺伝子とし、生物学的機能、カノニカルパスウェイ、トックスリスト解析を用いた。イホスファミド誘導遺伝子の機能を理解する。 肝臓と腎臓における多臓器毒性の可能性を評価するために、追加の上流レギュレーター分析が実施されました。
この研究では、DEGが1倍に変化しました。5-倍が選択され、肝臓（52％）と腎臓（62％）の両方で、ダウンレギュレーションされた遺伝子がアップレギュレーションされた遺伝子よりもわずかに優勢でした。 生物学的機能分析の結果は、イホスファミドが遺伝子を変化させ、肝臓と腎臓の両方で一般的に観察される組織発達に関連する生物学的機能を伴うことを示しました。
Snouberらによる以前の研究。 [21]報告されたイホスファミド処理は、マイクロ流体培養においてNrf-2を介したストレス酸化応答経路をダウンレギュレートすることがわかった[21]。 以前の研究と一致して、NRF 2-を介した酸化ストレス応答経路は、現在の標準的な経路と毒性リスト分析の両方によって確認されたトップネットワークによって大幅に変調されました。 現在変更されているNrf-2を介したストレス酸化応答経路は、イホスファミド毒性代謝物と密接に関連している可能性があります。 複数のイホスファミド毒性代謝物は、強力な抗酸化剤であるGSHと反応して、経路に沿ったさまざまな部位で抱合体を形成し、GSHレベルの低下は毒性の増加をもたらします。これは、イホスファミド臓器毒性における酸化ストレスの影響を示しています[8,22 ]。 この点で、メスナとN-アセチルシステインは、イホスファミド臓器毒性を軽減するために使用されました。 メスナは、マイケル付加を介して、主にアクロレインに対してイホスファミドの毒性代謝物に結合し、より害の少ない物質を形成することにより、地域の解毒剤として機能します[23]。 さらに、N-アセチルシステインは抗酸化活性を持ち、酸化ストレス条件下でGSHの枯渇を改善すると報告されています[24]。 イホスファミド解毒剤と腎毒性条件下で調節される経路との正確な関係を解明するには、さらなる研究が必要です。 メスナまたはN-アセチルシステインによるイホスファミド毒性の改善の後に、Nrf-2-を介したストレス酸化反応経路の改善が続く可能性があると推測できます。
この研究では、炎症関連のシグナルは、肝臓と腎臓の両方で一般的にアップレギュレーションされていました。これは、標準的な経路分析の急性期シグナル伝達によって認識できます。 この結果は、両方の組織におけるイホスファミド臓器毒性の病態生理学における炎症反応の意味を示しており、これは上流の調節因子分析によってさらに裏付けられた。 上流レギュレーター分析では、USP18、RSAD2、ISG15などのIRF7およびインターフェロン（IFN）シグナル関連遺伝子が、肝臓と腎臓の一般的な上流レギュレーターとして選択されました。 IRF7はリンパ球特異的因子であり、免疫細胞の細胞質で構成的に発現し、I型インターフェロン、ウイルス感染、およびさまざまな細胞での外部刺激によっても誘導される可能性があります[25]。 以前の研究では、多様な腫瘍細胞におけるIRF7の発癌促進性または抗発癌性について議論の余地があり、IRF7発現の変化はDNA損傷と関連していた[26–28]。
抗ウイルス機能のためのI型IFNにおけるその重要な調節的役割に加えて、IRF7はTLR4シグナル伝達経路を介して炎症反応を抑制することが報告されました[29]。 さらに、Stout-Delgadoetal。 [30]は、老化によって誘発される酸化的増加がIRF7活性を損なうのに対し、抗酸化剤によるストレスの減少はIRF7活性を改善したと報告しました。 この研究では、イホスファミドの投与により上流の調節因子の発現が抑制され、発現パターンは肝臓と腎臓の両方で同一でした。 IRF7発現の現在の変化は、イホスファミドの炎症反応と細胞毒性アルキル化剤の特性に関連している可能性があり、これはIRF7がイホスファミド臓器毒性の有望な標的であることを示唆している可能性があります。
この研究では、イホスファミド投与後に肝臓と腎臓の両方で同じように阻害される遺伝子を発見しましたが、その毒性学的重要性の解釈は腎臓にのみ焦点を当てており、現在の発見を制限しています。 さらに、現在変更されている遺伝子に対する市販のイホスファミド解毒剤の効果に関連するさらなる確認研究は、現在の発見を裏付ける可能性があります。
結論として、イホスファミド投与の反復毒性試験（1週間）は、肝毒性ではなく腎毒性にバイアスがかかっていることがわかりました。 さらに、現在の結果は、IRF-7阻害を伴うイホスファミド誘発肝毒性および腎毒性メカニズムの証拠を提供します。 イホスファミドの全身毒性メカニズムを解明し、遺伝子と臓器毒性の関係を裏付けるには、免疫関連臓器のさらなる毒性ゲノム学的研究が必要です。
4.材料と方法
4.1。 動物実験
8週齢の雄特異的病原体を含まないSprague-Dawley（SD）ラット（n=140）は、Orient Bio Inc.（Seongnam、Korea）から入手しました。 動物を検査し、実験前の1週間、実験室の環境条件に順応させた。 すべての動物は、実験用飼料と水を自由に摂取できる制御された実験室条件（温度、23±3°C、湿度、55±10パーセント、および12 / 12-時間の明/暗サイクル）でプラスチックケージに収容されました。 動物実験は、韓国毒物学研究所（大田、韓国）の施設内動物管理使用委員会によって承認され、すべての手順は、韓国食品医薬品安全庁からの薬物の安全性評価のための試験ガイドラインに従って実施されました。 動物実験は3つのセクションに分けられました：単回投与（急性）および反復投与（1週間および4週間）の連続投与毒性試験。 各毒性試験において、Path / Toxシステム（バージョン4.2.2、Xybion Medical Systems Corporation、米国ニュージャージー州ローレンスビル）を使用して、40匹のラットを4つのグループ（コントロール、t1、t2、およびt3）にランダムに割り当てました。
4.2。 毒性実験
毒性試験は3つのセクションに分けられました：単回投与（急性）および2回の反復投与（1週間または4週間の連続投与）毒性試験。 各毒性試験について、ラットを適切なグループにランダムに割り当てました（1週間および4-週の毒性試験では対照、用量1、用量2、および用量3、1-では対照、用量1、および用量2 Path / Toxシステム（バージョン4.2.2、Xybion Medical Systems Corporation、ローレンスビル、ニュージャージー州、米国）を使用した週毒性試験）。 毒性試験では、イホスファミドを腹腔内（IP）経路で投与し、対照群には蒸留水（DW）を投与しました。 毒性試験で使用されたイホスファミドの用量は次のとおりでした：急性毒性試験（12.5、25、および50 mg / kg）、1-週毒性試験（75および100 mg / kg BW /日）、および{{19 }}週毒性試験（25、50、および70 mg / kg BW /日）。 動物の一般的な臨床症状、体重、および死亡率を投与中に毎日記録し、最後のイホスファミド投与の24時間後にすべての動物を犠牲にした。 血液サンプルを収集し、血清生化学および血液学的分析のために、それぞれマイクロ遠心チューブおよびEDTA-K2チューブに入れました。 肝臓と腎臓の組織をホルムアルデヒドで固定し、組織病理学的分析を行いました。 追加の免疫組織化学、マイクロアレイ分析、およびリアルタイムRT-PCRが、亜急性毒性試験（100 mg / kg BW /日）の肝臓および腎臓組織で実施されました。
4.3。 血液学的および血清生化学的分析
標準的な血液学的検査は、ADVIA 120血液学システム（Bayer、Fernwald、Germany）を使用して実施されました。 次の指標が使用されました：白血球数（WBC）、赤血球数（RBC）、ヘマトクリット値（HCT）、ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積（MCV）、平均赤血球ヘモグロビン（MCH）、血小板数（PLT）、リンパ球（LYM）、単球（MON）、好中球（NEU）、好塩基球（BAS）、好酸球（EOS）、および大きな未染色細胞（LUC）、および細網細胞（RET）数。
生化学アッセイは、自動分析装置（TBA 120FRNEO;東芝、東京、日本）を遠心分離した血清とともに使用して実施しました。 主な生化学的指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アルカリホスファターゼ（ALP）、血中尿中窒素（BUN）、クレアチニン（CREA）、グルコース（GLU）、総コレステロール（TCHO）、アルブミン/グロブリン比でした。 （A / G）、トリグリセリド（TG）、総ビリルビン（TB）、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、リン脂質（PL）、カルシウム、塩化物、無機ナトリウム、リン、およびカリウム。
4.4。 組織病理学的および免疫組織化学検査
パラフィン包埋組織を5-µmの厚さに切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色し、顕微鏡で検査しました。
腎臓組織を免疫組織化学に供した。 脱パラフィンおよび洗浄した切片を10％ヤギ血清とプレインキュベートして、非特異的染色をブロックしました。 次に、スライドを一次抗KIM1抗体（1：750; Santa Cruz、CA、USA）とともに一晩インキュベートしました。 一次抗体を除去した後、切片をVECTASTAIN Elite ABC HRP Kit（Vector Laboratories、Peterborough、UK）で処理し、KIM1の発現を光学顕微鏡で調べました。
4.5。 マイクロアレイ分析およびタンパク質間相互作用（PPI）分析
1-週（100 mg / kg）グループの肝臓と腎臓をホモジナイズし、RNaseミニキット（Qiagen）を使用してトータルRNAを抽出しました。 cDNA合成は、cDNA合成キット（Affymetrix、Affymetrix、Santa Clara、CA、USA）を使用して達成され、マイクロアレイおよびPPI分析にかけられました。
マイクロアレイ分析は、Affymetrix GeneChipRat{{0}}。0とGeneChipScanner3 0 0 0（Affymetrix Santa Clara、CA、USA）を使用して実行されました。結果は、GeneSpring GX v13.0分析ソフトウェア（Agilent Technologies、米国サンタクララ）を使用して処理されました。 イホスファミド投与後に1。5-倍以上変化した差次的発現遺伝子（DEG）は、テューキーの事後検定による一元配置分散分析（ANOVA）を使用して選択されました。 選択されたDEGの生物学的機能と標準経路は、Ingenuity Pathway Analysisソフトウェア（IPA、ver。9.0; Ingenuity Systems、Redwood City、CA、USA）を使用して分析され、上流レギュレーター分析が実行されて、イホスファミドの毒性に由来するDEGに責任を負います。 STRINGソフトウェア（バージョン10）を使用してDEGの追加のタンパク質間相互作用（PPI）ネットワーク分析を実行し、中程度の信頼スコアが0.4を超えたときに相互作用を確認しました。 タンパク質相互作用は、Kyoto Encyclopedia of GenesandGenomes経路の2つのタンパク質間に予測されるリンクが存在するおおよその確率です。
4.6。 定量的リアルタイムRT-PCR研究
マイクロアレイ研究における一般的な調節遺伝子の発現は、定量的リアルタイムRT-PCRを使用して確認されました。 遺伝子特異的プライマーはBioneer（Daejeon、Korea）から入手しました。 プライマー配列は次のとおりです。インターフェロン調節因子7（IRF7）：順方向、5- TGCTTGTCTAGCACCAATAG -3および逆方向、5- CACAAGGTCCACTAGAGATG -3; ユビキチン特異的ペプチダーゼ18（USP18）：順方向、5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3および逆方向5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; 2（RSAD2）を含むラジカルS-アデノシルメチオニンドメイン：順方向、5- ACCAATCATCAGAGGTTGAC -3および逆方向、5- CTGCATGATTGTTCTTGGAC -3; インターフェロン刺激遺伝子15（ISG15）：順方向、5- AAGTCTCCCAAGACCAATTC -3および逆方向、5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30。
製造元の指示に従って、SuperScript II（Invitrogen、Carls bad、CA、USA）およびoligo-dTプライマーを使用して、トータルRNAをcDNAに逆転写しました。 上流の調節関連遺伝子のmRNA発現レベルは、StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems、Carlsbad、CA、USA）とSYBR Greenマスターミックス（Applied Biosystems）を使用して、製造元のプロトコルに従って分析しました。 18SリボソームRNAプライマーを内部対照として使用し、結果を正常対照群と比較した倍率変化として表した。
4.7。 統計分析
データは、複数の比較方法を使用して統計的に分析されました。 バートレットの検定で分散の均一性からの有意な偏差が示されなかった場合、分散分析（ANOVA）を使用して、グループ平均のいずれかがp<{{0}}。05の有意水準で異なるかどうかを判断しました。 さらに、ダネットの検定を使用して、データがanova検定から有意であることが判明した場合に、対照群と治療群の間のデータの違いを決定しました。=""><0.05で異なるかどうかを判断しました。 クラスカル・ウォリス（h）検定で有意差が観察された場合、平均とは有意に異なるグループデータの特定のペアを定量化するためにダンのランクサブテストが実行されました。="" フィッシャーの直接確率検定は、データのペア（有病率とパーセンテージを含む）を比較するために実施されました。="" 確率のレベルは1または5パーセントに設定されました。="" 統計分析は、path="" tox（バージョン4.2.2、xybion="" medical="" systems="">
データ可用性ステートメント：
データは記事または補足資料に含まれています。
利害の対立：
著者は、競合する利害関係はないと宣言しています。
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