パート2：ウサギの腎虚血再灌流傷害の治療としての鶏卵白抽出物誘発ウサギPBMCの移植
Mar 07, 2022
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結果
1.CFSEによるPBMCのラベリングの成功
カルボキシフルオレセインジアセテートおよびスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識されたPBMCは、Eig 1Bに示すように、蛍光顕微鏡下で黄緑色の蛍光を示しました。 DAPIで対比染色した後、図1Aに示すように、すべての細胞が青色の蛍光を示し、蛍光染色のオーバーラップの分析により、Eig1Cに示すように細胞が正常に標識されたことが示されました。
2.誘導後のPBMCの同定
2.1。非誘導および誘導PBMCにおける多能性関連および体細胞遺伝子の相対的発現レベル.NANOG、OCT4、およびSOX2の発現は、鶏卵白抽出物で刺激されたPBMCで有意に増加し、体細胞遺伝子LMNAの発現は減少しました（図1D）。これは、細胞が多能性細胞に分化したことを示しています。 統計分析は、2つのグループが有意に異なることを示しました（n =3、p =0。003）。 細胞は3回誘導され、3つの生物学的複製が研究に含まれました。 2つのグループ間の体細胞遺伝子LMNAの違いは統計的に有意ではありませんでした。
2.2。誘発されたPBMCの多能性因子は非誘発されたPBMCのそれより有意に高かった。 非誘導細胞の中で、{{0}}。081パーセントがOCT4- PEに陽性であったのに対し、誘導細胞の99.3パーセントはOCT4-PEに陽性でした。 SSEA -4- PE陽性の非誘導細胞と誘導細胞の割合は、それぞれ1。08パーセントと16.5パーセントでした。 さらに、0。495パーセントの非誘導細胞がNANOG-PE陽性であったのに対し、誘導細胞の95.8パーセントはNANOG-PE陽性であることがわかりました（図1E -1 M）。 OCT 4- PE、SSEA -4- PE、およびNANOG-PEに陽性のアイソタイプコントロール細胞の割合は、それぞれ0.546パーセント、0.401パーセント、および0.249パーセントでした。
2.3。免疫組織化学的分析は、誘発されたPBMCに対して陽性の結果をもたらした。OCT4およびNANOGの免疫組織化学的分析は、誘導されたPBMCがこれらのマーカーを発現したが、非誘導されたPBMCは発現しなかったことを示した（図2A -2 D）。 図2Aおよび2Cは誘導されていないPBMCを示し、図2Bおよび2Dは誘導されたPBMCを示しています。 また、OCT4の発現を図2Aと2Bに、図2Cと2DにNANOGの発現を示します。
2.4。ウエスタンブロット分析は、誘導されたPBMCに対して陽性の結果をもたらしました。ウエスタンブロットの結果によると、OCT4は誘導されたPBMCで発現されましたが、誘導されていないPBMCでは発現されませんでした（E図2E）。
2.5。 相対的なテロメアの長さは、誘導されたPBMCで有意に長かった。定量的PCRの結果に基づくと、誘導されたPBMCのテロメア（1.838 0 7±0。84756）は、誘導されていないPBMCのテロメア（1±0.08307）（Eig 2E、平均値±標準偏差）よりも有意に長かった。 、n =5、p =0。013）、これは細胞が若い幹細胞に分化したことを示しています。 相対的なテロメアの長さは、脱分化後に実際に増加しました。
3.血清尿素窒素およびクレアチニンレベルは、誘導細胞治療群で減少しました
モデル対照群の尿素窒素含有量は22.1mmol/ l、クレアチニン含有量は452 umol/lでした。 誘導細胞を用いた3ラウンドの移植後、尿素窒素含有量は7 mmol / lであり、クレアチニン含有量は74μmol/lでした。 これらの値は通常のレベルと同様でした。 非誘導細胞治療群のレベルは上昇したままでした（図2G）。 統計分析は、4つのグループの結果の間に統計的に有意な差を示しました（p=0。031）。
4.誘発群では、尿中タンパク質濃度が低下した。
モデル対照群の尿中タンパク質濃度は8.17mg/mlでした。 3回の治療後、誘発群の尿中タンパク質濃度は4.35 mg / mlであり、正常レベルと同様でした。 しかし、非誘発群の尿中タンパク質含有量は7.96mg / mlと高いままでした（図2H）。 統計分析では、4つのグループから得られた結果の間に統計的に有意な差が示されました（p =0。001）。
5.誘導されたグループで標識細胞が検出された
図3A-3Dに示すように、多くの蛍光細胞が誘導細胞治療群の腎臓に分布していたのに対し、腎臓組織他の3つのグループからは蛍光細胞を表示しませんでした。 考えられる説明は、誘導された細胞が損傷した腎臓に輸送されて損傷を修復することです。 凍結腎臓切片における蛍光標識された誘導PBMCの分布は、これらの細胞が損傷した腎臓の修復に関与していることを示唆した。
6.誘発群の腎臓の構造は正常な表現型を示した
ヘマトキシリン-エオジン（HE）染色の結果に基づいて、モデル対照群のウサギの腎臓の構造が損傷した。 誘導された細胞で処理した後、腎臓組織構造は正常な表現型を示した。 対照的に、腎臓組織への損傷は、非誘導細胞治療群で持続しました（図3E -3 H）。 急性尿細管壊死（ATN）スコアを図3Iに示します。
7.誘導された細胞群のIODは大幅に減少しました
Image-Pro Plus 6. 0（Media Cybernetics、Inc.、Rockville、MD、USA）ソフトウェアを使用して、累積光学密度（IOD）の免疫組織化学的分析を実行しました。 各グループについて、少なくとも6つの2 0 0倍の倍率フィールドが各セクションからランダムに選択され、画像がキャプチャされました。 すべての写真の背景が同じになるように、視野全体を表示しようとしました。 Image-Pro Plus 6.0ソフトウェアを使用して、すべての画像の陽性染色を判断するための均一な標準と同じ茶色を選択しました。 各画像を分析して、陽性染色のIODを決定した。 IODはモデル対照群で有意に増加しましたが、正常対照群と誘導細胞群のIODはそれぞれ減少し、有意に減少しました。 非誘導細胞処理群のIODは、モデル対照群のIODと比較して著しく減少しませんでした（図3）。 統計分析は、4つのグループの結果の間に有意差を示しました（p =0。001）。
8.線維症は誘発群で改善された
モデル対照群ではかなりのコラーゲン線維沈着が観察され、重篤な線維症が発生した。 この線維症は、誘導細胞治療群で改善または排除されたが、非誘導細胞治療群では依然として重度の線維症が観察された（Eig 4A -4 D）。
9.誘導群では基底膜の肥厚は観察されなかった
糸球体基底膜、腎被膜の基底膜、および尿細管間質膜の厚さは、モデル対照群で有意に増加した。 誘導細胞処理群では、基底膜は有意な肥厚を示さなかったが、非誘導細胞処理群では依然としてより厚い基底膜が観察された（図4E -4 H）。 基底膜の厚さのスコアを図4Iに示します。
10.管状上皮細胞に分化した移植細胞
蛍光抗体法の結果は、移植された細胞が同時に緑色と赤色の蛍光を示したことを示し、これは移植された細胞が尿細管上皮細胞（TEC）に分化したことを示した（図4J）。
11.同定された物質は、モデルグループで増加し、治療後に減少しました
負イオンモードでは、モデルコントロールグループで有意に増加したレベルを示した2つの物質は、2'-デオキシ-D-リボースとN-アセチルグルコサミン1-リン酸でした（図5A）。 これらの化合物の両方のレベルは、モデル対照群で見られるレベルと比較して、誘導細胞治療後に有意に減少しました（図5A）。陽イオンモードでは、3つの物質（D-ピニトール、リシル-グリシン、およびグルタミル）のレベル-アスパラギン）はモデル対照群で有意に増加し（図5B）、これら3つの物質のレベルは、モデル対照群で見られたもの（図5B）と比較して、誘導細胞治療後に有意に減少しました。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244160.g005
負イオンモードでは、特定された2つの物質のレベルがモデルグループで増加し、処理後に減少しました。これは、2つの物質のレベル間に有意な相関関係があることを示しています。
陽イオンモードでは、特定された3つの物質のレベルは、モデル対照群で増加し、治療後に減少しました。これは、これら3つの物質のレベル間に有意な相関関係があることを示しています。
12.ピリミジン代謝とフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン生合成経路の有意な変化が観察されました
負イオンモードでは、モデル対照群と正常対照群（Eig6A）の間でピリミジン代謝経路の有意な変化が検出されました。 加えて、
この経路の有意な変化は、モデル対照群と比較して誘導細胞治療群で観察され（図6B）、これは、ピリミジン代謝経路が有意に変化した経路であることを示した。 ポジティブイオンモード分析では、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン生合成経路は、正常対照群と比較してモデル対照群で有意に変化し（図6C）、これらの経路は、誘導細胞治療群で、モデル対照群（Eig 6D）は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン生合成経路が意味のある経路であることを示しました。 図6では、泡の色が濃く、体積が大きいほど、大きな違いが見られます。 図6Aおよび6Bの矢印で示されているように、ピリミジン代謝経路の違いは重要であり、図6Cおよび6Dの矢印で示されているように、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン生合成経路の違いは重要です。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244160.g006
討論
急性肝臓虚血再灌流による損傷は一般的な臨床疾患であり、急性腎損傷の患者の死亡率は、治療手段が限られているため、約30％から50％です[14]。 虚血中、酵素の活性化は細胞骨格の破壊、細胞膜の損傷、およびDNAの分解を誘発し、最終的には細胞の壊死とアポトーシスを引き起こします[15]。 虚血再灌流はまた、他の分子の中でも補体タンパク質、サイトカイン、およびケモカインを活性化し、虚血再灌流傷害の根底にあるメカニズムは非常に重要です[16]。 さらに、移植された幹細胞は、損傷部位への残存腎幹細胞の移動と動員を促進し、TECへの分化を誘導しますが、正確なメカニズムは不明です[17]。
効果的な臨床治療がないため、虚血再灌流傷害の患者の死亡率は高い[18]。 この状態には、長期または生涯にわたる腎代替療法が必要です。腎移植[19]。 虚血再灌流傷害の病態生理学的メカニズムは非常に複雑であり、炎症細胞、血管内皮細胞、およびサイトカイン間の多数の相互作用に起因します[20]。 近年、間葉系幹細胞は、虚血再灌流傷害に関する研究の焦点となっており[21]、虚血再灌流誘発性を改善することが示されています。腎障害。 虚血再灌流モデルを使用した研究で示されているように、間葉系幹細胞は、免疫の調節、血管再建への参加[22]、およびパラクリン抗アポトーシス因子、マイトジェン因子、および血管新生因子を分泌することによる腎微小環境の修復に重要な役割を果たします。 異なる起源の幹細胞を使用した最近の研究では、多能性幹細胞が他の種類の幹細胞を誘導することが明らかになりました[22]。 人工多能性幹細胞よりも成熟しているため、誘導細胞は間葉系幹細胞である可能性が高いと考えられます。
人工多能性幹細胞移植後、人工多能性幹細胞の表面に発現する分子は、T細胞と相互作用して生物学的活性を調節します。 T細胞は損傷後の免疫系を回避し、周囲の組織の免疫応答の強度を低下させる可能性があるため、これらの細胞は損傷した組織の機能をある程度保護する役割を果たします[23]。 我々は、腎間質性線維症のウサギモデルを確立することに成功し、誘発された自家幹細胞の移植が8週間以内に腎障害を修復できることを実証しました[24]。 幹細胞は、尿細管上皮損傷の修復に有利な微小環境を提供します[24]。 この実験では、3回の連続した週次治療の投与後、誘導細胞治療群の血清クレアチニンおよび尿素窒素レベルは、正常対照群で観察されたのと同じレベルに回復しましたが、非誘導細胞治療およびモデル対照のレベルはグループは大幅に上昇しました。
ヘインズワースらによって示されているように。 [25]間葉系幹細胞は、さまざまな成長因子、コロニー刺激因子、接着分子、およびインターロイキン（IL -6、IL -7、IL -8、I {{5 }}、IL -14、およびIL -15）は、腎TECの有糸分裂と組織修復を促進し、それによってクレアチニンと尿素の窒素濃度の上昇を抑制します。
本研究では、誘導されたPBMCにおける多能性因子SSEA -4、NANOG、およびOCT4の発現レベルがフローサイトメトリーによって検出され、その結果、PBMCが多能性細胞に脱分化したことが明らかになりました。 定量的PCR分析により、誘導PBMCのテロメアは非誘導PBMCのテロメアよりも有意に長いことが示されました。我々の証拠に基づくと、ウサギ末梢血から得られたPBMCは、ニワトリ卵白抽出物で処理した後、多能性幹細胞に脱分化し、間葉系幹細胞の特性を示します。細胞[9]、これは腎損傷の修復への最終的な参加を可能にします。 研究によると、哺乳類の卵細胞とアフリカツメガエルの卵細胞抽出物は体細胞を再プログラムできることが示されています[6,7]。 私たちの以前の研究は、鶏卵抽出物が体細胞を再プログラムすることもできることを示しました[5,9]。 鶏卵は最大の卵細胞であり、体細胞を再プログラムする能力は細胞生物学の研究を前進させるでしょう。 哺乳類の卵細胞とアフリカツメガエルの卵細胞抽出物によって誘発される再プログラミングのステップは面倒であり、抽出物を入手するのは困難です。 しかし、鶏卵は最大の卵細胞であるため、大量の鶏卵白抽出物を得ることができます。 手順が滅菌方式で実行される場合、得られた抽出物を濾過および滅菌する必要はありません。 抽出物の活性はよく維持することができます。 PBMCを誘導するために、10パーセント、20パーセント、30パーセント、40パーセント、および50パーセントの鶏卵白抽出物の最終濃度を使用して誘導実験を繰り返しました（S1からS3の図を参照）。 鶏卵白抽出物の濃度が高くなるにつれて、多能性因子の陽性率は徐々に増加し、最終濃度が50％のときに最高の陽性率が得られました。 ただし、鶏卵白抽出物の濃度が50％を超えると、細胞の成長に影響を及ぼします。 プロテアーゼ、DNase、RNaseを使用して、卵白抽出物中のタンパク質、DNA、RNAをそれぞれ溶解し、誘導実験を行いました。 タンパク質溶解後に得られた卵白抽出物はもはや細胞を再プログラムする能力を持たず、DNAおよびRNA溶解後に得られた鶏タンパク質抽出物は依然として細胞を再プログラムする能力を持っていることがわかりました。 したがって、これらの発見により、抽出物の主な役割がタンパク質成分によって果たされていることが確認されました（結果は示されていません）。
また、1週間の治療後の動物の血液サンプルも分析しました。 ただし、4つのグループ間の違いは重要ではありませんでした。 したがって、3回の処理後に4つのグループで得られた結果のみを示します。 凍結腎臓切片における蛍光標識された誘導PBMCの分布は、これらの細胞が損傷した腎臓の修復に関与していることを示唆した。 HE染色は、モデル対照群の腎臓構造への損傷を示した。 誘導細胞で処理した後、腎臓は正常な構造を示したが、非誘導細胞処理群では腎臓構造への損傷が観察された。 3回の治療後、4つのグループの腎臓切片のマッソントリクローム染色により、モデル対照グループでかなりのコラーゲン線維沈着と重篤な線維症が明らかになりました。 この線維症は、誘導細胞での治療によって改善または排除されましたが、非誘導細胞治療群では依然として重度の線維症が観察されました。負イオンモードで実施された4つの群の腎メタボノミクス分析では、2'-のレベルが大幅に増加していることが明らかになりました。正常対照群と比較してモデル対照群のデオキシ-D-リボースおよびN-アセチルグルコサミン1-リン酸、およびこれらの物質のレベルは、モデル対照群と比較して誘導細胞処理群で有意に減少した。 陽イオンモードでは、モデル対照群では正常対照群と比較して5物質のレベルが有意に上昇し、誘導細胞処理群ではモデル対照群と比較してこれら5物質のうち3物質のレベルが有意に低下した。 。
観察された腎臓の修復およびそれに伴う炎症反応の低下の根底にある想定される主なメカニズムを以下に示します。 ①誘導されたPBMCはTECに分化するか、生き残った細胞と融合して腎組織の修復を直接促進します。 ②さまざまなサイトカインの相乗効果により、腎組織の修復に優れた微小環境がもたらされます[26]。 誘導されたPBMCを3回移植した後、腎機能と病理学的指標は正常レベルに戻り、これらの正常レベルは実験が終了するまで持続しました。これは、移植された多能性幹細胞が腎組織の構造と機能の修復を効果的に促進したことを示唆しています。
誘発されたPBMCが腎臓の構造的および機能的修復を促進する特定のメカニズムはまだ完全には理解されていないが、この研究の結果は、誘発されたPBMCの静脈内移植が急性腎損傷後の修復を促進することを示唆している。 これらの結果は、損傷した腎臓の再生における多能性幹細胞の機能を調査する研究者、および急性および慢性腎臓病の臨床治療のための貴重な参考資料を提供します。
要約すると、誘導された多能性幹細胞移植は、腎不全および他の腎疾患の動物モデルにおける実質細胞修復に実質的な重要性を持っています。
結論
鶏卵白抽出物によるPBMCの処理は、多能性関連遺伝子およびタンパク質の発現を有意に増加させました。これは、細胞が多能性幹細胞に脱分化したことを示しています。 したがって、誘導されたPBMCは多能性幹細胞に脱分化し、治療に使用できる可能性があります腎臓障害。 鶏卵白抽出物の主要分子を特定し、誘導効率をさらに向上させるには、今後の研究が必要です。
参考文献
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