オタネニンジンの葉からの新しい抗メラニン生成化合物であるジンセノサイド Rh23 の分離と定量化
Mar 21, 2023
概要：
ジンセノサイド Rh23 (1) と名付けられた新しいジンセノサイド、および 20-O- -D-グルコピラノシル-3 ,6 , 12 ,20 ,25-ペンタヒドロキシダンマル-23-エン(2) 水耕栽培のオタネニンジンの葉から分離されました。 化合物はさまざまなカラムクロマトグラフィーによって分離され、それらの構造は、高分解能四重極/飛行時間質量分析 (HR-QTOF/MS)、核磁気共鳴 (NMR) 分光法、赤外線 (IR) 分光法などの分光法に基づいて決定されました。 . 抗メラニン形成活性を決定するために、同定された化合物で処理されたメランα細胞におけるメラニン含有量の変化が試験された。
さらに、ゼブラフィッシュの in vivo モデルにおける色素沈着に対するジンセノサイド Rh23 のメラニン抑制効果を調査しました。 化合物 1 は、80 µM で 37.0 パーセントのメラニン形成阻害でメラン α 細胞の強力なメラニン形成を阻害し、ゼブラフィッシュ モデルで体の色素沈着の阻害も示しました。 化合物 2 は、化合物 1 よりもわずかに低い阻害活性を示しましたが、メラン a 細胞およびゼブラフィッシュ モデルでのメラニン形成の有意な減少も示しました。 これらの結果は、水耕栽培の高麗人参から分離された化合物が、in vitro および in vivo 系を介して新しい皮膚美白化合物として使用される可能性があることを示しています。 さらに、この研究は、定量分析のための MS ベースの化合物 1 の有用性を実証しました。 ジンセノサイド Rh23 (1) は、水耕栽培の P. ginseng の葉に 0.31 mg/g のレベルで検出されました。
メラニンについては、Cistanche がチロシナーゼの活性を大幅にダウンレギュレートできることを発見しました。チロシナーゼは、皮膚メラニンの生合成における主な律速酵素であり、銅とタンパク質の複合体です。 体内のメラニン生成の主原料であるチロシンを水酸化してL-ドーパを生成し、ドーパを酸化してドーパキノンにすることができます。 ドーパキノンは一連の代謝プロセスを経て、再構成および重合し、最終的にタンパク質と結合して、褐色化を引き起こす一連のメラニン色素を生成します. メラニンは、人体の皮膚の色を決定する上で最も重要な要素です。 過度の合成は、そばかす、肝斑、シミ、メラノーマなどの色素性皮膚疾患の形成を引き起こす可能性があります. したがって、チロシナーゼ活性の阻害に関する研究を通じて、皮膚の色素沈着を抑制する有効成分を選別することができ、カンカの総配糖体には皮膚の色素沈着を抑制し、美白効果があることがわかります。
キーワード:
ジンセノサイドRh23; 高麗人参; NMR; UPLC-QTOF/MS; ゼブラフィッシュ; 定量分析。
1.はじめに
オタネニンジン CA Meyer は、アジア諸国で非常に有名な伝統的な薬草です。 パナックスは「万能薬」に由来し、病気の万能薬を意味します。 P. ginseng は、ウコギ科に属する多年生の草本植物です [1]。 P. ginseng の 4 ～ 6 歳の根は、主に治療目的で使用されます。 6月に花が咲き、葉は口蓋形をしています。 P. ginseng は、主に韓国、中国、日本を含む東アジアで栽培されています [2]。 現在までに、高麗人参の根、葉、および果実の化学成分について多くの研究が報告されています。 100種類以上のジンセノサイドが分離されています。 免疫調節活性の増強、栄養強化、肝機能の改善、抗糖尿病、抗癌、抗アポトーシス、および抗酸化活性など、高麗人参のさまざまな生物活性が報告されています [3–10]。
現在、高品質の健康関連農産物への関心が徐々に高まっており、高麗人参の水耕栽培につながっています。 水耕栽培は、土耕栽培に比べて栽培工程が簡単で、生育期間が短いというメリットがあります。 水耕ニンジンは、温度を制御し、無農薬で、しっとりとして、軽く、有機成分などを含むシステムで、わずか 2 ～ 4 か月しか必要としません [11]。 土耕人参の葉は薬用や機能性野菜として利用されませんが、水耕人参の葉は利用できます。
In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]。 結論として、水耕条件は高いジンセノサイド含有量をもたらし、葉の総ジンセノサイド含有量は根よりも有意に高く、高麗人参の葉が機能性野菜と薬草の優れた供給源である可能性があることを示唆しています.
アルブチンやコウジ酸などのいくつかの既知の美白化合物は、メラニン形成の減少におけるそれらの有効性について調査されています [13]. 残念ながら、コウジ酸の発がん性の可能性と、アルブチンの安全性と副作用の両方のために、より安全で効果的な美白剤を見つける必要があります [14]. そのため、化粧品業界における新しい天然物の開発について、多大な注目が継続的に調査されてきました [15,16]。 いくつかの研究では、土壌で栽培された高麗人参からのメラニン合成の阻害が報告されています [17–20]。
ただし、これらの研究は桂皮酸やフェノール化合物などのよく知られた化合物で報告されており、水耕栽培の高麗人参 (HPGL) の葉からの美白活性は報告されていません。 私たちの進行中の作業は、HPGL からマイナーなジンセノサイドの分離につながりました. 通常、微量または微量のジンセノサイドは HPLC では検出できません。 そうしないと、分析時間が非常に長くなり、高麗人参香辛料のジンセノサイドの定性分析には適していません [21、22]。 新規化合物を迅速に定量するためには、微量の新規化合物を徹底的に検出できる迅速かつ高感度な方法を確立する必要があります。 本研究では、四重極/飛行時間型質量分析法 (UPLC-QTOF-MS) 法と組み合わせた高感度超高速液体クロマトグラフィーを確立して、新しい化合物を定量化しました。
上記の説明に基づいて、この作業では、物理的特性と定量化を含む新しい化合物の分離と同定が分光学的方法によって明らかにされ、それらの抗メラニン形成活性が in vitro および in vivo 系を通じて調査されました。
2. 結果と考察
水耕栽培のオタネニンジン (HPGL) の葉を MeOH 水溶液で抽出し、酢酸エチル (EtOAc)、n-ブタノール (n-BuOH)、および H2O 画分にそれぞれ分配しました。 n-BuOH 画分の SiO2 および ODS カラムクロマトグラフィーを繰り返すと、1 つの新しいジンセノサイド (1) が得られ、HPGL の EtOAc 画分から 1 つの希少なジンセノサイド (2) が分離されました。
化合物 1、白色粉末 (メタノール) は、10 パーセントの H2SO4 を噴霧し、加熱することにより、TLC で紫色を示しました。 分子式は、ネガティブ QTOF/MS の準分子イオンピーク m/z 713.44723 [M plus COOH]- から C37H64O10 であると決定されました。 IR スペクトルは、ヒドロキシル基 (3377 cm-1 ) と二重結合 (1647 cm-1 ) の存在を示唆しました。 1H-NMRスペクトル(表1および補足資料)は、2つのオレフィンメチンプロトンシグナル(δH 6.02、5.64)、3つの酸素化メチンプロトンシグナル(δH 4.38、4.03、3.49)、1つのメトキシプロトンシグナル(δH 3.18)、および8つを示しました。一重項メチル プロトン シグナル (δH 1.94、1.55、1.43、1.33、1.31、1.14、1.04、0.92) は、化合物 1 が 1 つのトランス構造の二重結合と 3 つのヒドロキシル基を含む四環式トリテルペン部分を持っていることを示します。
さらに、化合物 1 は、δH 1.94 (H-28) でのメチル プロトン シグナルの化学シフトから、プロトパナキサトリ オール (PPT) 型であることが確認されています。 プロトパナキサジオール (PPD) 型の H-28 の化学シフトは、通常約 δH 1.30 で観察されます [23]。 さらに、糖部分のシグナルとして、ヘミアセタールプロトンシグナル（δH 5.15）と、δH 4.45～3.95 のいくつかの酸素化メチンおよびメチレンプロトンシグナルが観察されました。 アノマー プロトン シグナルの結合定数 (J=7.6 Hz) から、糖部分のヘミアセタール プロトンと H-2 の両方が軸方向に配置されていました。 上記のデータの組み合わせにより、化合物 1 はプロトパナキサトリオール アミノグリコシドであると結論付けられました。 13C-NMR スペクトルは、トリテルペン、メトキシ、およびヘキソース部分による 37 炭素シグナルを示しました。 2 つのオレフィン メチン炭素 (δC 138.5 (C-24)、126.8 (C-23))、1 つの酸素化第 4 級炭素 (δC 74.9 (C-25))、3 つの酸素化メチン炭素 (δC 78.5 (C-3)、7{{90}}.3 (C-12)、67.7 (C-6))、1 つのメトキシ炭素 (δC 50.2 ( 25-OCH3))、および 8 個のメチル炭素 (δC 31.9 (C-28)、26.3 (C-27)、26.1 (C-26)、23.0 (C{{ 57}})、17.6 (C-18)、17.4 (C-19)、17.3 (C-30)、16.4 (C-29)) シグナルが観測されました。アグリコン部分。 化合物 1 の NMR データは、酸素化された 4 級炭素、すなわち C-25 の化学シフトを除いて、化合物 2 のデータと同様でした。 さらに、糖はヘミアセタール (δC 98.3、(C-10))、4 つの酸素化メチン (δC 78.9 (C-30)、78.2 (C{{82) }} )、75.2 (C-20 )、71.6 (C-40 ))、および 1 つの酸素化メチレン (δC 63.0 (C-60 ))。 勾配異核多重結合相関 (gHMBC) スペクトルでは、アノマー プロトン シグナル (δH 5.15 (H-10 )) とアグリコンの酸素化四級炭素シグナル (δC 83.0 (C -20))、-グルコピラノースが C-20 のヒドロキシルに結合していることを示しています (図 1)。
さらに、メトキシ プロトン シグナル (δH 3.18 (25-OCH3)) と酸素化された 4 級炭素シグナル (δc 74.9 (C-25)) の間の相関は、メトキシが C{{ 7}} (図 1)。 上記のデータに基づいて、1 の化学構造は 20-O- -D-グルコピラノシル-3 ,6 ,12 ,20 -テトラヒドロキシ-25-であると決定されました。メトキシダマル-23-エンで、ジンセノサイドRh23と名付けられました。 化合物 2 は、NMR と文献 [23、24] で報告されている MS データ (図 1)。 化合物 1 と 2 は、初めて、HPGL から分離されました。
ジンセノサイド Rh23 の純度は、UPLC 分析によって検出されたピーク面積の正規化によって 99% 以上であると決定されました。 UPLC-OTOF/MS はジンセノサイド Rh23 の同定に適したツールであることが証明されているため、HPGL 抽出物中の成分の分離は、負イオンモードの UPLC-OTOF/MS によって実行されました。 図 2 は、ジンセノサイド Rh23 と質量検出による抽出物の典型的な全イオンクロマトグラム (TIC) を示しています。
さまざまな濃度レベルでジンセノサイド Rh23 の線形検量線が得られました。 キャリブレーション プロットの特徴を表 2 にまとめます。表からわかるように、ジンセノサイド Rh23 は優れた相関係数を示します。 ジンセノサイド Rh23 の検出器カウント (相対ピーク面積) は、0.02–0.8 µg/mL の範囲でサンプル濃度に直線的に依存していました。 ジンセノサイド Rh23 の LOD は 0.002 ppm でした。 ジンセノサイド Rh23 の LOQ は、陰イオンモードの UPLC-QTOF/MS によって 0.005 ppm であると決定されました。 検証方法を使用して得られた HPGL 中のジンセノサイド Rh23 の量 (表 2) は、0.319 mg/g でした。
抗メラニン形成活性を決定するために、精製され同定された化合物で処理されたメランα細胞におけるメラニン含有量の変化が研究された。 Melan-a 細胞を化合物 1 および 2 で 0 から 80 µM の範囲の濃度で 72 時間処理し、細胞生存率を CCK-8 細胞生存率アッセイ キットで評価しました。 melan-a 細胞に対する 80 μM 濃度での化合物 1 および 2 の細胞生存率は、それぞれ 98.1% および 97.8% を超えていました (データは示していません)。 これらの結果は、化合物１および２が非細胞毒性を有することを示した。 化合物の抗メラニン生成活性の効果を図 3 に示します。20、40、および 80 μM での化合物 1 のメラニン合成の阻害は、対照と比較して 8.4%、15.6%、および 37.0% でした。 化合物 2 は、20、40、および 80 μM で、それぞれ 7.6%、12.8%、および 17.8% で、化合物 1 よりもわずかに低い阻害活性を示しました。 両方の化合物は、用量依存的にメラニン合成を阻害しました。
特に、化合物 1 は最高のメラニン抑制活性を示し、80 μM 濃度で 37.0 パーセントでした。 伝えられるところによると、0～1000 µg/mL の基数人参の抽出物は、メラニンの有意な阻害を示さず [19]、主に P. ginseng に含まれる美白剤である桂皮酸は、675 µM でメラニン合成の 29% の阻害を示しました。 [20]。 化合物 1 は、根参抽出物および桂皮酸と比較して強力なメラニン合成阻害活性を示し、クマル酸と比較して 8 倍低い濃度で 1.2- 倍のメラニン合成阻害活性を示した [ 17,20]。
ゼブラフィッシュは、その器官系と遺伝子配列が人間と類似しているため、非常に有利な脊椎動物モデル生物です [25]。 さらに、動物実験の代替法としてゼブラフィッシュ胚の利用が注目されている[26]。 ゼブラフィッシュは表面にメラニン色素を持っているため、複雑な実験手順を必要とせずに色素沈着プロセスを簡単に観察できます [27]。
したがって、ゼブラフィッシュの色素沈着に対する化合物1のメラニン抑制効果を調査しました。 PTU (N-フェニルチオ尿素; 硫黄含有チロシナーゼ阻害剤) を陽性対照として使用しました (図 4B)。これはゼブラフィッシュ研究で広く使用されています [28,29]。 図 4C、D、40、および 80 μM で化合物 1 を処理すると、ゼブラフィッシュの体の色素沈着が著しく抑制され、対照車両と比較して総メラニン含有量が著しく減少しました (図 4A)。
この研究では、新規ジンセノサイド Rh23 (1) を水耕栽培の P. ginseng 葉から分離しました。 これまでに100以上のジンセノサイドが高麗人参種から報告されています. しかし、25-ヒドロキシル化ジンセノシドは高麗人参を含め、自然界にはめったに存在しません。 さらに、美白活性は報告されていませんでした。 ジンセノサイド Rh23 の阻害活性は、80 μN 濃度で 37% を示し、メラン a 細胞の細胞毒性はありませんでしたが、ジンセノサイド Rh23 による in vitro キノコチロシナーゼ活性の阻害は観察されませんでした (データは示していません)。 最近、高麗人参の根と葉からの抽出物または精製されたジンセノシドは、抗酸化特性を広く有することが示されていますが (30,31)、高麗人参の水または有機抽出物は、DPPH、スーパーオキシドアニオン、およびヒドロキシルラジカルに対する除去活性を示しました (32)。 したがって、水耕栽培の P. ginseng の葉から分離された新規ジンセノサイド Rh23 は、その抗酸化特性によってチロシナーゼをダウンレギュレートしている可能性があります。 ただし、そのメラニン形成の役割はまだ調査されていません。 したがって、さらなる研究では、メラニン合成の調節に対するジンセノサイドRh23作用の正確なメカニズムを決定する必要があります.
3.実験的
3.1. 全般的
Kieselgel 60 および LiChroprep RP-18 樹脂をカラムクロマトグラフィーに使用しました (Merck, Darmstadt, Germany)。 Kieselgel 60 F254 (Merck) および RP-18 F254S (Merck) を TLC 実験用の固相として使用しました。 TLC プレート上のスポットの検出は、UV ランプ (Spectroline、モデル ENF-240 C/F、Spectronics Corp.、ニューヨーク、ニューヨーク、米国) の下での観察によって、または現像されたプレートに 10% の H2SO4 水溶液を噴霧することによって実行されました。プレートに続いて加熱します。 旋光度は、JASCO P-1010 デジタル旋光計 (東京、日本) を使用して測定しました。 融点は、Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher Scientific company、米国ペンシルバニア州ピッツバーグ) を顕微鏡で使用して取得しました。 紫外スペクトルは、Shimadzu モデル UV-1601 分光光度計 (Shimadzu Corp.、京都、日本) で測定しました。 ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ ＦＴ－ＩＲ分光計（バッキンガムシャー、英国）から得た。 NMRスペクトルは、Varian Inova AS 400分光計（400 MHz、Varian、Palo Alto、CA、USA）で記録されました。 UPLC-QTOF/MS 分析は、負イオン モードで動作する Waters Xevo G2-S シリーズ (Waters Corp.、Milford、MA、USA) を使用して実行されました。
3.2. 植物材料
水耕栽培オタネニンジンは、大韓民国農村開発庁が作成した「高麗人参 GAP 標準栽培ガイド」[11,33] のプロトコルに従って、忠北道陰城にある薬草研究部の温室で栽培されました。 0.8 ～ 1 g の 1 歳の高麗人参の苗の根を、国立園芸および薬草科学研究所 (NIHHS)、農村開発局 (RDA) の薬草研究部門から購入し、使用前にチャンバーを低温 (1 ～ 2 ℃) にします。 高麗人参の苗の根を養液槽に移植し、水耕栽培システムで培養した。 3ヶ月の培養後、水耕人参を収穫のために引き抜いた. 収穫した水耕人参植物を水でほこりを洗い流し、葉と根に選別し、凍結乾燥機（FD8512、Ilshin Biobase Co.、Yangju、Korea）で72時間乾燥させました。 証拠標本 (NIHHS14-03) は、大韓民国、ウムソン、NIHHS、RDA のハーブ作物研究部門の植物標本館に寄託されました。
3.3. 抽出と分離
水耕栽培の P. ginseng (HPGL、6 kg) の乾燥および粉末化された葉を、室温で 24 時間、80% MeOH (30 L × 3) で抽出しました。 抽出物を濾紙で濾過し、45 ℃で減圧蒸発させて、1.4 kg の抽出物を得ました。 抽出物をＨ２Ｏ（３Ｌ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３Ｌ×３）およびｎ−ＢｕＯＨ（２．６Ｌ×３）で順次抽出した。 各層を減圧下で濃縮して、ＥｔＯＡｃ（７５ｇ）、ｎ−ＢｕＯＨ（４７０ｇ）、およびＨ ２ Ｏ（８５５ｇ）画分を得た。
n-BuOH 画分 (HPGLB, 130 g) をシリカゲルカラム (φ 13 × 17 cm) にアプライし、CHCl3-MeOH-H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) 20 画分 (HPGLB1 から HPGLB20) を生成します。 画分 HPGLB3 と HPGLB4 を合わせ (18.9 g、Ve/Vt=0.05–0.12)、さらにシリカゲルカラム (φ 8 × 15 cm、 CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1、14 L) から 14 の画分 (HPGLB3-1 から HPGLB3-14) が得られます。 分画 HPGLB3-4 と HPGLB3-5 を合わせ (1.27 g、Ve/Vt {{40}.09–0.16)、ODS カラム (φ 4 × 7 cm、MeOH–H2O=2:1、2.6 L) から 9 つの画分 (HPGLB3-4-1 から HPGLB3-4-9) が得られます。 Fraction HPGLB3-4-3 (119.4 mg、Ve/Vt=0.14–0.26) を ODS カラム (φ 2.5 × 7 cm、MeOH–H2O=1:1, 1) でさらに分画しました。 L) 化合物 1 (HPGLB3-4-3-7、10.5 mg、Ve/Vt=0.42–0.55、TLC Rf を含む 9 つの画分 (HPGLB3-4-3-1 から HPGLB3-4-3-9) を得る= 0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (キーゼルゲル 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)))。 HPGLB5 から HPGLB7 の画分を合わせ (24.0 g、Ve/Vt=0.12–0.22)、さらにシリカゲルカラム (φ 7 × 12 cm、CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1、10 L → 6:4:1、9 L) 16 画分 (HPGLB5-1 から HPGLB5-16) を生成します。 Fraction HPGLB5-6 (323.1 mg、Ve/Vt=0.28–0.31) を ODS カラム (φ 3 × 14 cm、MeOH–H2O=3:2、1.2) でさらに分画しました。 L → 3:1、1.5 L) 化合物 2 (HPGLB5-6-5、10.1 mg、Ve/Vt=0 を含む 10 の画分 (HPGLB5-6-1 から HPGLB5-6-10) を得る.21–0.23、TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S、MeOH–H2O=2:1)、Rf=0.45 (キーゼルゲル 60 F254、CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1))。
3.4。 分光データ
化合物 1. 白色粉末、mp: 138–140 ℃; [ ] 25 D プラス 17.4◦ (c=0.39、MeOH); IR (CaF2 ウィンドウ): 3377、2932、1382 cm−1。 負の QTOF/MS m/z 713.44723 [M プラス COOH]− (C37H64O10 の計算値、668.4499)。 1H-および 13C-NMR データは、表 1 を参照してください。
化合物 2. 白色粉末、mp: 133–136 ℃; [ ] 25 D プラス 20.2◦ (c=0.50、MeOH); IR (CaF2 ウィンドウ): 3359、2929、1384 cm−1。 ネガティブ QTOF/MS m/z 699.48311 [M plus COOH]− (C36H62O10 の計算値、654.4323); 1H-および 13C-NMR データ、表 1 を参照。
3.5。 UPLC-QTOF/MSを用いた新規化合物1の定量分析
化合物 1 の標準原液は、それぞれ 1.00 mg を 1 mL のメタノールに溶解して 1.00 mg/mL の濃度になるように調製し、4 ℃ で保存しました。 標準ストック溶液 (1) をメタノールで希釈して、それぞれ 0.{{10}}2–0.8 µg/mL の範囲のキャリブレーション溶液を得ました。 1 グラムの HPGL 抽出物を正確に量り、一定量 (10 mL) のメタノールに溶解し、0.20 mm のろ紙でろ過し、4 ℃ で冷蔵しました。 . UPLC は、ACQUITY BEH C18 カラム (2.1 × 100 mm、1.7 µm) を備えた Waters ACQUITY H-Class UPLC (Waters Corp.、Milford、MA、USA) を使用して実行されました。 移動相は、0.1 パーセントのギ酸 (v/v) を含む水 (A) と 0.1 パーセントのギ酸 (v/v) を含むアセトニトリル (B) で構成されていました。 溶出勾配は次のとおりです。0 ～ 4 分、B 10 ～ 30 パーセント。 4 ～ 15 分、B 30 ～ 60% ; 15 ～ 16 分、B 60 ～ 100% ; 16 ～ 19 分、B 100 ～ 10% 。 流速は 0.45 mL/min で、各ランの注入量は 2 µL でした。
次に、陰イオンモードで動作する Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp.、Milford、MA、USA) を使用して、HR-MS 分析を実行しました。 質量分析計は、MSE 取得モードとして知られる高エネルギーと低エネルギーのスキャンを交互に実行しました。 正確な質量測定値は、ロイシン エンケファリン、m/z 554.262 (ESI ネガティブ モード) を内部参照として含む自動キャリブレーション デリバリー システムを使用して得られました。 最適な操作パラメーターは、表 3 に示すように設定されました。
3.6. 細胞培養
Melan-a メラノサイトは、C57BL/6 マウスに由来する高度に色素沈着した、不死化した正常なマウス メラノサイト細胞株です。 この研究で使用したメラン a 細胞は Dr. Dorothy Bennett (St. George's Hospital, London, UK) から入手しました。 細胞は、10% の熱不活化ウシ胎児血清、1% のペニシリン/ストレプトマイシン、および 200 nM PMA を最終濃度に添加した RPMI 1640 培地中、空気 95%、CO2 10% の雰囲気で 37 ℃ で培養しました。 細胞生存率は、CCK-8細胞計数キット-8 (Dojindo Lab.、熊本、日本) によって決定されました。
3.7. メラニンアッセイ
Melan-a 細胞を化合物で 72 時間処理した後、細胞を 1 N NaOH に 60 ℃で 30 分間溶解しました。 次に、溶解物を分光光度計を使用して450 nmで測定しました。 データは、細胞溶解物のタンパク質含有量に対して正規化されました。 その後、BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific Inc.、ロックフォード、イリノイ州、米国）を使用してタンパク質濃度を決定するために、細胞溶解物を処理しました。
3.8。 親魚の起源と維持
成体のゼブラフィッシュは業者から入手し、10 ～ 15 匹の魚を 5 L のアクリル タンクに次の条件で保管しました: 28.5 ℃、14/10 時間の明/暗サイクル。 ゼブラフィッシュには、生きたブラインシュリンプ (アルテミア サリナ) を補充した TetraMin フレーク食品を 1 日 3 回、週 6 日与えました。 胚は、朝にライトをオンにして誘発された自然産卵から得られました。 胚の収集は 30 分以内に完了しました。 すべての実験プロトコルと手順は、承認され、忠南国立大学の動物倫理委員会 (CNU-00866) の承認されたガイドラインと規則に従って実施されました。
3.9。 化合物治療と表現型に基づく評価
同期胚を収集し、ピペットで並べました（1 mLの胚培地を含む24-ウェルプレートのウェルあたり7〜9個の胚）。 試験化合物を 0.1 パーセント DMSO に溶解し、受精後 (hpf) 9 ～ 72 時間 (曝露 63 時間) に胚培地に添加しました。 ゼブラフィッシュの色素沈着への影響は、実体顕微鏡下で観察されました。 時折の攪拌と培地の交換を毎日行い、化合物が均一に分布するようにしました。 すべての実験で、0.2 mM 1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) を使用して、発生過程に干渉することなく透明なゼブラフィッシュを生成し [33]、標準的なポジティブ コントロールと見なされました。 体の色素沈着の表現型ベースの評価は、鉗子で剥離し、メタンスルホン酸トリカイン溶液 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で麻酔し、35 mm ディッシュ (SPL Lifesciences、Pocheon、韓国) の 3% メチルセルロースにマウントしました。実体顕微鏡 MZ16 (ライカ マイクロシステムズ GmbH、ヴェッツラー、ドイツ) で撮影。
4. 結論
この研究では、ジンセノサイド Rh23 (1) が 20-O- -D-グルコピラノシル-3 ,6 ,12 ,20 ,25- と一緒にハイドロフォニック オタネニンジンの葉から分離されました。ペンタヒドロキシダマー-23-エン (2)。 水耕栽培の高麗人参から化合物の色素沈着低下効果を得ようとする試みは、概ね成功しています。 ジンセノシド Rh23 および 20-O- -D-グルコピラノシル-3,6,12,20,25-ペンタヒドロキシダマ23-エンは、細胞毒性の影響なしにメラニン生合成を阻害しますメランA細胞で。 さらに、ジンセノサイド Rh23 は、代替動物モデルとしてゼブラフィッシュの色素脱失を強化しました。 体内のメラニン含有量と色素沈着の減少は、美白活性の可能性を秘めている可能性があり、安全性が化粧品の美白剤の主な考慮事項であるため、非細胞毒性効果がより好ましい点です.
したがって、私たちの現在の結果に基づいて、新規のハイドロフォニック P. ginseng 化合物を潜在的な効果的な皮膚照明剤として使用できることが重要です。 今後の研究により、メラニン合成の調節に対するジンセノサイド Rh23 作用の正確なメカニズム、およびジンセノサイド Rh23 の構造的特徴とメラニン形成との関係が解明され、それが化粧品業界の潜在的な美白剤であるかどうかが確認されます。 ハイブリッド Q-TOF 質量分析法の利点には、高品質の検出能力と感度だけでなく、正確な測定が含まれ、構造の解明が容易になります。 微量または新規化合物の定性的および定量的測定に使用でき、高麗人参香辛料の品質管理を改善するのに役立ちます。
補足資料:
1 の 1H-NMR および 13C-NMR スペクトルは、補足資料で入手できます。
謝辞:
この作業は、「農業科学技術開発のための共同研究プログラム」(PJ01136203)、農村開発局、韓国の支援を受けて行われました。 ゼブラフィッシュ施設を共有してくれた Cheol-Hee Kim (忠南国立大学) に感謝します。
著者の貢献:
DYL と N.-IB は実験を考案し、設計しました。 H.-GK と Y.-GL が化合物を分離しました。 DYL は構造を解明しました。 I.-BJ は、植物材料の準備に貢献しました。 JHKは生物学的アッセイを実施し、原稿の作成を支援しました。 JWL と B.-RC がサンプルの NMR と UPLC-QTOF/MS を実行しました。 G.-SK は原稿の改訂を支援しました。 DYL は論文を書き、研究プロジェクトを管理しました。 すべての著者は、最終原稿を読み、承認しました。
利益相反:
著者は利益相反を宣言していません。 創設スポンサーは研究のデザインに何の役割も持っていませんでした。 データの収集、分析、または解釈。 原稿の執筆; または結果を公開する決定。
参考文献
1.ベン、EW。 マイケル、W. 世界の薬用植物。 Shinilbooksで; Timber Press Inc.: ポートランド、オレゴン州、米国、2007 年。
2.JDパーク。 リー、DK。 Lee, YH Panax ginseng CA Meyer からのサポニンの生物活性と化学。 植物化学 2005, 4, 159–175. 【相互参照】
3.クォン、SJ; Chung, DK 山衣人参、山岳人参、朝鮮人参の免疫力増強効果。 Ｊ．オリエント． 神経精神医学 2004, 15, 89–101.
4. Gillis, CN Panax ginseng の薬理学: 一酸化窒素のリンク? 生化学。 薬理学。 1997, 54, 1–8. 【相互参照】
5.カン、KS; 山部 直彦; キム、HY; 横澤 T. ラットのリポ多糖誘発性肝障害に対するサンニンジン メタノール抽出物の効果。 フィトメディシン 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]
6. Jiang、S.; レン、D。 李、J。 元、G.; リー、H.; 徐、G.; ハン、X。 デュ、P。 An, L. 2型真性糖尿病のラットにおける高血糖症およびインスリン抵抗性に対する化合物Kの効果。 フィオテラピア 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]
7.キム、HS。 リー、ええ。 コ、SR; 崔、KJ。 パーク、JH。 Im, DS 前立腺癌細胞の増殖に対するジンセノサイド Rg3 および Rh2 の効果。 アーチ。 薬。 解像度 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]
8. Nocerino、E.; Amato, M.; Izzo、AA 高麗人参の媚薬と強壮作用。 フィトテラピア 2000, 71, S1–S5. 【相互参照】
9. Keum、YS; パーク、KK。 リー、JM。 チュン、カンザス州; パーク、JH。 リー、SK; クォン、HJ; Surh, YJ 加熱処理された高麗人参のメタノール抽出物の抗酸化および抗腫瘍促進作用。 キャンサーレット。 2000, 150, 41–48. 【相互参照】
10.キム、GS。 リー、SE。 いいえ、HJ; クォン、H.; リー、SW; キム、SY。 Kim, YB エアロポニック システムで培養されたオタネニンジンの成長とジンセノサイド含有量に対する天然の生理活性物質の影響。 Ｊ．Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒｅｓ． 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]
11.崔、SY。 チョー、CW; リー、YM。 キム、SS; リー、SH; Kim, KT 水耕栽培された高麗人参の葉、果実、根のジンセノサイドとフェノール成分含有量の比較。 Ｊ．Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒｅｓ． 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]
12. 松田 浩。 中村 誠; 久保正明. 天然由来のキューティクル ドラッグの研究. Ⅱ． メラニン生合成に対するプルナス植物の阻害効果。 生物。 薬。 ブル。 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]
13.ダンカン、CL。 Foster, EM 嫌気性胞子の発芽および成長に対する亜硝酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および硝酸ナトリウムの影響。 アプリケーション 微生物。 1968, 16, 406–411. [PubMed]
14. 清水浩二; 安武 誠； 近藤 亮. クロロフォラ由来のチロシナーゼ阻害活性を有する新規スチルベンが優れている. 化学。 薬。 ブル。 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]
15. SH、パーク。 キム、DS; キム、WG; リョウ、IJ; リー、DH; ええ、CH; ユン、SW; ID ユー。 Park, KC Terrin: 新しいメラニン形成阻害剤とそのメカニズム. 細胞。 モル。 ライフ 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]
16.コング、YH; ジョー、ヨ。 チョー、CW; 息子、DW。 パーク、SJ。 ロー、JH。 Choi, SY 皮膚のメラニン生合成に対する桂皮酸の阻害効果。 生物。 薬。 ブル。 2008、31、946–948。 [CrossRef] [PubMed]
17.黄、EY; Choi, SY パナックス人参 CA Meyer のさまざまな部分に含まれるフェノール化合物の定量分析と、メラニン生合成に対するその阻害効果。 韓国のＪ．Ｍｅｄ． 作物科学。 2006, 14, 148–152.
18.イム、SJ。 キム、KN。 ユン、YG。 リー、JC。 ムン、YJ; キム、JH。 Woo, WH 基数人参と基数 trichosanthis のメラニン形成への影響。 生物。 薬。 ブル。 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]
19.黄、EY; コング、YH; リー、YC。 キム、YC; ユー、KM; Jo, YO 白参と紅参のフェノール化合物の含有量とメラニン生合成抑制効果の比較。 Ｊ．Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒｅｓ． 2006, 30, 82–87.
20.張、YC; パイ、ZF。 Liu、CM。 ソング、FR; Liu、ZQ; Liu, SY HPLC-ESI-MS/MS による高温で蒸したオタネニンジン中の低極性ジンセノサイドの分析。 化学。 解像度 顎。 大学 2012, 28, 31–36.
21.謝、YY; ルオ、D.; チェン、YJ。 Ma、JF。 王、YM。 Liang、QL。 Luo, GA HPLC-ESI-MS/MSn ベースの多成分定量フィンガープリントを使用した、オナガニンジン由来の紅参の蒸しによる化学変化と全体的な品質評価。 Ｊ．Ａｇｒｉｃ． 食品化学。 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]
22.リウ、GY。 Li、XW。 ワン、NB; 周、HY; 魏、W。 グイ、MY; ヤン、B。 Jin, YR Panax ginseng CA Meyer の葉からの 3 つの新しいダンマラン型トリテルペン サポニン。 Ｊ．Ａｓｉａｎ Ｎａｔ． 製品 解像度 2010 年 12 月 865–873。 [CrossRef] [PubMed]
23. Xing、Q。 Liang、T。 シェン、G。 王、X。 ジン、Y.; Liang, X. Panax notoginseng のサポニン分析のための質量分析検出を備えた包括的な HILIC x RPLC。 アナリスト 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]
24.ラブ、DR; ピヒラー、FB。 ドッド、A。 コップ、BR; Greenwood、DR ハイスループット スクリーンのテクノロジー: ゼブラフィッシュを使用した現在と未来。 現在。 意見。 バイオテクノロジー。 2004、15、564–571。 [CrossRef] [PubMed]
25. Uwe, S.; ステファン、S。 Pobert、G.; ペトラ、Ｇ． ヘナー、H。 セパンド、R.; アクセル、S。 イングリッド、S.; カーステン、W.; ヒルダ、W。 ら。 動物実験の代替手段としてのゼブラフィッシュ胚 - 動物福祉規制における保護されたライフステージの開始の定義に関する解説. 再現。 有毒。 2012, 33, 128–132.
26.タイ、チオ。 キム、JH。 コ、DH; キム、CH; 黄、JS。 アン、S。 キム、SY。 キム、CD。 リー、JH。 Yoo, TJ ゼブラフィッシュは、メラノゲン生成調節化合物の表現型ベースのスクリーニングの新しいモデルです。 色素細胞解像度。 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]
27.エルサリーニ、OA。 Rohr, KB フェニルチオ尿素は、ゼブラフィッシュの発生において甲状腺機能を混乱させる。 開発者 遺伝子進化。 2003、212、593–598。 [PubMed]
28.リー、DY。 チャ、BJ; リー、YS。 キム、GS。 いいえ、HJ; キム、SY。 カン、HC; キム、JH。 Baek, NI メラニン形成の阻害剤としてのオタネニンジンの葉から分離された微量ジンセノシドの可能性. 内外 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]
29.李、J。 黄、M。 テオ、H.; 男、RY Panax quinquefolium サポニンは、低密度リポタンパク質を酸化から保護します。 生命科学 1999, 64, 53–62. 【相互参照】
30.李、TSC; マッツァ、G.; コットレル、AC; Gao, L. アメリカ人参の根と葉に含まれるジンセノサイド。 Ｊ．Ａｇｒｉｃ． 食品化学。 1996, 44, 717–720. 【相互参照】
31.ユング、CH; ソグ、HM; 崔、IW。 パーク、MW; Cho, HY 山参の葉から抽出した様々な溶媒抽出物の抗酸化特性。 LWT 2006, 39, 266–274. 【相互参照】
32. 国立作物科学研究所。 高麗人参GAP標準栽培ガイドライン; 作物科学研究所、農村開発庁: 水原、韓国、2009.
33.カールソン、J。 フォン・ホフステン、J.; Olsson, PE 透明なゼブラフィッシュの生成: 胚発生中の遺伝子発現の検出を改善する洗練された方法。 3 月 Biotechnol。 2001、3、522–527。 [CrossRef] [PubMed]
サンプルの入手可能性:
化合物 1 と 2 のサンプルは、著者から入手できます。
イ・デヨン 1 ID 、キム・ヒョングン 2 、イ・ヨングン 2 、キム・ジンヒ 3 、イ・ジェウォン 1 ID 、チェ・ボラム 1 、チャン・インベ 1 、キム・スグ 1 、ナムインペク 2,*
1 国立園芸およびハーブ科学研究所、ハーブ作物研究部門、RDA、Eumseong 27709、韓国; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)
2 東洋医学バイオテクノロジー学科、慶熙大学、龍仁 17104、韓国。 zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)
3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com
受領日: 2017 年 11 月 28 日。 承認済み: 2018 年 1 月 26 日。 公開日: 2018 年 1 月 29 日
For more information:1950477648nn@gmail.com
