炎症性腸疾患の治療におけるサイスチェデザイトコラのメカニズムの予測と検証ⅰ
Nov 15, 2024
抽象的な
客観的のメカニズムを調査する炎症性腸疾患の治療におけるCistanche Destericola（IBD）。
方法アクティブC. sertericolaのコンポーネントTCMSPと文献レポートに基づいてスクリーニングされました。有効成分のターゲットは、スイスのターゲット予測プラットフォームを介して取得されました。その後、疾患の標的は、GeneCardsとOmimデータベースを検索することにより得られました。 PPIネットワークと「ドラッグコンパウンドディジーゼターゲット」ネットワークが構築されました。コアコンポーネントとコアターゲットがスクリーニングされました。 GOおよびKEGG濃縮分析が実行され、コアターゲットとコアコンポーネントのために分子ドッキング検証が実施されました。 IBDマウスモデルは確立され、モデルグループ、ポジティブコントロールグループ（デキサメタゾン、0。4mg/kg）に分割され、C.デザイトコラ抽出グループ（1 0 0、2 0 {0、4 0 0 mg/kg）;空白のコントロールグループが設定され、各グループに8匹のマウスがありました。各グループには、1日1回、7日間連続して関連する薬が与えられました。疾患活動性の指数（DAI）スコアと結腸長が計算され、マウスの結腸の病理学的形態が観察されました。炎症性因子のレベル[Interleukin -6（Il -6）、IL1、IL -10、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、腫瘍壊死因子（TNF-）、結腸組織のタンパク質発現が検出されました。結果、IBDの治療におけるC. destericolaの合計39の有効成分と232の潜在的標的が得られました。 IBDのC. destericolaの処理は、ケルセチン、シラクトン、 - シトステロール、シスタノシドHなどのコア成分、およびTNF、AKT1、STAT3、EGFR、SRCなどのコアターゲットに関連している可能性があります。 GOおよびKEGG経路分析は、IBDの治療におけるC. destericolaの生物学的プロセスは、主にタンパク質のリン酸化と、主にPI3K/AKTおよびEGFRチロシンキナーゼ阻害剤耐性シグナルシグナル化経路を含むアポトーシスの陰性調節に関連していると予測しました。分子ドッキングの結果は、C。デザイトコラのコア成分とコアターゲット間の結合エネルギーが－4.7 kJ/mol未満であることを示しました。動物の実験結果は、C。destericola抽出物との介入後、マウスの体重と結腸の長さが大幅に増加することを示した（p＜ {0。0} 5またはp ＜0。結腸粘膜のうっ血と浮腫が大幅に減少し、結腸組織の病理学的スコアが有意に減少しました（P ＜0.05またはP ＜0.01）。 IL -6、IL -1、MPOおよびTNF-のレベル、およびPI3Kのタンパク質発現、PI3K（P-PI3K）、EGFR、TNF-、STAT3、PhosphORylated STAT3結腸組織では大幅に減少しました（P ＜0.05またはP ＜0.01）が、モデルグループではIL -10のレベルが有意に増加しました（P ＜0.01）。結論C. Destericolaは、SRC/EGFR/PI3K/AKTシグナル伝達経路を調節することにより、IBDを緩和する可能性があります。
キーワードCistanche Deserticola; 炎症性腸疾患;ネットワーク薬理学;分子ドッキング;実験的検証
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炎症性腸疾患（IBD）は、2つのサブタイプを含む胃腸管の慢性、非特異的、炎症性疾患の一般的な用語です：クローン病と潰瘍性大腸炎[1]。 IBDは、私の国の消化器系の一般的で困難な病気の1つであり、基礎研究の焦点、ホットスポット、難易度と消化器系疾患の治療でもあります。過去20年間で、私の国でのIBDの発生率は年々増加しており、2025年までに150、000に達すると予想され、アジアで1位にランクされています[2]。
一般に、遺伝的感受性、環境要因、免疫機能障害、腸内細菌叢の変化、および腸粘膜バリア機能障害がIBDの発生と発達の主な原因であると考えられています[3]。 IBDの臨床治療は、主に薬物療法に基づいており、主にアミノサリチル酸、抗生物質、コルチコステロイド、免疫抑制剤を含む[4]。しかし、上記の薬物は複数の副作用を引き起こす傾向があり、患者は長期使用後に耐性を発症し、薬物を止めた後に再発しやすい[5]。
私の国の従来の優れた資源として、漢方薬は、慢性疾患の治療における明確な有効性、低再発率、およびほとんど副作用の利点があります。 「砂漠の高麗人参」としても知られるシスチャン・デザイトコラは、サイスンチェ・デザイトコラ・YCマまたはシスタンチェの浴槽のうろこ状の葉を持つ乾燥した肉質の茎に由来しています
（シェンク）ワイト、オロバンチャ科の植物。それは新jiangのユニークで有利な薬用資源です。主に、フェニルエタノイドグリコシドやテルペンなどの有効成分が含まれています。腎臓を調整し、陽を強化し、腸を湿らせ、便秘を緩和する効果があり、腸疾患の治療に広く使用されています[{6-7]。フェニルエタノイドグリコシドは、2020年版の中国の薬局方（パートI）で指定されているように、Cistanche Destericicolaの識別と含有量の決定のためのインジケータ成分です。
炎症性腸のサイスチェ
（主にエキナコシドとヴァバスコシド）[8]。研究では、腸上皮細胞増殖を促進し、細胞アポトーシスを阻害することにより、エキナコシドがマウスの大腸炎を改善できることが示されています[9]。ベルバスコシドは、フリーラジカルスカベンジャーとしてラットの大腸炎の進行を遅くすることができます[10]。 Cistanche Deserticolaの総グリコシドは、炎症因子の発現を阻害することにより、IBDを予防および治療することができます[11]。ただし、Cistanche Destericicolaの化学成分が、ターゲットとシグナルの経路を介してIBDで治療上の役割を果たす研究はありません。
この目的のために、この研究は、分子ドッキングテクノロジーと組み合わせたネットワーク薬理学を通じてIBDの治療におけるCistanche Destericicolaの作用の潜在的な作用メカニズムを予測し、薬力学によって予測された結果を検証し、Cistanche Mathicolaの分子メカニズムを体系的に明確に明確にします。
1つの材料
1.1実験動物
この研究で使用された動物は、雄のSPFグレードのC57BL/6マウスで、合計48個のマウスであり、新jiang医科大学の動物実験センターから購入し、18-20 gの重量18-20 gで、SCXK（new）2023-0004 2023-0004 2023-0004と実験的な動物の使用免許証の数{{6）マウスは、（22±2）程度の温度、50％-70％の相対湿度、12- hサイクル照明の環境に保管されていました。この研究は、新jiang医科大学の実験動物倫理委員会の動物福祉と倫理的要件に厳密に準拠しています（承認番号20210301-177）。
1.2主要な薬物と試薬
Cistanche Extract（ce;純度は85％以上、エキナコシドは40％以上、ベルバスコシドは16％以上、バッチ番号20230103）はXinjiang Hetianから購入しましたDichen Pharmaceutical Biotechnology Co.、Ltd。;
ウェシスタンチの本部ヘティアン・ディシェン・サイスチェ基地
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デキストラン硫酸ナトリウム（DSS、相対分子量36、000-50、000、バッチ番号C16013701）は、上海マクリーン生化学技術株式会社から購入しました。糞便の血液定性検出キット（バッチ番号ML1095013）は、Shanghai Elisa Biotechnology Co.、Ltd。から購入しました。デキサメタゾン参照物質（98％以上、バッチ番号54231207002以上）は、Beijing Solebaugh Technology Co.、Ltd。から購入しました。腫瘍壊死因子 - （TNF-）、インターロイキン6（インターロイキン-6、IL {-6）、IL -10、IL -1、ミエロペロキシダーゼ（MPO）エンジムリンクイムノーベントアッセイKITS（15}） 88-7064、88-7105、88-7013、emmpo）は、米国Invitrogenから購入しました。ウサギTNF-、プロテインキナーゼB1（AKT1）、リン酸化AKT1（P-AKT1）、転写3（STAT3）のシグナル伝達と活性化因子、リン酸化STAT3（P-STAT3）、表皮成長因子受容体（EGFR）、非受容体ティロシンキナーゼ（SRC）、Phosphoinitided 3-キナーゼ（PI3K）、リン酸化PI3K（P-PI3K）、および西洋ワラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG二次抗体（ロット数GB11188、GB11689、GB150002、GB1176、GB156、GB156、GB156、 GB112343、GB112544、GB11525、およびGB23303、それぞれ）は、Wuhan Saiweier Biotechnology Co.、Ltdから購入しました。
1.3主要な楽器
この研究で使用されている主な機器には、Multiskan GOフル波長マイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific、USA）、RM2016 Pathology Slicer（Leica Instruments、Shanghai）、Gel.Doc.xr Gel電気泳動イメージング分析システム、およびミニトランスブロットタンパク質のブロッティング機器（米国BIO-RAD）が含まれます。
2つの方法
2.1ネットワークの薬理分析
2.1.1有効成分とターゲットの予測
The active ingredients of Cistanche deserticola were screened using the TCMSP platform (http://lsp.nwu.edu.cn/) (with oral availability ≥30% and drug-like properties ≥0.18 as screening conditions) [12], and the active ingredients of Cistanche deserticola with anti-IBD effects reported in the literature were supplemented. The Swiss Target Prediction platform was used to search for the active ingredient targets of Cistanche deserticola (probability parameter>0）、そして複製を除去した後、Cistanche Destericicolaの有効成分ターゲットが得られました。 「炎症性腸疾患」を検索用語として使用して、疾患の標的はGeneCardsデータベース（http://www.genecards.org/）およびomimデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/omim）から収集され、潜在的な標的はDeplicatesを削除した後に入手しました。
2.1.2 Venn図図面および「薬物指数ターゲットディジーゼ」インタラクティブネットワーク構造
Venny 2.1オンライン分析ツールを使用して、Cistanche Deserticolaの有効成分ターゲットを潜在的なターゲットと交差させ、IBDの治療のためにCistanche Destericicolaの潜在的なターゲットを取得しました。 Cytoscape 3.9.1ソフトウェアを使用して、「薬物凝集体型標的」のマルチレベルネットワーク図を作成し、トポロジ分析を実行しました。最高値の上位4つのコンポーネントは、IBDの治療のためのCistanche Destericolaのコアコンポーネントとして選択されました。
2.1.3タンパク質間相互作用ネットワーク図
The potential targets of Cistanche deserticola for the treatment of IBD were imported into the STRING database (http://string-db.org/), the species was limited to "Homo sapiens", the interaction score was limited to >0。上位5度の値を持つターゲットは、コアターゲットとして取得されました。
2.1.4潜在的なターゲットの関数および経路濃縮分析
IBDの治療のためのCistanche Destericicolaの潜在的なターゲットは、遺伝子オントロジー（GO）および京都百科事典（KEGG）の経路分析のためにDavidデータベース（https://david.ncifcrf.gov）にインポートされ、ミクロシエンス情報オンラインプラットフォームを使用して視覚化された視覚化されました。 （https://www.bioinformatics.com.cn/）。濃縮度は、濃縮された対応する経路のターゲット数と-LGP値によって測定されました。 GO分析の上位10のエントリが棒グラフを描画するために選択され、KEGG分析の上位20パスウェイがバブルグラフを描くために選択されました。
2.1.5分子ドッキング
AutoDock Vinaソフトウェアを使用して、スクリーニングされたコアターゲット（TNF、AKT1、STAT3、EGFR、SRC）およびコアコンポーネント（ケルセチン、サッノロン、 - シトステロール、およびキャッシュセシドH）で分子ドッキング検証を実行しました。結合自由エネルギーが低いほど、受容体タンパク質に結合するためのコア成分の親和性が高くなります[13]。
2.2動物実験の検証
2.2.1モデリング、グループ化、および医薬品局
48個のC57BL/6マウス（{6-7週齢）を空白コントロールグループ、モデルグループ、陽性対照群（デキサメタゾン、0。4mg/kgに分割しました。参照[14]によると、1週間の適応摂食後の体重によると、各グループに8匹のマウスがあります。空白のコントロールグループのマウスは毎日毎日水を食べて飲みましたが、モデルグループおよび薬物投与グループのマウスは、モデリングのために毎日3％のDSS溶液を自由に飲み、自由に食べました。モデリングと同時に、各CE用量群のマウスは、対応するCEの用量（使用前に蒸留水に溶解した）でgavedされ、陽性対照群のマウスにデキサメタゾンを腹腔内に注入し、ブランクコントロールグループおよびモデルグループのマウスに0.01 ml/gでsterile水を摂取していました。実験中、1つのマウスが各モデルグループ、陽性対照群およびCE低用量群で死亡しました。最後の投与の後、マウスを12時間断食しました。麻酔後、眼球を除去して、後で使用するために血液と結腸組織を収集しました。
2.2.2疾患活動性の指数の計算と結腸長の検出
実験中、マウスの重量と糞が毎日記録されました。マウスの各グループの便中の減量、糞便特性、および血液は、スコアリング基準[15]に従って評価され、疾患活動性指数（DAI）が計算されました。 dai =（減量スコア +糞便特性スコア +糞便血液または結腸出血スコア） / 3。実験後、マウス結腸の長さを測定して写真撮影しました。
2.2.3結腸組織の病理の観察
マウス結腸組織の一部を4％ポリホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに埋め込み、ヘマトキシリン - エオシン（HE）で染色しました。マウス結腸組織の病理学的形態は顕微鏡下で観察され、病理学的スコアは、クリプト細胞損失と炎症細胞浸潤の程度に従って計算されました[16]。
2.2.4結腸組織の炎症因子レベルの検出
マウスの結腸組織の一部を氷上でホモジナイズし、ホモジネートを3 500 r/minで4度で15分間遠心分離しました。上清を収集し、血清中のIl -10、Il -6、Il -6、Il -1、TNF-、およびMPOのレベルは、キットの指示に従ってマイクロプレートリーダーによって検出されました。
2.2.5結腸組織におけるコア標的タンパク質発現の検出
3匹のマウスの適切な量の結腸組織が各グループから採取されました。ネットワークの薬理学に基づいてスクリーニングされたコアターゲットのタンパク質発現は、ウエスタンブロットによって検証されました。タンパク質バンドの灰色の値は、Image Jソフトウェアによって分析されました。 -actinは、各タンパク質の発現レベルを計算するための内部参照として使用されました。
2.3統計的方法
SPSS22。0ソフトウェアは、データの統計分析に使用されました。定量的データはx±Sとして表され、複数のグループ間の比較は一元配置分散分析によって実行され、2つのグループ間の比較はLSD-Tテストによって実行されました。テストレベル=0。05。
