NAD(P)(H) 定量結果のメタアナリシスは哺乳類組織間のばらつきを示す Ⅱ

NAD(P)(H) レベルに対する生前組織採取と死後組織採取の影響。

我々は、組織採取手順に応じて NAD(P)(H) 酸化還元状態に観察可能な差異がある可能性があると予測しました。 この疑問に答えるために、我々は、NAD(P)(H) 酸化還元状態に対する死後の組織採取手順の影響を調べました。 この分析では、屠殺プロトコルを定義する多数の研究を考慮して、ラット肝臓組織の値を比較しました。 開示された際、レビューされたすべての研究では、NAD(P)(H)測定前に組織サンプルが冷たく保たれ、直ちに氷上で抽出されるか、または-80度で凍結されたと述べられていました。 この分析により、安楽死の前後に抽出された組織間で、ラット肝臓のNADプラス濃度に有意な差がないことが判明しました（図6a）。 ただし、ラット肝臓で報告されている NADH レベルは、死後サンプルで大幅に高くなっています (図 6b)。 総NAD（H）レベルには差は観察されませんでしたが（図6c）、安楽死後に採取された組織ではNADプラス/NADH比が低く（図6d）、これはNADHレベルで観察された変動と一致しています。 組織採取時点ごとにグループ化されたラット肝臓における NADP プラス、NADPH、および NADP プラス /NADPH 比の結果を補足図 9 に示します。 ただし、死後サンプルの数が不十分なため、NADP(H) レベルに対する組織採取時点の影響を解釈することはできません。 マウス肝臓では、死後の NAD plus レベルに差はありませんでしたが、報告された研究の数は限られていました（図 6e）。 いいえナド,NADPプラス、 またはNADPH事後データマウスの肝臓比較可能でした。

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議論

多くの最近の研究は、NAD(P)(H) 調節が細胞の恒常性と酸化還元状態に不可欠であることを実証しています。 げっ歯類から得られたデータは、全身の NAD プラス レベルの侵襲性の低い指標として、ヒトの血中 NAD プラス レベルを調べる研究につながりました。 最近の臨床研究では、NAD プラスレベルが疾患状態では低下し 23,47、NAD プラスブースティング戦略後に上昇することが実証されました 23,44,48,49。 私たちは、1946 年から 2021 年 6 月 20 日までに発表されたすべての研究のメタ分析を実行しました。この研究には、哺乳類種の NAD(P)(H) レベルの定量的データが含まれており、特に最も代表的なマウス、ラット、ヒトに焦点を当てました。生物医学分野で種を研究しました。 この分析は、研究間でのこれらの測定値のよく知られたばらつきを考慮して、正常な哺乳動物組織における NAD(P)(H) 濃度の平均標準レベルを決定するために部分的に行われました。 私たちは、これらのデータを使用して、NAD プラス研究分野における標準化プロトコルを刺激し、疾患や治療計画の信頼できるバイオマーカーとして NAD(P)(H) レベルと酸化還元比の使用を促進できることを願っています。

げっ歯類の組織間の測定値にはかなりのばらつきがあるにもかかわらず、このメタ分析では、いくつかの例外を除いて、組織全体で同様の平均 NAD プラス レベルが示されました。 興味深いことに、マウス骨格筋は、他の高代謝組織（すなわち、肝臓、腎臓、心臓、脳）よりも低い中央値のNADプラスレベルを示しました（図2a）。 これは、骨格筋における NAD(H) 酸化還元状態の違いを示している可能性があり、あるいは線維組織における代謝産物抽出に関するより大きな問題を示している可能性があります。 しかし、血液や筋肉以外の組織は採取できなかったため、これらの観察結果は人間では検証できませんでした。

組織サンプルにおける生理学的 NAD(P)(H) 測定の精度に影響を与える可能性のある潜在的な要因が数多くあります。 報告されたとき、すべての研究では、熱に敏感な画分（NAD プラスおよび NADP プラス）を保存するために、組織を採取して液体窒素に直接浸すか、凍結または処理する前に氷上に保管したと説明されています。 還元型 NAD(P)H 形態の酸に不安定な性質など、さまざまな NAD(P)(H) 画分に対する pH の影響により、大部分の研究で pH 中性の抽出溶媒が使用されています。 。 ただし、還元代謝産物と酸化代謝産物の急速な相互変換と NAD(H)50-53 に対する酸素欠乏の影響を考慮すると、組織代謝産物の迅速な抽出と細胞の NAD(P)(H) をクエンチするための適切な手順を確保することも重要です。 )-酸化還元/消費酵素（除タンパク質などによる）。 これらの方針に沿って、我々の死後組織収集と死後組織収集の分析は、死後分析が NAD プラスの減少に有利であることを示しています。 組織 NAD プラスの減少は、2.5- 時間の低酸素雰囲気に長時間さらされたラットの脳、心臓、肝臓における in vivo の報告で以前に報告されています 54。急速冷凍する前に組織採取を犠牲にする。 これは、代表的な NAD(P)(H) 測定値を取得するには、麻酔下で組織を抽出するか、犠牲後の代謝産物分析に使用する予定の組織を直ちに採取することを優先する必要があることを示している可能性があります。

また、それぞれに異なる制限があるさまざまな定量化方法が、NAD(P)(H) 測定値の全体的な研究内変動に寄与する可能性もあります。 過去 20 年間で最も頻繁に使用された方法は、酵素サイクリング アッセイ、LC-MS、および HPLC でした。 これらの各方法は、代謝産物抽出技術、定量パラメータ、および適切な品質管理の実施によって影響を受けます。 Lu らは LC-MS を使用して、 NAD(P)(H) 代謝物の還元型と酸化型の間の相互変換は、アセトニトリル:メタノール:水と 0.1 M ギ酸混合物を含むさまざまな抽出緩衝液または溶媒中で異なる速度で起こり、最小の相互変換で最大の回収率31。 ただし、LC-MS を使用する場合、NAD(P)(H) 同位体などの内部対照をスパイクすることで、研究の個々のサンプル間でこの相互変換を監視できます。これは、HPLC や酵素よりも LC-MS 技術の利点です。サイクリングアッセイ31、33、55。 それにもかかわらず、LC-MS 技術が適切に制御されている場合でも、マトリックス効果やイオン化効率の変動など、さまざまな要因が測定信号に干渉する可能性があります。 たとえば、LC-MS ベースのメタボロミクスの内部標準として 13C 標識酵母抽出物を使用する研究もあります。 ただし、抽出されたサンプル代謝物マトリックスに 13C 標識酵母抽出物代謝物マトリックスをスパイクすると、標識および/または未標識代謝物のシグナルが低下するイオン抑制など、さまざまな影響が生じる可能性があり、そうでない場合は絶対定量でエラーが発生する可能性があります。徹底的な品質評価によって検出されます56。 また、LC-MS 技術では理論的には 1 回の実験で複数の NAD(P)(H) 代謝産物の測定が可能ですが、目的の代謝産物の濃度差が大きい場合には最適な希釈を実行する必要があるため、依然として限界があります。 したがって、より単純な酵素サイクリングアッセイに比べて利点があるにもかかわらず、LC-MS メソッドは複雑であるため、徹底的な最適化が必要になります。 最近、NAD とバイオセンサーやイメージングベースの質量分析などの新しい分析方法が開発されましたが、これらの技術から生成される定量的データはメタ分析に含めるにはまだ不十分です。 ただし、私たちのメタアナリシスに含まれる 1 つの研究では、紙ベースの生物発光バイオセンサーを使用して、マウス肝臓およびその他の種類のサンプルにおける NAD プラスレベルを測定しました 57。 この研究は、検出方法が類似しているため、生物発光アッセイグループに含まれました（図1a）。

メソッド

データ抽出。

NAD(P)(H) 代謝産物の数値データは、成形品から直接取得するか、半自動データ抽出ソフトウェア (WebPlotDigitizer58) を使用して成形品の図から抽出しました。 さらに、該当する場合、屠殺および／または組織／血液サンプリング方法（すなわち、麻酔および／または安楽死の方法、組織の取り扱い、および保管温度）に対する組織サンプリング時点を記録した。 動物モデルの場合、種、特徴（系統、遺伝子型、年齢、体重など）、および環境条件（睡眠周期、食事の種類、摂食頻度、組織サンプリングに対する摂食状態など）が記録されました。 さらに、すべての研究について、治療（例：薬理学的治療、手術、放射線照射、腫瘍誘発、および研究対象に適用されたその他の処置）およびすべての研究グループ情報（例：治療または疾患グループおよび対応する対照）が抽出されました。 最後に、NAD(P)(H) 定量化方法 (酵素アッセイ、質量分析ベース、HPLC、NMR、生物発光など) および出版物の詳細 (つまり、出版物のタイトル、参照コード [DOI、Medline UI、PMID] またはハイパーリンク)および発行年）が記載されています（補足資料2）。

データ分析。 分析前に、すべての濃度を組織サンプルの場合は組織 nmol/g、タンパク質の nmol/g、血液分画の場合は nmol/ml に変換しました。 タンパク質含量に正規化された結果の数が少ないため、組織重量と血液量に正規化された結果のみを示します。 統計分析は、GraphPad Prism バージョン 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。データの可用性この研究中に抽出および分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足に含まれています情報が逃げる。受信日: 2022 年 4 月 29 日。 受理日: 2023 年 2 月 7 日

参考文献

10. ラブ、NR 他 NAD キナーゼは動物の NADP 生合成を制御し、進化的に多様なカルモジュリン依存性メカニズムを介して調節されます。 手順 国立 アカド。 科学。 112、1386–1391 (2015)。

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