顔の老化の細胞メカニズムに対するバクチオールの多方向活性 - 総合的な治療アプローチの実験的証拠 パート 1
Jun 16, 2023
概要
目的: 皮膚の老化は、活性酸素種の形成、表皮および真皮細胞の生存率の低下を伴う連続的な炎症、およびその結果として生じる細胞外マトリックスへの損傷を含む多因子プロセスです。 効果的な皮膚美容治療法は、理想的には、総合的なアプローチでこれらの特徴に対処する必要があります。 今回我々は、植物由来のメロテルペンであるバクチオールの対応する活性プロファイルを、一連の in vitro、ex vivo、および in vivo 研究で決定し、現在局所アンチエイジング化粧品のゴールドスタンダードと考えられているレチノールと比較しました。
また、シスタンケのグリコシドは、心臓および肝臓組織の SOD の活性を高め、各組織のリポフスチンおよび MDA の含有量を大幅に減少させ、さまざまな活性酸素ラジカル (OH-、H2O2 など) を効果的に消去し、引き起こされる DNA 損傷から保護します。 OHラジカルによる。 Cistanche フェニルエタノイド配糖体は、フリーラジカルの強力な消去能力、ビタミン C よりも高い還元能力を持ち、精子懸濁液中の SOD の活性を向上させ、MDA の含有量を減らし、精子膜機能に一定の保護効果をもたらします。 Cistanche 多糖類は、D-ガラクトースによって引き起こされる実験的老化マウスの赤血球および肺組織における SOD および GSH-Px の活性を高めることができるほか、肺および血漿中の MDA およびコラーゲンの含有量を減少させ、エラスチンの含有量を増加させることができます。 DPPHに対する優れた除去効果、老化マウスの低酸素状態の延長、血清中のSOD活性の改善、実験用老化マウスの肺の生理的変性の遅延 細胞形態学的変性を伴うCistancheには優れた抗酸化能力があることが実験で示されています皮膚の老化疾患を予防および治療する薬になる可能性があります。 同時に、Cistanche に含まれるエキナコシドは、DPPH フリーラジカルを捕捉する顕著な能力を持っており、活性酸素種を捕捉し、フリーラジカルによるコラーゲン分解を防止し、チミン フリーラジカル アニオン損傷に対する優れた修復効果もあります。
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メソッド: バクチオールとレチノールの抗酸化能力と力は、それぞれ吸収減衰と電子スピン共鳴分光法によって 2,2'-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) 還元を測定することによって分析されました。 プロスタグランジン E2 (PGE2)、マクロファージ遊走阻害因子 (MIF)、線維芽細胞成長因子 7 (FGF7)、I 型および VII 型コラーゲン (COL1A1、COL7A1)、フィブロネクチン (FN) レベルおよび水溶性テトラゾリウムの代謝に対する影響1 (WST-1) はヒト皮膚線維芽細胞で測定されました。 表皮再生は、インビトロ創傷治癒モデルを利用して評価されました。 FNタンパク質レベルは、バクチオール、レチノール、またはビヒクルを含む製剤での処理後、吸引ブリスター流体を使用してex vivoで分析されました。 皮膚状態の改善は、バクチオールまたはビヒクルの適用後の分割顔比較研究で生体内で測定されました。
結果: レチノールとは対照的に、バクチオールは高い抗酸化効果を示しました。 PGE2 と MIF のレベルは、バクチオールとレチノールの両方によって有意に減少しました。 バクチオールは FGF7 タンパク質レベルを有意に増加させましたが、レチノールは増加させませんでした。 WST-1の代謝レベルは、バクチオールとレチノールによって大幅に増加しました。 バクチオールとレチノールの適用により、COL1A1、COL7A1、および FN タンパク質レベルが大幅に増加しました。 レチノールではなくバクチオールを補充した創傷は、表皮再生の大幅な増加を示しました。 臨床的には、バクチオール含有製剤で治療した領域は、未治療領域およびビヒクルで治療した領域と比較して、4-週間の塗布後に FN タンパク質値の統計的に有意な増加を示しました。
結論: これらのデータは、皮膚老化の細胞の特徴に対するバクチオールの多方向の有効性の証拠を提供します。 その活性プロフィールはレチノールといくつかの共通の特徴を共有していますが、我々の研究ではこれまで知られていないいくつかのプラスの効果、すなわち重要な細胞外マトリックス成分FNの刺激、および表皮再生と創傷治癒の促進を実証しています。
キーワード
アンチエイジング、バクチオール、in vivo/ex vivo/in vitroでの主張の実証、レチノール、皮膚生理学/構造
導入
老化した肌は、しわ、不均一な色素沈着、肌のざらつき、弛みが特徴です。 これらの臨床徴候は、内因性および外因性の老化プロセスによって引き起こされる構造的および代謝的変化の結果です。 本質的な老化は、テロメア短縮、慢性炎症、ミトコンドリア DNA 単一変異、フリーラジカルなどの要因に起因すると考えられています [1]。 老化した肌には、さらに抗酸化システムの低下が含まれます[2]。 また、生物学的老化プロセスにより細胞増殖速度が低下し、皮膚の構造と機能が失われます。 外因性老化は主に紫外線照射と環境の影響によって引き起こされます。 これらの攻撃は皮膚の損傷を引き起こし、経時的な衰えを強化し、皮膚の老化を加速させます。 人間の皮膚は加齢とともに炎症状態に対処する能力をさらに失い、その結果、慢性的な炎症誘発状態が生じます。
レチノイン酸、レチナール、レチノールなどのレチノイドの局所適用は、効果的な老化防止治療の臨床におけるゴールドスタンダードとみなされています[3、4]。 レチノイドの分子機構は詳しく説明されています[5-10]。 局所レチノイドは、しわ、弛緩、荒れなどの目に見える老化の兆候を効果的に軽減し[4、11]、網状網目や光線黒子などの光損傷を受けた皮膚の色素脱失を軽減します[12]。 しかし、レチノイドによる局所治療は、濃度依存的に皮膚の乾燥や炎症を引き起こす可能性があります[13]。 レチノールの適用は、レチノイン酸などの他のレチノイドと比較して軽度の副作用を引き起こすため[6、14]、顔の老化の美容治療に広く使用されています。
1984 年以来スキンケア製品に使用されているレチノール [15] とは対照的に、バクチオールは局所的な老化防止化合物として注目を集めたのはつい最近です。 バクチオールは、Psoralea corylifolia の種子に由来するメロテルペン (図 1) です。 何世紀にもわたってインドの伝統医学や中国医学で使用されており[16、17]、忍容性も良好です[18]。 バクチオールは、皮膚代替モデルにおいて、両方の物質が in vitro [19] で同様の遺伝子発現パターンを示し、in vivo で皮膚の光損傷の改善 [20] を示すことから、レチノール様の機能を示すことが示唆されています。 したがって、植物由来の機能性レチノイド類似体とも呼ばれます[21]。 さらなる研究では、バクチオールの抗酸化作用[19、22-24]、抗炎症作用[19、25-27]、抗菌作用[28]、さらに抗増殖作用および抗腫瘍作用[29、30]が実証されました。
多因子性皮膚老化プロセスを効果的に改善および遅延させるには、さまざまな細胞メカニズムに統合的なアプローチで対処する必要があります。 バクチオールはさまざまな標的を同時に調節するため、この点で有望な化合物となります。 酸化ストレスと炎症ストレスは皮膚の老化と密接に関係しているため、バクチオールによるそれらのストレスの防止は、皮膚全体の状態を促進する可能性があります。 しかし、最近、現在の科学的証拠の質が批判的に評価されています[31]。 これに関連して、バクチオールとレチノールの (i) 抗酸化能力と (ii) 抗炎症能力を決定し、(iii) 細胞活性として要約される細胞代謝と成長因子 7 の合成を改善するそれらの能力を調べました。 さらに、バクチオールとレチノールが特定の (iv) ECM 成分の発現に影響を与え、(v) 表皮の再生と再上皮化を改善するかどうかを分析しました。 最後に、人間の皮膚におけるバクチオールの臨床的抗老化能力を検証するために、生体内研究が実施されました。
材料および方法
試験材料
バクチオールは、Sytheon Ltd (米国ニュージャージー州ブーントン) から入手しました。 レチノールは、Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。 細胞培養実験では、両方の試験物質を DMSO (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) で新たに希釈しました。 DMSO ストック溶液の場合、試験物質の適用濃度は、培地または緩衝液中に 0.1 パーセントの DMSO を生成する細胞培養に適用される最高濃度の 1000- 倍でした。 さらなる希釈は、0.1パーセントのDMSOを含む培地または緩衝液を使用して実行されました。 したがって、すべての細胞培養実験は 0.1 パーセントの DMSO の存在下で実施されました。 インビボ研究では、局所レチノールをバクチオールと同じビヒクルに配合しました。
インビトロ研究
抗酸化能力の測定
バクチオール、レチノール（両方とも最終濃度 100μM で適用）、または高標準トロロックス（Merck、最終濃度 25μM）を DMSO で希釈しました。 簡単に言うと、30μLのこれらの化合物(最終アッセイ濃度よりも10-倍高い濃度)を96-ウェル平底プレートに添加した。 続いて、２７０μＬの３９μｇ／ｍＬ ＤＰＰＨ（Ｍｅｒｃｋ、１：１の水／エタノール混合物で希釈）を各ウェルに素早く加えて、最終濃度１０パーセントのＤＭＳＯを得た。 対照として、DPPH 溶液を試験物質を欠く DMSO とともにインキュベートしました。 さらに、DPPH の非存在下で、バクチオールまたはレチノールを水/エタノール (1:1)、または 10 パーセントの DMSO を含む水/エタノール (1:1) 混合物のみとインキュベートすることによって、ブランク対照を実行しました。 10、30、および60分後、Sparkマルチモードマイクロプレートリーダー(Tecan、スイス、メンネドルフ)を使用して524nmでの吸光度を測定した。 ブランク対照のシグナルを差し引いた。
抗酸化力の測定
HDFを、10パーセントの子牛血清を含む2mL培地中の{{0}}ウェルプレートに150 000細胞/ウェルで播種し、24時間インキュベートしました。 続いて、古い培地を廃棄し、細胞を、２パーセントの子ウシ血清および最終濃度１０μＭのバクチオールまたはレチノールを含む培地で処理した。 対照ＨＤＦには、バクチオールまたはレチノールを欠く０．１パーセントのＤＭＳＯが補充された。 ブランクコントロールは、細胞を含まない培地をインキュベートすることによって実行されました。 24時間後、馴化培地をVivaspinタンパク質濃縮スピンカラム(5000 MWCO; Sartorius、Göttingen、Germany)に移し、約10-倍に濃縮した。 フロースルーを再添加することにより、すべての培地上清の体積を等しくした。 濃縮馴化培地のＦＧＦ７タンパク質レベルを、製造業者（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ ＧｍｂＨ）の指示に従って市販のＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。 測定は、Spark マルチモード マイクロプレート リーダー (Tecan) を使用して実行されました。 ブランク対照から得られたシグナルを差し引き、FGF7タンパク質レベルをセルカウンター(Scepter、Merck)を利用して測定した総細胞数に対して正規化した。
WST-1代謝の測定
HDFを、10パーセントの子牛血清を含む100μL培地中3000細胞/ウェルで{{0}}ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。 枯渇した培地を廃棄し、最終濃度がそれぞれ1μMまたは10μMのレチノールまたはバクチオールを含む100μLの培地で細胞を処理した。 対照ＨＤＦには、バクチオールまたはレチノールを欠く０．１パーセントのＤＭＳＯが補充された。 さらなる対照として、細胞を10パーセントのtriton-X（Merck）で処理した。 ブランクコントロールは、細胞を含まない培地をインキュベートすることによって実行されました。 72時間後、製造業者(Merck)の指示に従って、市販の細胞増殖試薬WST-1を使用して細胞を染色した。 Tecan infinity M200マイクロプレートリーダー(Tecan)を使用して、450および620nmで吸光度を測定した。 これらの測定値の差を分析に使用しました。 ブランク対照のシグナルを差し引いた。
COL1A1 および COL7A1 タンパク質レベルの測定
HDFを、10パーセントの子牛血清を含む100μL培地中の{{0}}ウェルプレートに10 000細胞/ウェルで播種し、24時間インキュベートしました。 バクチオールまたはレチノールを子ウシ血清を含まない培地１００μＬで希釈し、それぞれ最終濃度１μＭまたは１０μＭで本培地に添加した。 対照には、レチノールおよびバクチオール処理に相当する０．１パーセントのＤＭＳＯ濃度となる１００μＬの無血清培地を補充した。 高標準として、10 ng/mL トランスフォーミング成長因子 (TGF-) および 11 μg/mL アスコルビン酸ナトリウム (両方とも Merck) を適用しました。 ブランクコントロールは、細胞を含まない培地をインキュベートすることによって実行されました。 4時間後、製造業者（Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）の指示に従って市販のELISAキットを使用して、馴化培地のCOL1A1およびCOL7A1タンパク質レベルを分析した。 測定は、Spark マルチモード マイクロプレート リーダー (Tecan) を使用して実行されました。 ブランク対照のシグナルを差し引いた。 COL1A1およびCOL7A1タンパク質レベルは、市販のビシンコニン酸アッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を製造業者の指示に従って使用して測定した総細胞溶解物タンパク質量に対して正規化した。 結果を使用するための前提条件は、高標準の TGF- およびアスコルビン酸ナトリウムに対する細胞の陽性反応でした。
延長したインキュベーション時間後の COL7A1 タンパク質レベルを分析するために、HDF を 96- ウェル プレートに、10 パーセントの子牛血清を含む 100 μL 培地に 3000 細胞/ウェルで播種しました。 バクチオールおよびレチノールを最終濃度10μMでのみ使用したことを除いて、すべての処理、対照、および分析を上記のように実行した。 サブコンフルエンスに達したとき、特に 72 時間後または 96 時間後に細胞を回収しました。
FNタンパク質レベルの測定
HDFを、10パーセントの子牛血清を含む100μL培地中の{{0}}ウェルプレートに10 000細胞/ウェルで播種し、24時間インキュベートしました。 古い培地を、２パーセントの子ウシ血清および最終濃度１０μＭのバクチオールまたはレチノールを含む培地と置き換えた。 対照には、バクチオールまたはレチノールを欠く０．１パーセントのＤＭＳＯを補充した。 ブランクコントロールは、細胞を含まない培地をインキュベートすることによって実行されました。 ２４時間後、製造業者（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の指示に従って市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、馴化培地のＦＮタンパク質レベルを分析した。 測定は、Spark マルチモード マイクロプレート リーダー (Tecan) を使用して実行されました。 ブランク対照のシグナルを差し引いた。 FNタンパク質レベルは、前述のように決定された総細胞溶解物タンパク質量に対して正規化されました。
in vitro 創傷治癒モデルにおける表皮再生の判定
実験は以前に説明されたように行われました[34]。 創傷治癒モデルの治療では、バクチオールまたはレチノールを DPBS で希釈し、最終濃度 100 μM で創傷領域に添加しました (創傷あたり 5 μL)。 参照創傷には、バクチオールまたはレチノールを含まない、0.1パーセントのDMSOを含む同量のDPBSを補充した。 さらなる対照として、追加の創傷を未治療のまま残した。 創傷治癒モデルは、湿度 95%、CO2 5%、温度 37 度で 43 時間インキュベートされました。 続いて、サンプルを液体窒素で事前に冷却したイソペンタン中で急速冷凍し、-80 度で保存しました。 再上皮化は、ライカ DMLS 顕微鏡 (10 倍)、ライカ MC 170 HD CCD カメラ、およびライカ LAS V4.9 ソフトウェア (ライカ マイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ）。 定量化は盲検法で実施した。
In vivo 研究 I および II
どちらの in vivo 研究でも、ヘルシンキ宣言の現行版の推奨事項と医薬品の適正臨床基準調和に関する国際会議のガイドラインが化粧品研究に適用できることが確認されました。 研究プロトコール I はフライブルク独立倫理委員会によって承認されました (feki コード 08/2610)。 どちらの研究でも、ボランティア全員が書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 被験者は健康な皮膚を有し、フィッツパトリック皮膚タイプ I ～ III に属し、ホルモン剤の投与の開始または変更が除外基準でした。
10- 日間のプレコンディショニング期間中および研究期間全体を通じて、被験者はテスト領域での紫外線曝露を控える必要がありました。 発汗を促す活動は、予定された評価の 24 時間前に禁止されました。
研究者は、被験者の通常のスキンケア計画に相当する量を使用して、製剤の正しい適用を実証しました。
研究 I: FN タンパク質レベルの Ex vivo 測定
この車両対照研究に登録された52人の女性被験者のうち、33人の被験者が研究を完了し、31人の被験者（30〜64歳、平均年齢：50.9歳）のデータがデータ分析に含まれた。 ドロップアウトは、SARS-CoV-2のパンデミックと個人的な理由（被験者13名）、および不適合反応（レチノール治療による被験者5名）により発生しました。 レチノール媒介の不適合反応およびサンプリングの問題により、各症状について検査される被験者の数が異なりました（詳細は結果を参照）。
予定された評価の 7 日前から、前腕へのスキンケア製品、洗顔料、石鹸の使用が禁止されました。 研究の最初の日、前腕の内側に 4 つのテスト領域が設定されました。 2 つのテスト領域に、それぞれ {{0}}.5 パーセントのバクチオールまたは 0.15 パーセントのレチノールを含む 2 つのベルム配合物を適用しました。 2016年に消費者安全に関する科学委員会が発表した意見では、適用されるレチノール濃度は美容上の治療とみなされます[35]。 他の 2 つのテスト領域では、対応する車両が使用されるか、領域が未処理のまま残されました。 治療部位の位置が変更されました。 1日2回試験製剤を4週間塗布した後、ボランティアは試験機関に戻った。 各テスト領域では、以前に記載されているように 3 つの吸引ブリスター (直径 7 mm) が生成されました [36、37]。 簡単に説明すると、カスタムメイドの吸引ブリスター カップをテスト領域に置き、550 ～ 850 mbar の真空を適用しました。 約 90 ～ 150 分後、吸引水疱が形成されたときに真空を解除し、24- ゲージ針を使用して水疱から液体を吸引しました。 液体は、分析までドライアイス上で -80 度で直ちに凍結されました。 市販のELISAキット(R&D Systems)を使用して、吸引水疱液サンプル中のFNタンパク質レベルを定量した。 測定は、Spark マルチモード マイクロプレート リーダー (Tecan) を使用して実行されました。 FNレベルは、前述のように測定された吸引水疱流体サンプルの総タンパク質レベルに対して正規化されました。
研究 II: 皮膚状態改善の in vivo 判定
合計 43 人の女性ボランティアがこの車両制御スプリットフェイス比較研究に登録されました。 医学的評価によると、被験者は混合肌タイプ（乾燥肌、普通肌、脂性肌、混合肌）を示しました。 34 人の被験者 (39 ～ 66 歳、平均年齢: 56.2 歳) が研究を完了し、分析に含まれました。 脱落者は、技術的問題とコンプライアンス違反（被験者 8 名）、および不適合反応（ビヒクルおよびバクチオール治療による被験者 1 名）が原因でした。
研究開始の2週間前と研究期間全体を通して、ボランティアはセルフタンニング製品の使用や集中的な顔の美容トリートメント（皮膚の表面層の除去など）を控えるよう求められた。 10-日間のプレコンディショニング期間中および研究全体を通じて、被験者はアートメイク、まつげと眉毛のトリートメント、アイマスク、パッチの実行を控えるよう求められました。 最初の評価の 3 日前に、被験者はフェイスケア製品の使用を控えるよう求められました。 予定された採点の前夜、被験者は装飾化粧品の塗布を中止するよう求められた。
10- 日のプレコンディショニング段階の最初の 7 日間では、被験者は研究用ビヒクル クリームが入ったクリーム瓶 (内容に関する情報はありません) を受け取り、それを 1 日 2 回顔全体に塗布しました。 ベースラインでは、ボランティアが自己採点を実施しました。 特に、彼らは顔の皮膚のみずみずしさと輝き、そして皮膚の老化の兆候を観察することにより、顔の皮膚の全体的な外観を視覚的に評価しました。 これにより、1 (非常に疲れている、老化した) から 10 (非常に新鮮で老化した肌の兆候がない) までの範囲の視覚的アナログ スケールが適用されました。 次に、対象者には、内容物については何も指定せずに、ヴェルム（0.5パーセントのバクチオールを含むビヒクル）またはビヒクルが入った盲検クリーム瓶2つをそれぞれ受け取りました。 12週間の研究期間中、顔の一方の側を1日2回ベルムで治療し、もう一方の顔の側をビヒクルで1日2回治療した。 試験部位への治療の割り当ては変更されました。 12 週間の定期的な使用後、ボランティアは再び前述のように自己採点を実行しました。
統計分析
統計分析は、Microsoft Excel for Office 365 (Microsoft Corporation、米国ワシントン州レドモンド)、SAS Software Package for Windows V9.4 (SAS Institute GmbH、ハイデルベルク、ドイツ)、および GraphPad Prism V8 (GraphPad Software、サンディエゴ) を使用して実行されました。 、米国カリフォルニア州）。
データの正規分布は、Shapiro-Wilk 検定を使用して評価されました。 正規分布が確認された場合は、事後ペアワイズ比較による反復測定分散分析 (RM-ANOVA) を実行しました。 正規性仮説が棄却された場合は、元のデータの Blom 変換されたランクが事後ペアワイズ比較を備えた RM-ANOVA を使用して評価されるか、元のデータが Wilcoxon の符号ランク検定を使用して評価されました。 すべての統計検定は、アルファ=0 の有意水準で両側性でした。05.
結果
インビトロ研究
抗酸化作用の測定
(i) バクチオールとレチノールの抗酸化効果を分析するために、DPPH を検出分子として使用して 2 つの異なるアッセイを実行しました。
抗酸化力
抗酸化能力は、吸収減衰による DPPH の減少を測定することによって決定されました。 高標準の Trolox は、対照と比較して抗酸化能力が大幅に向上し (すべての示された時点で p=0.0000)、適切な測定が証明されました (図 2a)。 対照については、バクチオール処理サンプルの吸光度も、調査したすべての時点で大幅に減少しました(10分: p=0.0003、30分および60分: p=0.0000)。 ）抗酸化能力の向上を示しています。 対照的に、レチノールは、対照と比較して顕著な抗酸化能力を示さなかった。
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