MiR‑214は、PTEN / AKT/mTORで制御されるオートファジーを介して敗血症による急性腎障害を改善します
Feb 28, 2022
概要。 以前の研究は、酸化ストレスとオートファジーが急性をもたらすことを示唆しています腎臓障害 （AKI）敗血症およびマイクロRNA（miR）‑214は、腎臓酸化ストレスにさらされます。 本研究は、miR‑214の腎保護が敗血症のオートファジーに関連しているかどうかをテストすることを目的とした。 オートファジーの役割は、盲腸結紮穿刺（CLP）のマウスモデルで調査されました。 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT‑qPCR）を使用して、miR‑214の発現を分析しました。 の構造と機能腎臓マウスから採取したものを評価した。肝臓オートファジーレベルは、免疫組織化学的、免疫蛍光抗体法、およびウエスタンブロッティングで検出されました。 miR‑214は、敗血症マウスのレベルを阻害することにより、AKIを軽減できることがわかりました。肝臓オートファジー。 さらに、miR‑214は、PTENの発現をサイレンシングすることでオートファジーを抑制しました。肝臓敗血症マウスの組織。 これらの所見は、miR‑214がPTEN / AKT / mTOR経路の調節を通じて酸化ストレスを軽減し、オートファジーを阻害することにより、CLP誘発性AKIを改善したことを示しています。
キーワード：microRNA‑214、敗血症、急性腎障害、オートファジー、腎
序章 急性腎臓障害（AKI）は、敗血症の最も一般的な合併症の1つであり、敗血症患者の40〜50％で発生し、死亡率は60％にも達します（1）。 ただし、敗血症誘発性AKIの病因は不明であります。 オートファジーは敗血症誘発性AKIにおいて重要な役割を果たすことが報告されており、オートファジーの阻害は敗血症中のAKIの発症をもたらします（2,3）。 以前の研究（4,5）は、敗血症が複数の臓器でオートファジーを引き起こすことを確認しています。肝臓（6）オートファジープロセスは、損傷したミトコンドリアと酸化ストレスの除去に関与しています（7）。 ただし、過剰なオートファジーは、望ましくない有害な細胞死を引き起こす可能性があります（8）。 したがって、中程度のレベルのオートファジーは、敗血症によって誘発されるAKIを減らすための鍵です。 以前の研究では、miR‑214はアポトーシスを阻害することで虚血再灌流誘発性AKIを改善し（9）、miR‑214は活性酸素種（ROS）/ AKT / mTORシグナル伝達経路を介して糖尿病性腎症の酸化ストレスを抑制することが報告されています（10）。 本研究では、miR‑214がオートファジーを阻害することにより、マウスの敗血症誘発性心筋機能障害を軽減できることがわかりました（11）。 ただし、miR‑214が敗血症誘発性AKIを改善できるかどうかはまだ解明されていません。 本研究では、miR‑214は、PTEN / AKT / mTOR経路の調節を通じて酸化ストレスを軽減し、オートファジーを阻害することにより、CLP誘発性AKIを軽減するという仮説を立てました。
CISTANCHEは腎臓/腎疾患を改善します
材料および方法
動物。本研究では、河北医科大学（中国石家荘市）の臨床検査動物センターから提供された合計100匹の昆明雄マウス（体重20.40±2.92g、年齢6〜8週間）を使用しました。 すべてのマウスは、24℃、湿度50％で12時間の明暗サイクルに順応し、実験の1週間以上前に餌と水を自由に摂取できるようにしました。 すべての実験手順は、国立衛生研究所のガイドライン（NIH Publication No 85‑23、1996年改訂）および滄州中央病院の施設内動物管理使用委員会による承認（承認番号2017‑020‑）に厳密に従って実施されました。 01）。 すべての手術は麻酔下で行われ、苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。
盲腸結紮および穿刺（CLP）。以前に記載されたように（12）、マウスに対してCLPを実施してマウス敗血症モデルを作成した。 イソフルラン吸入による麻酔（3％で誘発され、0 .5％で維持）に続いて、1cmの正中切開が切断されました。 露出した盲腸（端から1cmの距離）を23ゲージの針を使用して2回穿刺して結紮した。 盲腸は少量の糞便を穏やかに押し出し、解剖学的位置に戻しました。 腹壁は3‑0シルクブレードで層状に縫合されました。 手順に続いて、1mlの0。9パーセントの生理食塩水を皮下注射した。 マウスは水だけへの自由なアクセスを提供された。 偽モデルマウスは、CLPなしのCLPモデルと同じ方法で操作された。
実験計画. マウス（偽手術およびCLPの場合はn =6）は、偽グループ、CLPグループ、アデノウイルス（Ad）-緑色蛍光タンパク質（GFP）とCLPグループ、Ad-miR-214とCLPグループの7つのグループにランダムに割り当てられました。 、anti‑miR‑214とCLPグループ、PTEN阻害剤とCLPグループ、Ad‑miR‑214とPTEN阻害剤とCLPグループ。 シャムグループのマウスは同じ手順にさらされましたが、盲腸の結紮と穿刺はありませんでした。 他のグループのマウスは盲腸結紮と穿孔を受けた。 すべてのマウスは、イソフルラン吸入によって迅速に麻酔され、血液、尿、および肝臓最後の処理から24時間後のサンプル。
アデノウイルスを介したAd‑miR‑214、anti‑miR‑214、またはAd‑GFPインビボでの遺伝子導入およびPTEN阻害剤注射。 Ad‑miR‑214、anti‑miR‑214、またはAd‑GFP（Shanghai GenePharma Co.、Ltd.）は、CLPの4日前にマウスの腹腔に送達されました。 手短に言えば、マウスをイソフルラン吸入によって麻酔した。 200 µlのアデノウイルス（2x1011 pfu、miR‑214、anti‑miR‑214、またはAd‑GFPを発現）を含むカテーテルを、腹腔内注射により正常なマウスに投与しました。 PTEN阻害剤（VO‑OHpic、腹腔内、Sigma‑Aldrich、Merck KGaA）は、アデノウイルス投与の30分前に腹腔内注射により10 µg /kgの単回投与で抗miR‑214を投与されたCLPマウスに投与されました。 。
腎機能の評価。 マウスの心臓から血液サンプルを採取し、続いて遠心分離（室温で15分間、3、000 xg）して血清を採取しました。 血中尿素窒素（BUN）および血清クレアチニン（Cr）の血清レベルは、Hitachi 7600自動分析装置（Hitachi、Ltd.）を使用して測定しました。 ELISAを使用してレベルを分析しました腎臓障害尿サンプル中の分子1（KIM-1;カタログ番号RKM100; R＆D Systems、Inc。）および好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL;カタログ番号DY3508; R＆D Systems、Inc.）。
血清炎症性サイトカインのアッセイ。血清TNF‑（カタログ番号H052）およびIL‑6（カタログ番号H007）は、市販のELISAキット（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute）を製造元の指示に従って使用して検査しました。酸化ストレスマーカーの測定。 対応するアッセイキット（南京江城生物工学研究所、南京、中国）を使用して、マロンジアルデヒド（MDA）のレベルを測定し、製造元の指示に従ってスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の活性をテストしました。
組織学および尿細管損傷スコア。 すべてのマウスは肝臓CLPの24時間後の麻酔下での灌流。 ザ肝臓標本は4パーセントのパラホルムアルデヒドで4℃で72時間固定されました。 次に、組織サンプルを段階的な一連のエタノール溶液で脱水し、パラフィンに包埋し、4 µmの切片に切断しました。 ミクロトームを使用して切片（4 µm）を切断し、組織切片を組織学的検査のために室温でヘマトキシリン（5分）とエオシン（1分）で染色しました。 スライドは、顕微鏡（BX51、オリンパスコーポレーション）を使用して評価および等級付けされました。腎臓tissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75パーセント（13）。
透過型電子顕微鏡（TEM）。新鮮腎臓リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、1 mmの立方体に切断し、2.5％グルタルアルデヒドで4℃で24時間順次固定しました。 切片を1％四酸化オスミウムに4℃で2時間浸漬し、段階的エタノールで脱水し、エポキシ樹脂に包埋しました。 最後に、極薄切片（60 nm）を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で20℃で60分間二重染色しました。 観察は、透過型電子顕微鏡（Tecnai; Hitachi、Ltd.）で、Electron Microscopy Film 4489（ESTARシックベース; Kodak）を使用して80kVで行った。
免疫組織化学（IHC）。新鮮肝臓組織を4％パラホルムアルデヒドで固定し（4℃で72時間）、パラフィンに包埋しました。 試料を4µmの厚さに切断し、キシレンで脱パラフィンしました。 組織切片をPBSで洗浄した後、抗原を回収するために1 0 mMクエン酸バッファー（pH 6。0）で4分間煮沸し、室温でPBS中の10％ヤギ血清でブロックしました。 1時間。 一次抗体（抗LC3B; 1：400;カタログ番号4412; Cell Signaling Technology、Inc.）を指示に従って添加し、4℃で12時間インキュベートしました。 二次抗体（ヤギ抗ウサギHRP; 1：2、000;カタログ番号BS13278; Bioworld Technology、Inc.）を添加し、室温で10分間インキュベートしました。 DAB（100 µl）を添加し、5分間対比染色し、光学顕微鏡（Model CX31‑P; Olympus Corporation）で染色を観察しました。 茶色に見えた陽性染色の強度は、Image‑Pro Plus 6.0画像解析ソフトウェア（Media Cybernetics、Inc.）を使用して決定されました。 積分光学密度（IOD）は、強度を表すために計算されました。 タンパク質発現が増加するにつれて、IOD値は増加しました。
逆転写-定量的（RT‑q）PCR。 全RNAはから抽出されました腎臓組織TRIzol試薬（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用してモデルを誘導した後。 TaqMan逆転写キット（カタログ番号N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific、Inc.）の指示に従って、RNAをcDNAに逆転写しました。 以下のサーモサイクリング条件を使用しました（miR‑214）。95℃で5分間の初期変性。 続いて、95℃で30秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を40サイクル行います。 RT‑qPCRは、ABI Prism 7500シーケンス検出システム（PerkinElmer、Inc.）と標準のSYBR Green PCRキット（Toyobo Life Science）を使用して実行されました。 miR‑214の内部統制としてU6を使用しました。 プライマー配列は次のとおりです。miR‑214、フォワード、5'‑AGCATAATACAGCAGGCACAGAC‑3'およびリバース、5'‑AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC‑3'。 U6、順方向、5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3'および逆方向、5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'。 これらの実験は6回繰り返されました。 結果は2‑ΔΔCq法を使用して分析されました（14）。 LC3、p62、PTEN、AKT、およびmTORのmRNA発現レベルは、RT‑qPCRを介して評価されました。 これらの遺伝子の内部参照として-アクチンを使用し、2-ΔΔCqを使用して標的遺伝子の相対的な発現を測定しました。 表Iに示すプライマー配列は、Sangon Biotech Co.、Ltdによって合成されました。
ウエスタンブロッティング。 肝臓組織をRIPAライセート（Beyotime Institute of Biotechnology）と混合してホモジネートを作成し、目に見える組織が観察されなくなったら溶解を停止しました。 サンプルを13、000 xgで-10分間、-4℃で遠心分離し、ウエスタンブロット分析のために上清を回収しました。 簡単に説明すると、タンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用して決定しました。 タンパク質サンプル（サンプルあたり80 µg）を、12％のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、4℃で一晩ポリフッ化ビニリデン膜に転写しました。 分離したタンパク質をPVDFメンブレンに転写しました。 5％スキムミルクで室温で2時間ブロッキングした後、メンブレンを一次抗体とともに一晩（4℃で）インキュベートしました。 次の一次抗体（すべてCell Signaling Technology、Inc.）を使用しました：軽鎖3B（1：1、000;カタログ番号4412）、p62（1：1、000; cat 。no。4412）、Anti‑PTEN（1：1、000;カタログ番号9188）、抗リン酸化（p）‑AKT（Ser473）（1：1、000; cat 。no。4060）、anti‑AKT（1：1、000;カタログ番号9272）、anti‑p‑mTOR（Ser 2448）（1：1、000;cat。no。 。5536）、anti-mTOR（1：1、000;カタログ番号2972）および-actin（1：2、000;カタログ番号4970）。 洗浄後、膜をHRP標識抗ウサギ二次抗体（1：3、000;カタログ番号A0208; Beyotime Institute of Biotechnology）とともに（室温で2時間）インキュベートしました。 タンパク質バンドはImmobilonWestern（MilliporeSigma）で検出され、Total‑Lab TL120ソフトウェア（Nonlinear Dynamics、2.01）を使用して分析されました。 タンパク質の発現は、アクチンに対して正規化されました。
統計分析。 統計分析は、GraphPad Prism 9. 0（GraphPad Software、Inc.）を使用して実行されました。 すべてのデータは、分布に応じて、連続変数の平均±標準偏差または中央値（四分位範囲）として表されました。 必要に応じて、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定、またはクラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの検定を使用して、ベースラインの特性と結果を比較しました。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
結果
CLPの24時間後の時点。 以前の研究では、生化学的（すなわち、LC3およびp62）分析により、6〜8時間のCLP後の敗血症の進行とともにオートファジーフラックスが抑制されることが明らかになっていることが報告されています（6、15、16）。 本研究では、肝臓CLP治療マウスの割合は、手術後24時間以内に増加しました。 さらに、のマーカーの分析腎臓障害そのことを示した腎機能CLPの24時間後に最も深刻な損傷を受けました。 したがって、以下の実験では、CLPの24時間後の時点を選択しました。
腎臓組織のmiR‑214に対する規制効果。 RT‑qPCR分析を使用して、CLP処理マウスのmiR‑214発現を検出しました。 miR‑214の発現は、肝臓偽のグループと比較して、24時間のCLP手術後の組織（1.47倍、P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">肝臓偽のグループと比較した組織（両方のP<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHEは腎臓/腎不全を改善します
敗血症マウスの腎機能障害に対するmiR‑214の効果.すべてのマウスを犠牲にして、血液、尿、および肝臓CLP手術の24時間後のサンプル。 BUNとCrは、腎臓減損（17）。 さらに、NGALとKIM‑1はの特定のバイオマーカーとして特定されています腎臓障害そしてそれらの増加した発現は初期に関連しています腎臓AKIの尿細管損傷（17）。 図2A‑Dに示すように、BUN、Cr、KIM‑1、およびNGALのレベルは、偽のグループと比較して、CLP手術後に有意に増加しました。 ただし、Ad‑miR‑214は、CLPグループ（すべてのP）と比較して、BUN、Cr、KIM‑1、およびNGALのレベルを大幅に低下させました。<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">腎臓機能パラメーター。 ただし、PTEN阻害剤による前処理後、Ad‑miR‑214の保護効果が強化されました。 結果は、miR‑214が敗血症マウスの腎機能障害を軽減することを示しています。
腎臓の炎症と酸化ストレスに対するmiR‑214の効果。図3AおよびBに示すように、CLPはTNF-およびIL-6のレベルを大幅に上昇させましたが、Ad-miR-214はこれらのマーカーのレベルを大幅に低下させました。 と比較して
敗血症マウスの腎オートファジーに対するmiR‑214の効果。本研究では、LC3の変化を検討しました。肝臓IHC染色による組織。 図6に示すように、陽性染色のLC3強度は、偽のグループと比較してCLPグループで有意に増加しました（P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR‑214はAKT/mTOR経路を活性化して阻害します腎臓組織のPTENをサイレンシングすることによるオートファジー.オートファジーに対するCLPの効果肝臓LC3‑II / Iおよびp62のレベルを評価することにより、組織を調査しました。 PTEN / AKT / mTORシグナル伝達経路は、オートファジーにおいて重要な役割を果たします（18）。 miR‑214がPTEN‑AKT / mTOR経路に及ぼす影響を調べるために、LC3‑II / I、p62、AKT、p‑AKT、mTOR、p‑mTOR、およびPTENのタンパク質レベルをウエスタンブロッティングとRT‑で分析しました。 qPCR分析。 図7A‑Cに示すように、これらのタンパク質の修飾は急速に起こり、LC3‑II / LC3‑Iの割合が増加し、p62のレベルが低下します（両方のP<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">肝臓 tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0 .05）。 これらの結果は、オートファジーがCLPによって誘導され、miR‑214の過剰発現が部分的にそれを阻害する可能性があることを示しています。
図7AおよびD‑Fに示すように、PTENの発現レベル（P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">肝臓 tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0 .05）。 これらの発見は、CLPが誘発することを示唆している肝臓AKT/mTOR経路を阻害することによる組織オートファジー。 Ad‑miR‑214は、PTENをサイレンシングすることにより、AKT/mTOR経路をアクティブにしました。肝臓組織。 ただし、CLPグループと比較して、anti‑miR‑214はmTORの発現を有意に阻害しませんでした。 したがって、RT‑qPCRをさらに使用して、PTEN / AKT/mTORシグナル伝達経路に関連する遺伝子のmRNAの発現を測定しました。 RT-qPCRの結果（図8）によると、Shamグループと比較してp62、LC3、PTENのmRNA発現レベルは著しく増加しましたが、CLPグループではAKTとmTORのmRNA発現が減少しました。 CLPグループと比較して、Ad‑miR‑214、PTEN
阻害剤およびAd‑miR‑214とPTEN阻害剤のグループは、LC3およびPTENのmRNA発現の減少を示しましたが、p62、AKT、およびmTORのmRNA発現の増加を示しました（すべてP<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0 .05）。 したがって、オートファジーに対するp62の効果は、転写後レベルではなく、転写レベルで発生する可能性があります。 現在の結果は、miR‑214がPTENの発現をダウンレギュレートし、AKT/mTORシグナル伝達経路を活性化することを示しています。
討論
本研究は、過度のオートファジーが有害であることを発見しました腎機能敗血症のマウスで。 以前の研究では、miR‑214は増殖、転移、浸潤の増加に関連し、細胞や組織の癌遺伝子として機能することが示されています（19‑22）。 研究によると、miR‑214は、アポトーシス、酸化ストレスの軽減、および炎症性因子のダウンレギュレーションを介して、AKIに対する保護の役割を果たします（21,23）。 本研究では、オートファジーの調節におけるmiR‑214の潜在的な関与に焦点を当てることにより、敗血症誘発性AKIに対するmiR‑214の保護効果の根底にあるメカニズムをさらに調べました。 結果は、酸化ストレスが肝臓CLP手術の投与後。 一方、オートファジーの活性化は、肝臓。LC3 II/Iの上昇とp62の減少肝臓CLP手術による治療後に観察された。 予想通り、miR‑214の過剰発現は大幅に減衰しました肝臓病理学的損傷および肝臓敗血症によって引き起こされる機能障害。 ただし、miR‑214の阻害は、腎保護とは逆の傾向を示しました。 さらに、Ad‑miR‑214の保護効果はPTEN阻害剤によって強化されました。
浄化槽で肝臓、過度の炎症はROSの生成の大幅な増加を伴い、多数のROSはミトコンドリア構造の変化を引き起こし、ミトコンドリア機能を損ないます。これにより、体は悪循環に入り、悪化します。肝臓ダメージ（24,25）。 したがって、酸化ストレスは敗血症誘発性AKIの主な病理学的メカニズムの1つである可能性があります。 本研究は、過剰な酸化ストレスを示すさらなる証拠を提供しました。これは、MDA産生の増加とSOD活性の低下によって示されました。肝臓CLP手術後の組織。 さらに、miR‑214の過剰発現が肝臓オートファジー阻害に関与するCLP誘発性の酸化的損傷に対して。 これは、miR‑214がさまざまな細胞や組織を酸化ストレスから保護するという以前の研究と一致しています（26,27）。
オートファジーは敗血症の発症において「両刃の剣」として機能します。基本的なオートファジーは有毒な酸化タンパク質を除去することで保護効果を発揮しますが、過剰なオートファジーはROS発疹などの重度のストレス下でオートファジー細胞死を引き起こす可能性があります（28,29） 。 オートファジーは最初に敗血症で活性化され、その後、敗血症によって誘発される酸化的損傷を悪化させるオートファジー細胞死による機能不全の次の段階が続くことが示されています（30）。 本研究では、PTEN阻害剤またはmiR‑214の過剰発現により、CLP処理マウスで抗酸化腎保護が示されました。 ただし、miR‑214の阻害は、抗酸化性腎保護とは逆の傾向を示しました。 したがって、過剰または不十分なオートファジーは原因となる可能性があります腎臓の損傷; どちらも不適応であり、最終的に細胞死を引き起こします。 したがって、適度なレベルのオートファジーを維持することは、敗血症状態での酸化的損傷を軽減するための鍵です。
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蓄積された証拠は、miR‑214がさまざまな細胞や組織のオートファジーを阻害することを示しています（31‑33）。 本研究では、miR‑214の過剰発現が、CLPによって誘発されるオートファジーを阻害することがわかりました。腎臓組織、LC3‑II/Iやp62などのタンパク質マーカーの変化によって示されます。 さらに、結果は、miR‑214の過剰発現が、過剰なオートファジーを阻害することにより、CLPによって誘発される酸化的損傷を軽減することを示しました。 本研究では、miR‑214が調節する分子メカニズムについても調査しました。肝臓敗血症誘発性AKIのオートファジー。 PTEN / AKT / mTORは、調節する重要なシグナル伝達経路です肝臓オートファジー（34,35）であり、敗血症誘発性AKIで重要な役割を果たし、PTENはPI3K / AKT/mTORシグナル伝達経路の負の阻害剤です。 以前の研究では、miR‑214はさまざまなモデルでPI3K / AKT / mTORシグナル伝達経路を介してオートファジーを調節できることが報告されています（36‑38）。 Ma et al（39）は、miR‑214が糖尿病の腎臓のオートファジーをダウンレギュレートできることを発見しました。 したがって、CLP誘発性AKIに対するmiR‑214の効果は、PTEN / AKT/mTOR経路の調節に関与している可能性があるとの仮説が立てられました。 特に、本研究の結果は、CLP手術がPTENのレベルを有意に上昇させたが、p-AKTおよびp-mTORのレベルを低下させたことを示し、CLP手術がAKT/mTOR経路を不活性化したことを示しています。 さらに、miR‑214の過剰発現は、CLP誘発オートファジーにおけるPTENのサイレンシングによってAKT/mTOR経路を活性化しました。肝臓組織。 ただし、anti‑miR‑214は、ウエスタンブロット分析でmTORの発現を有意に阻害しませんでした。 したがって、RT‑qPCRをさらに使用して、PTEN / AKT/mTORシグナル伝達経路に関連する遺伝子のmRNAの発現を測定しました。 本研究では、miR‑214がPTENの発現をダウンレギュレートし、AKT/mTORシグナル伝達経路を活性化してオートファジーを阻害することを確認しました。 ただし、のメカニズムに関連する追加の詳細を取得するには、さらに徹底的な調査を実施する必要があります。肝臓敗血症状態のオートファジー。
結論として、本研究の結果は、miR‑214が敗血症誘発性に対する保護的役割を果たしたことを示唆しました。腎臓障害PTEN / AKT / mTOR経路の調節を通じて、酸化ストレスを軽減し、オートファジーを阻害します。 現在の調査結果は、miR‑214が敗血症誘発性AKIの潜在的な治療標的である可能性があることを示唆しています。 ただし、本研究では6〜8週齢のマウスを使用したため、成体マウスではmiR‑214のメカニズムに関するさらなる研究が必要です。