オメガ-3酪酸はSIRT1/3をアップレギュレートし、脱アセチル化を介してPGC -1を活性化し、5/6腎摘出ラットモデルでNrf1産生を誘導します
Mar 10, 2022
序章
腎臓さまざまな代謝経路、水と電解質のバランス、血圧制御、いくつかのホルモンの産生など、いくつかの機能の調節に関与しています。 これらの機能は膨大なエネルギーを消費するため、腎臓ミトコンドリアが豊富です[1]。 ミトコンドリアは、ラパマイシン（mTOR）およびAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）を介した栄養素感知経路の機械的標的を調節して、健康なミトコンドリア集団を維持することにより、さまざまな代謝条件に適応できます[2]。 ミトコンドリアに関する研究の中で、これまでのところ、ミトコンドリア生合成に関する研究はわずかしかありません。 ミトコンドリア生合成に関連するほとんどの研究は、腎臓組織[3,4]、および研究腎臓主に急性に関連しています腎臓障害（AKI）動物モデル、近位尿細管細胞、および糖尿病性腎症[5–7]。 ミトコンドリア生合成は、非糖尿病性慢性におけるミトコンドリア機能障害の病因に関連している可能性がありますが腎臓病 （CKD）、このトピックに関する研究も非常に限られています。 CKDとミトコンドリア生合成は心血管疾患に関連しています[8,9]。 ミトコンドリア生合成の改善は、CKDの心臓保護に有益である可能性があります。 オメガ-3酪酸（FA）がミトコンドリアの生合成を促進することを示す研究は、非肝臓組織[3,10]。 最近の研究では、心血管疾患および神経変性疾患の動物モデルのミトコンドリア生合成におけるオメガ-3FAの有望な役割が実証されました[11]。 したがって、本研究では、ミトコンドリア生合成を調査することを目的とした腎臓5/6腎摘出術（Nx）ラットの。 さらに、このモデルを使用して、ミトコンドリア生合成に対するオメガ-3FAの効果を評価しました。
キーワード：核呼吸因子1; 核因子赤血球2-関連因子2; サーチュイン1; サーチュイン3; オメガ-3脂肪酸; 腎臓、腎臓
2.結果
2.1。 腎機能の変化と組織学的所見
対照群と比較して、オメガ{{0}} FA群で治療されたNxおよびNxの血中尿素窒素（BUN）レベルは有意に増加しました（対照群17.7±1.5、Nx群77.7土28.4、およびtitオメガ-3FAグループ63.9土17。0mg/ dL、p= 0。{{20}} 0 7）。 Nxとオメガ-3FAグループで処理されたNxの間に有意差はありませんでしたが、BUNレベルはオメガ-3FAグループで処理されたNxで数値的に低かった。 3つのグループの血清クレアチニン（sCr）レベルは、BUNのレベルと同様でした（対照グループ、0。4 th 0.U; Nxグループ、1.3土0.6;オメガ-3 FA、1.0± 0.3 mg / dL; y=0。008）。 対照群と比較して、Nx群ではPAS染色を使用して重度の尿細管拡張と萎縮が観察されました（補足図S1）。 さらに、結果は、オメガ-3 FAグループで治療されたNxは、Nxグループよりも尿細管間質性変化が少ないことを示しました。 ザ腎機能3つのグループの組織学的変化は以前の研究ですでに報告されています[12]。
22ミトコンドリア生合成に関連する要因の変化
2.2.1。 Nrf1およびNrf2式。対照群と比較して、Nx群は、核呼吸因子1（Nefl）および核因子赤血球2-関連因子2（Nrf2）の発現レベルの有意な低下を示しました。 しかし、オメガ-3 FA群で治療されたNxでは、Nrf1とNrf2の発現レベルはNx群と比較して有意に増加しましたが、対照群のレベルには達しませんでした（Oigure P、補足図St） 。 これらの結果は、Nrf1 mRNAの定量的リアルタイムPCR分析でも見られました（補足図S3）。
2.2.3。 PGC -1活動に関連する因子の発現：pAMPK、SIRT1/3。対照群と比較して、オメガ-3群で処理されたNxおよびNxは、有意に低いレベルのリン酸化AMPK（カボチャとAMPKの比率）を示しました（図3A）。 さらに、Nxグループは対照グループと比較して有意に低いレベルのサーチュイン1（SIRT1）発現を示しました（図3B、補足図S6）。 ただし、オメガ-3 FAの追加後、SIRT1の発現は比較的増加しましたが、この差は統計的に有意ではありませんでした。 これらの結果は、SIRT1 mRNAの定量的リアルタイムPCR分析で見つかりました（補足図S7）。 逆に、サーチュイン3（SIRT3）の発現は、対照群と比較してNx群で有意に減少し、オメガ-3 FA群で治療されたNxで有意に救済されました（図3C）。
2.2.4。 Keap1、mTOR、FoxO1、およびFoxO3の発現、対照群と比較して、ケルチ様EC H関連タンパク質1（Keap1）およびフォークヘッドボックスタンパク質O1およびO3（FoxO1 / 3）の発現はNx群で有意に増加しました。 。 オメガ-3FAグループで処理されたNxでは、Keap1およびFoxO1 / 3の発現レベルはNxグループと比較して大幅に減少しました（図4C、E、F）。 対照群と比較して、mTORの発現はNx群で有意に減少しました。 ただし、オメガ-3 FAグループで治療されたNxでは、mTORの発現は救済されましたが、コントロールグループのレベルには達しませんでした（図4B）。
2.2.5。 ミトコンドリアDNA（mtDNA）の含有量、mtDNAの有意な減少が対照群と比較してNx群で観察されました。 しかし、mtDNAの減少量は、Nx処理されたオメガ-3 Nxグループで有意に回復しました（補足図S9）。
3.ディスカッション
リン酸化と脱アセチル化を介して活性化されるPGC-1は、ミトコンドリア生合成とエネルギー生成のマスターレギュレーターです。 CKDモデルでPGC-1の発現と脱アセチル化の減少が見られました。 PGC -1の脱アセチル化の減少が、CKDの機能不全のミトコンドリア生合成とエネルギー産生の減少に寄与する主なメカニズムであることは注目に値します。 AMPKは、そのスレオニンまたはセリン残基をリン酸化することによってPGC-1を活性化します[13,14]。 AMP / ATP比が高い場合、AMPKはリン酸化によっても活性化されます。 しかし、AMPKは、高いAMPレベルの感知が損なわれるため、CKDでは不活性化されることが知られています[15,16]。 以前の研究と同様に、AMPKリン酸化が肝臓Nxグループの組織。 NxグループではpPGC-1/ PGC -1がある程度増加しているように見えますが、PGC {{3 }} 表現。 さらに、オメガ-3 FAグループで処理されたNxも、Nxグループと同様の結果を示しました。これは、オメガ-3FA投与がAMPKおよびPGC{{6}のリン酸化に影響を与えなかったことを示しています。 }。 脱アセチル化はPGC-1のシーケンス全体で発生する可能性があり、SIRT1および3は脱アセチル化のプロセスで主要な役割を果たします[13,14]。 オメガ-3FA投与後、PGC -1、SIRT1、および3の発現レベルが上昇し、脱アセチル化PGC-1が正常対照群と同じレベルに救済されました。 。 オメガ-3FAグループで処理されたNxで示されるNrf1およびNrf2の発現レベルの救済は、SIRT1および3の発現レベルの増加に直接関連しており、PGC{の脱アセチル化にさらにつながりました。 {22}}。
CISTANCHEは腎臓/腎機能を改善します
ミトコンドリアに関する最近の研究腎臓病遺伝的または薬理学的介入によるPGC- 1またはSIRT発現レベルの増加が改善したことを示しています腎臓の損傷AKI動物モデル[5–7,17,18]。 根本的なメカニズムには、FA酸化または抗酸化反応の改善効果が含まれます。 以前の研究では、オメガ-3 FA投与により、ミトコンドリアのFAベータ酸化が改善され、5/6Nxラットモデルで抗酸化作用が示されたことが報告されています[19]。 オメガ-3FAが筋細胞、マクロファージ、神経細胞におけるPGC -1、Nrf1、SIRT1の発現を増加させることを示唆する報告もあります[3,10,11]。 CKDモデルのミトコンドリアに対するオメガ-3FAの影響はまだ報告されていないため、このCKDモデルを使用して、オメガ-3FAがミトコンドリア生合成関連分子とmtDNAの回復に効果的であることを示しました。勉強。
mTORとAMPKはどちらもミトコンドリア生合成に関与していますが、その役割は栄養状態によって異なります。 ラパマイシン複合体1（mTOC1）のターゲットであるmTORは、アミノ酸やグルコースなどのエネルギー刺激を介して活性化され、同化プロセスとミトコンドリア生合成につながる経路をトリガーすることができます。 逆に、AMPKは低酸素症と栄養不足を介して活性化される可能性があり、これは異化プロセスとミトコンドリア生合成の活性化につながり、mTOC1を介したエネルギー消費を阻害します[2]。 この研究では、pAMPK / AMPKの減少だけでなく、CKDモデルのmTORの減少も示しました。 さらに、オメガ-3 FA投与は、mTOR発現のほぼ回復をもたらしましたが、pAMPK/AMPKの減少の回復はありませんでした。 したがって、オメガ-3 FAは、ミトコンドリア生合成の減少を軽減する可能性があります。腎臓CKD動物モデルの。 ただし、CKD患者でmTORが減少するかどうか、およびオメガ-3 FA治療によるmTOR発現の増加がミトコンドリアの健康とCKDの進行にどのように影響するかを明らかにするには、さらなる研究を行う必要があります。
FoxO1と3はPGC-1プロモーターに結合し、その転写を促進します[20,21]。 ただし、この研究では、FoxO1と3は、Nxグループで増加し、オメガ-3FAグループで処理されたコントロールとNxで減少することがわかりました。 したがって、FoxO1および3の発現は、CKDのPGC -1を減少させるか、オメガ-3FA投与によってPGC-1を増加させる代償反応に関連していると考えられます。 Nrf2は、細胞の酸化還元恒常性とミトコンドリア生合成において重要な役割を果たします。 Nrf2分解に関連する3つのユビキチンリガーゼシステムがあります（Keap1、-トランスデューシンリピート含有タンパク質、およびE3ユビキチンリガーゼ滑膜）[22]。 この研究では、対照群と比較して、Nx群でNrf2の有意な減少とKeap1の有意な増加を示しました。dしかし、オメガ-3 FA群で治療したNxでは、Keap1の発現が見られました。減少し、Nrf2が増加しました。 結果は、CKDラットモデルにおけるオメガ-3 FA投与の改善された抗酸化効果が、ミトコンドリア生合成を強化する可能性のあるKeap1発現およびNrf2分解の減少に関連している可能性があることを示唆しています。 この研究で得られた結果に基づいて、CKD環境におけるFoxO1 / 3とNrf2の因果関係、およびオメガ-3FA投与の影響を解明するためにさらなる研究が必要です。
CISTANCHEは腎臓/腎感染症を改善します
Nrf2の分子量は、この研究および他の最近の研究[23,24]で68キロダルトン（kDa）の領域で発見されました。 ただし、以前の研究では、生物学的に関連するNrf2の分子量は95〜110 kDaであり、証拠が示されています[25,26]。 また、生物学的に関連性のあるNrf2として疑われるバンドも見つかりました（補足図S8）。 生物学的に重要なNrf2の分子量を見つけるには、さらなる研究が必要です。 以前の研究では、5/6 Nx後28日目のミトコンドリアの変化が報告されており、ベータ酸化、酸化的リン酸化、および内膜構造タンパク質に関連する遺伝子またはタンパク質の発現の減少を示していますが、結果はありませんでしたPGC-1式に関連する[27,28]。 この研究では、ミトコンドリア生合成に関連する分子とミトコンドリア生合成を反映するmtDNAが、ラットの5/6 Nx後45日目に変化が観察されたため、慢性期に調節されることを確認しました。 組織学的および生物学的改善にもかかわらず、オメガ-3FA治療は機能回復をもたらさなかった腎臓Nxモデルと比較して。 したがって、omega -3 FAが復元に効果的かどうかを判断するには、さらなる調査が必要です。腎臓機能ミトコンドリア機能を改善するかもしれない効果を誘発することによって。 この研究にはいくつかの制限があります。 まず、ミトコンドリア呼吸鎖におけるクエン酸シンターゼ活性とスーパーオキシド形成を評価しませんでした。 第二に、OmacorのどのFA成分が主にミトコンドリア生合成関連分子に影響を与えるかについては実験しませんでした。 第三に、ミトコンドリア生合成関連分子を改善するための明確なメカニズムを実証しませんでした。 酸化ストレスを軽減する抗炎症効果と、代謝化合物としてのオメガ-3酪酸自体が、このメカニズムに関連している可能性があることを示唆しています。
4.材料と方法ミトコンドリア生合成
4.1。 動物と実験計画研究は、Japan SLC、Inc.（静岡県）から購入したオスのSprague-Dawleyラット（9-週齢）で実施されました。 すべてのラットは、偽の対照または5/6Nxのいずれかに供された。 動物を含むすべての手順は、東亜大学の施設内動物管理委員会（DIACUC -14-4）の承認に従って実施されました。 ラットは標準的な条件下で飼育され、水道水と標準的な食餌を自由に摂取できるようにした。 すべてのラットを以下のグループに割り当てた：グループ1（偽の対照、n=6）、生理食塩水（胃洗浄により1mL / kg /日）を維持した対照ラット。 グループ2（Nxグループ、n=6）、生理食塩水（胃洗浄により1mL / kg /日）を維持したNxラット。 グループ3（オメガ-3 FAグループ）、オメガ-3FAで治療されたNxラット。 オメガ-3FA（Omacor、胃洗浄による300 mg / kg / day、Pronova Biocare、Sandefjord、ノルウェー）の用量と投与経路は、以前の研究に基づいて決定されました[19]。 オマコールは海洋由来のオメガ-3FAであり、1gのオマコールに460mgのエイコサペンタエン酸（EPA）と380 mgのドコサヘキサエン酸（DHA）が含まれています。 Omacorは通常、心筋梗塞および高トリグリセリド血症治療後の二次予防のために処方されます[29]。 2つのオメガ-3FA（EPAとDHA）は、Omacorの主要成分（84％）であり、製薬上調製された有効成分です。
マイナーコンポーネントを克服する構成（16パーセント）。 臨床研究で心血管疾患のリスクを低下させたため、抗炎症作用と酸化ストレスの軽減を伴うオメガ-3FAサプリメントにオマコールを選択しました[30]。 ラットに均等に給餌し、体重を毎日観察した。 ラットは、手術後15週間、水道水を自由に摂取できるようにし、その後、ジエチルエーテル麻酔下で安楽死させました。 死亡時に、大動脈の血液サンプルを収集し、3000rpmで10分間遠心分離しました。 の変更を識別するには腎臓機能、BUNおよびsCrレベルは、自動分析装置（Roche、ドイツ）を使用して測定しました。
4.2。 組織病理学的検査。ホルマリン固定肝臓組織をパラフィンに包埋し、スライス（4 µm）に切断し、過ヨウ素酸シッフで染色しました。 組織病理学的変化は、Aperio ScanScope（Aperio Technologies、Vista、CA、USA）で観察されました。
4.3。 RNAの分離と定量的リアルタイムPCR分析。全RNAはから抽出されました肝臓TRIzol試薬を使用した組織。 次に、M-MLV cDNA合成キット（Enzynomics、大田、韓国）を使用して、1 µgのトータルRNAを一本鎖cDNAに変換しました。 プライマーは、Primer3およびmfoldソフトウェアを使用してそれぞれの遺伝子配列から設計されました。 定量的リアルタイムPCR分析では、cDNAを遺伝子特異的プライマーを使用してPCR増幅しました：ラットPGC 1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT -30（センス）、50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT -30（アンチセンス）; ラットNrf1 50-GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT -30（センス）、50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT -30（アンチセンス）; ラットSIRT3、50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30（センス）、50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30（アンチセンス）; ラットSIRT1、50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30（センス）、50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30（アンチセンス）; ラット-アクチン、50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30（センス）、50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30（アンチセンス）。 リアルタイムPCRは、SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）とABI 7500機器（Applied Biosystems、Waltham、MA、USA）を使用して実施しました。
CISTANCHEは腎臓/腎臓の痛みを改善します
4.4。 ウエスタンブロッティングと免疫沈降。ウエスタンブロッティングは、わずかな変更を加えて前述のように分析しました[10]。肝臓組織を溶解バッファー（PRO-PREPタンパク質抽出溶液）でホモジナイズし、インキュベートし（4°Cで30分）、遠心分離しました（14、000 rpmで4°Cで20分間）。 タンパク質の濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）によって決定されました。 同等のタンパク質サンプルを7.5〜15パーセントのSDS-PAGEにロードし、ニトロセルロースメンブレン（Amersham Pharmacia Biotech、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）に転写しました。 次に、タンパク質を各抗体で免疫ブロットしました。 PGC -1およびSIRT1に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA、USA）から入手しました。 AMPK、pAMPK、Nrf1、SIRT3、FoxO1、FoxO3a、およびmTORに対する抗体は、Cell Signaling Technology（Danvers、MA、USA）から購入しました。 Nrf2、Keap1（モノマー）、および-アクチンに対する抗体は、Abcam（ケンブリッジ、マサチューセッツ、米国）およびSigma（セントルイス、ミズーリ、米国）から購入しました。 免疫沈降では、合計500 µgのタンパク質をPGC -1抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）およびプロテインA / Gプラスアガロースビーズ（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、 USA）、4°Cで一晩混合します。 次に、免疫沈降物をSDS-PAG電気泳動を使用して分離し、アセチルリジン（Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州ビバリー）およびホスホセリン（MerckMillipore、米国マサチューセッツ州バーリントン）抗体を使用して免疫ブロットしました。 続いて、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とともに室温で60分間インキュベートしました。 タンパク質レベルは-アクチン（ImageJバージョン1.48q）によって標準化されました。 ウエスタンブロッティングおよび抗体を用いた免疫沈降分析は、Super Signal West Pico強化化学発光基質（Thermo Scientific、ハドソン、ニューハンプシャー、米国）を使用して実行し、LAS -3000 Plus（Fuji Photo Film、東京、日本）を使用して検出しました。
4.5mtDNA含有量の測定qPCRを使用して、mtDNAの相対的な含有量を決定しました。 反応は、3 ngの全DNAをテンプレートとして使用し、次のプライマーを使用してSYBR Greenケミストリーを介して実行しました：ラットmtDNA 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA -3'（センス）、5、-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA -3'（アンチセンス）; ラットp-アクチン、5'- CCCAGCCATGTACGTAGCCA（センス）、C- CGTCTC- CGGAGTCCATCAC f（アンチセンス）。 核DNAに関連するmtDNA含有量は[31]で報告されました。
4.6統計分析統計分析は、SPSS 18. 0ソフトウェア（IBM Corp.、Armonk、NYP USA）を使用して実行されました。 結果は平均土SDとして表されます。 グループの平均は、分散分析とそれに続くテューキーの多重比較によって比較されました。 pe0。05は統計的に有意であると見なされました。
5。結論
結論として、ミトコンドリア生合成に関連するメディエーターの発現の有意な調節がCKDラットモデルで観察された。 オメガ-3FAは、Nrf1とNrf2をアップレギュレートすることにより、ミトコンドリア生合成を改善する可能性があります。 この保護メカニズムは、PGC -1の発現の増加と、SIRT1 / 3産生の増加によって引き起こされたPGC-1の脱アセチル化によって開始される可能性があります（図5）。 図5.CKDのミトコンドリア生合成に対するオメガ-3FAの影響。 太い黒の矢印は、CKDラットモデルにおけるミトコンドリア生合成に関連するメディエーターの発現を示しています。 赤い矢印は、オメガ-3FA投与後のメディエーターの発現を示しています。 上/下矢印は、メディエーターの発現の増減を示します。
