D-ガラクトース誘発老化ラットの記憶機能、ミトコンドリア動態、酸化ストレス、神経炎症に対する運動と MitoQ の神経保護効果パート 2
Sep 02, 2024
2.6.組織の準備
8 週間の TE および記憶行動試験を完了した後、すべてのラットを CO2 吸入によって安楽死させ、各治療グループの 7 匹の動物から脳組織を採取しました。
記憶動作テストは、記憶力を評価するための効果的なツールです。社会的および仕事上のプレッシャーの増大に伴い、人々の記憶の重要性はますます高まっています。したがって、記憶行動テストを受けると、自分の記憶レベルを理解し、テスト結果に応じて記憶力を向上および維持するための効果的な措置を講じることができます。
具体的には、記憶動作テストは、情報を受信、処理、保存、取得する人々の能力を評価できます。言語、数字、画像などのさまざまな種類の情報をテストすることで、人々の記憶を完全にテストできます。テスト結果は、自分の弱点と強み、そして記憶力を強化する方法を理解するのに役立つさまざまなスコアを提供します。
実際には、多くの記憶動作テストでは専門的なヒントや提案も提供されます。たとえば、質の高い睡眠、バランスの取れた食事、適切な運動、定期的な頭の体操はすべて、人々の記憶力を向上させるのに有益です。これらの方法を通じて、記憶保持時間や記憶再現能力などを強化し、日常生活や仕事のニーズによりよく適応することができます。
つまり、記憶行動テストは、自分の記憶力を理解し、評価し、改善するのに非常に役立ちます。また、より充実した豊かな生活のための強固な基盤を築くために、実際の状況に応じて記憶力を強化するための適切な方法を採用する必要があります。私たちは記憶力を改善する必要があることが分かります。カンザスは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つが記憶力の向上であるため、カンザスは記憶力を大幅に向上させることができます。シスタンケの効果は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体など、含まれるさまざまな有効成分によってもたらされます。これらの成分は、さまざまな方法で脳の健康を促進します。
大脳皮質と海馬を分離した後、脳組織を液体窒素中で急速冷凍し、分析まで-80℃で保存しました。残りの5匹の動物は免疫組織化学(IHC)分析に使用した。
胸腔を開いた後、50mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を左心室に10分間通過させ、次いで動物を100mM PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で灌流した。
灌流固定後、脳を採取し、4% PFA に入れ、4 ℃で 4 時間固定しました。固定された脳組織を 30% スクロース溶液に 2 日間浸漬し、その後クライオスタットを使用して厚さ 40 μm のスライスに切断しました ( Leica Microsystems、ヌスロッホ、ドイツ）。
2.7.ミトコンドリアの分離
ミトコンドリアを単離するために、メーカーの指示に従ってミトコンドリア抽出キット (IMGENEX Corporation、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用しました。海馬組織 100 mg ごとに、1 mL の均質化バッファーを添加しました。
均質化後、組織を 900 x g、4 °C で 10 分間遠心分離し、上清を回収し、再度 15,000 x g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。
遠心分離した細胞質ゾル画分を採取し、細胞質ゾルを分離し、残ったペレットを 1 mL の懸濁緩衝液で完全に混合した後、15,000 x g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。
上清を除去し、さらに 1 mL の懸濁緩衝液を加えて完全に混合し、再度 15,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。
上清を除去し、残ったペレットを 1 mL の完全ミトコンドリア溶解緩衝液に 4 ℃で 30 分間溶解しました。次に、ミトコンドリア抽出物を 15,000 x g、4°C で 5 分間遠心分離し、上清 (ミトコンドリア画分) を回収しました。
2.8.ウェスタンブロッティング
ミトコンドリアの単離によって得られた総タンパク質は、ブラッドフォード法を使用して定量されました。等量のミトコンドリアタンパク質 (レーンあたり 30 μg) をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) にロードしました (8% または 12%)。
電気泳動後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Millipore、ボストン、マサチューセッツ州、米国) に転写しました。
5% BSA を含む Tween-20 (TBS-T) 溶液を含む 1×Tris 緩衝生理食塩水で室温で 1 時間ブロッキングを行い、その後メンブレンを一次抗体と 4 °C で一晩反応させました。
次の一次抗体を使用しました: Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1、p22 phox、p47 phox、gp91phox、SOD-2、カタラーゼ、および -actin (Santa Cruz Biotechnology、ダラス、テキサス州、米国、希釈:1) :1000);およびＴＮＦ−（アブカム、ケンブリッジ、英国、希釈：１：１０００）。
次いで、膜を洗浄緩衝液（0.1% Tween 20を含むPBS）で洗浄し、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（p22 phox、gp91 phox、およびTNF用）とともにインキュベートしました。 - (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国、希釈: 1:5000)。
HRP結合ヤギ抗マウス二次抗体を、Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1、p47 phox、SOD-2、カタラーゼ、およびアクチンに使用しました（Santa Cruz Biotechnology、希釈：1:5000）。
タンパク質発現レベルは、ECLウェスタンブロット検出システム(Santa Cruz Biotechnology)を使用して検出した。発現したタンパク質バンドの密度を、ChemiDoc XRS ゲルイメージング システム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA) を使用して分析しました。
2.9.免疫組織化学 (IHC)
IHC 分析では、各治療グループの選択された組織に対して浮遊法が使用されました。組織を0.01 M PBS中でそれぞれ10分間3回洗浄した後、組織を0.01 M クエン酸ナトリウムを含むビーカー中で80℃で60分間インキュベートし、その後10%クエン酸ナトリウムでブロッキングした。正常ロバ血清（Millipore Sigma、米国マサチューセッツ州バーリントン）。
次いで、組織サンプルを一次抗体である抗p22 phox (Santa Cruz Biotechnology、希釈率: 1:500) および抗グリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) (Abcam、希釈率: 1:500) と 12 分間反応させました。 4℃でh。翌日、組織を０．０１Ｍ ＰＢＳ中で各５分間×３回洗浄し、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、希釈：１：５０００）と室温で２時間反応させた。
最後に、Vectastain-Elite ABC キット (Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム) 溶液を使用して組織を室温でインキュベートし、DABPeroxydase Substrate Kit (Vector Laboratories) を使用して結果を視覚化しました。
各組織切片を封入剤（Vector Laboratories）を使用してスライド上に固定し、光学顕微鏡（Leica Microsystems）を使用して検査した。
2.10.統計分析
データは、SPSS for Windows バージョン 18.0 (SPSS Inc.、米国イリノイ州シカゴ) を使用して分析されました。すべての値は平均値±SEMとして表されます。統計的有意性は、一元配置分散分析を使用して決定されました。ボンフェローニ事後検定を多重比較に使用しました。差異は、p < 0.05 で統計的に有意であると見なされました。
3. 結果
3.1. D-Gal誘発老化ラットの海馬におけるミトコンドリア動態関連タンパク質の発現に対するトレッドミル運動とMitoQの影響
我々は、TE および MitoQ が、高齢ラットの海馬におけるミトコンドリア融合関連因子 (Mfn1、Mfn2、Opa1) および核分裂関連因子 (Drp1、Fis1) に影響を与えることを確認しました (図 1)。
ミトコンドリア融合関連因子の発現レベルは治療群間で有意に異なりました（Mfn1、F4、34=134.750、p < 0.001; Mfn2、F4、34=80）。 816、p < 0.001;Opa1、F4、34=51.456、p=0.001)。
ミトコンドリア分裂関連因子の発現レベルも治療群間で有意に異なりました（Drp1、F4、34=53.448、p < 0。001; Fis1、F4、34=116 .313、p < 0.001)。事後テストの結果を図 1 に示します。
Y-CON群と比較して、D-CON群ではミトコンドリア融合関連因子の発現が減少し、D-TE、D-MI、D-COMBI群では増加傾向を示した。
一方、ミトコンドリア分裂関連因子Drp1の発現は、D-CON群ではY-CON群に比べて増加した。ミトコンドリア分裂シグナルはTEとの併用治療により減少しましたが、MitoQ治療単独では有意な変化は誘発されませんでした。
他のミトコンドリア分裂関連因子である Fis1 は、Drp1 と同じ減少傾向を示しましたが、MitoQ 治療単独でも減少しました。
図 1. D-ガラクトース (D-gal) 誘発老化ラットの海馬におけるミトコンドリア動態関連タンパク質の発現に対するトレッドミル運動とミトキノン (MitoQ) の効果。 (A) ミトコンドリア融合タンパク質および分裂関連タンパク質の代表的なウェスタンブロット。 (B – F) -アクチンに対して正規化されたウェスタンブロットバンドの濃度測定分析。ウェスタンブロットで示されたデータは、7 匹のラットの脳からの平均です。
-アクチンを内部対照としてプローブしました。分散分析の後にボンフェローニ事後検定を使用しました。値は平均値 ± SEM です。
a 若年対照群（Y-CON）群との統計的差異を示します。 b D-ガラクトース群（D-CON）群との統計的差異を示します。 c は、D-ガラクトースとトレッドミル運動 (D-TE) グループとの統計的差異を示します。
dは、D-ガラクトースとMitoQ（D-MI）グループとの統計的差異を示します（p < 0.05）。 D-コンビ; D-ガラクトースとTEおよびMitoQグループ。
3.2. D-Gal誘発老化ラットの大脳皮質および海馬におけるNADPHオキシダーゼサブユニットの発現に対するトレッドミル運動とMitoQの影響
我々は、高齢ラットの大脳皮質と海馬におけるp22 phoxの免疫反応性において、治療群間で有意な差を観察しました（図2）（CA3、F4、24=18.786、p < 0。{{11 }}01; 皮質、F4、24=12.662、p < 0.001)。
皮質では、D-CON グループは Y-CON グループと比較して p22 phox の免疫反応性の増加を示しましたが、D-TE、D-MI、および D-COMBI グループでは顕著に減少しました。
CA3 では、p22 phox の免疫反応性の増加は、D-CON と比較して D-TE および D-COMBI グループで減少しました。 NOX サブユニット p22 phox、gp91 phox、および p47phox のタンパク質発現レベルは、グループ間で有意に異なりました (p22 phox、F4、{{10}}.513、p < 0。{{24} }01; gp91 フォックス、F4、34=57.282、p < 0.001; p47 フォックス、F4、34=69.249、p < 0.001)。
ポストホテストの結果は、Y-CON と比較して D-CON の NOX サブユニットレベルが大幅に増加していることを示しました。しかし、NOX サブユニットレベルは、D-CON グループと比較して、すべての介入グループで低かった。
特に、p22 phox および gq91 phox の発現は、D-MI 群と比較して D-TE で有意に減少していました。これらの発見は、運動と MitoQ はそれぞれ老化によって誘発される脳の酸化ストレスを予防するが、それらを組み合わせても追加の効果は生じないことを示唆しています。
図 2. D-gal 誘発老化ラットの大脳皮質および海馬における NADPH オキシダーゼ サブユニットの発現に対するトレッドミル運動と MitoQ の効果。 (A1) 各群のD-gal誘発老化ラットの大脳皮質および海馬におけるNAPDH p22 phox免疫反応性を示す顕微鏡写真。 A1 内の黒い四角は、f-i および p-t で示される画像の部分を示します。 (A2、A3) 大脳皮質および海馬における NADPH p22 phox 染色の光学密度の定量化。
ANOVA 後のボンフェローニ事後検定。値は平均値±標準誤差として表されます(n=5 匹の動物)。 (a–e および k–o) スケール バー=100 μm、(f–j および p–t) スケール バー=50 μm。 (B) 海馬の NADPH オキシダーゼ サブユニットの代表的なウェスタン ブロット画像。
(C – E) 海馬内の NADPH オキシダーゼ サブユニットの定量。ウェスタンブロットで示されたデータは、7 匹のラットの脳からの平均でした。 -アクチンを内部対照としてプローブしました。 Bonferroni 事後検定は ANOVA 後に使用されました。値は平均値 ± SEM です。
a Y-CONグループとの統計的差異を示します。 b は D-CON グループとの統計的差異を示します。 c D-TE グループとの統計的差異を示します (p < 0.05)。
3.3. D-Gal誘発老化ラットの大脳皮質および海馬歯状回におけるGFAP発現に対するトレッドミル運動とMitoQの効果
我々は、高齢ラットの大脳皮質と海馬歯状回（DG）におけるGFAP免疫反応性において、治療群間で有意な差を観察しました（図3）（皮質、F4、24=13.524、p<0.001） ; DG、F4、24=30.364)。
事後試験の結果は、D-gal 処理が皮質と DG の両方で GFAP 免疫反応性を有意に増加させることを示しました。
D-CON グループと比較して、皮質の GFAP レベルはすべての介入グループで低下し、DG の GFAP レベルは D-TE および D-COMBI グループで低下しましたが、D-MI グループでは GFAP 免疫反応性のみに違いが見られました。皮質領域で。
したがって、TE または MitoQ 治療は皮質における D-gal 誘発神経炎症を軽減しましたが、DG では TE 介入のみがプラスの効果をもたらしました。
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