神経炎症のinvitroモデルにおけるイソチオシアネートの神経保護の可能性
Mar 27, 2022
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp：008618081934791
Tiziana Latronico1・Marilena Larocca2・Serafna Milella1・Anna Fasano1・Rocco Rossano2・Grazia Maria Liuzzi1
受理：2020年7月10日/受理：2020年10月25日/オンライン公開：2020年11月16日
©著者2020
Cistancheハーブパウダー機能：とても良いです神経保護効果
概要
アブラナ科の野菜にグルコシノレート前駆体として存在するイソチオシアネート（ITC）は、抗炎症薬、抗酸化、および抗発癌活性。 ここでは、ROSの生成と、さまざまな神経疾患の重要な病因を表すマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）-2および-9の発現に対する3つの異なるITCの影響を比較しました。 ラット星状細胞の初代培養はLPSによって活性化され、同時に異なる用量のアリルイソチオシアネート（AITC）、2-フェネチルイソチオシアネート（PEITC）、および2-スルフォラファン（SFN）で処理されました。 結果は、SFNとPEITCがH2O2によって誘発されるROS産生を打ち消すことができることを示しました。 細胞培養上清のザイモグラフィー分析は、PEITCとSFNがMMP -9の最も効果的な阻害剤であるのに対し、SFNのみがMMP-2活性を有意に阻害することを証明しました。 PCR分析は、使用されたすべてのITCがMMP-2とMMP-9の両方の発現を有意に阻害したことを示しました。 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路に関する調査は、ITCが細胞外調節プロテインキナーゼ（ERK）活性を阻害することによってMMP転写を調節することを示しました。 この研究の結果は、ITCがMMPの関与に関連する神経疾患の予防と補完的治療のための有望な栄養補助食品である可能性があることを示唆しています。
キーワード抗酸化剤・抗炎症剤・イソチオシアネート・マトリックスメタロプロテイナーゼ・神経変性疾患
序章
神経炎症は、中枢神経系（CNS）の常在細胞の活性化につながる生化学的イベントのカスケードを含む、脳損傷に対する複雑な反応です。 アストロサイトの異常な活性化は、活性酸素種（ROS）、一酸化窒素（NO）、サイトカイン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテアーゼなどの炎症性メディエーターの放出につながる神経保護の役割を損ないます
（MMP）。
MMPは、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニンなどの細胞外マトリックス（ECM）の成分を主要な標的とする、中性のZn2プラス依存性エンドペプチダーゼの大きなファミリーです（Latronico and Liuzzi2017）。
Tiziana Latronico
tiziana.latronico@uniba.it
バーリ大学「アルドモロ」、生物科学、バイオテクノロジー、および生物薬剤学科、
イタリア、バーリ
バジリカータ大学ポテンツァ校理学部、
イタリア
CNSでは、MMPは、形態形成、代謝回転、ECMのリモデリング、胚形成、創傷修復などのさまざまな生理学的反応に関与しています。 ただし、MMPが規制メカニズムから逃れると、有害になります（Rosenberg 2009; Agrawal et al.2008）。
この点で、MMPの発現と活性の変化は、いくつかの神経障害における重要な病因イベントであることが知られています（Latronico and Liuzzi 2017; Mastroianni and Liuzzi 2007; Brkic et al.2015）。 実験的証拠は、MMPの中で、ゼラチナーゼA（MMP -2）およびB（MMP -9）は、それらのアップレギュレーションが血液脳関門（BBB）の完全性を損なう可能性があるため、特に神経炎症に関与していることを示唆しています。 これにより、免疫末梢血細胞の脳実質への動員と浸潤が増加し、進行性の神経細胞の喪失と神経機能の障害の原因となる炎症過程が永続化します（Rivest2009）。 いくつかのinvitroおよびinvivo研究は、ROS産生がマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路依存性メカニズムを介した脳細胞におけるMMP -9発現のアップレギュレーションに関与する要因の1つであることを示しています（Hsiehおよびヤン2013）。
この証拠に基づいて、神経毒反応の低下をもたらす神経毒因子のダウンレギュレーションは、脳疾患の発症を予防または進行を緩和するための効果的な治療戦略を表す可能性があることは明らかです。
近年、神経分野における生物医学的関心は、神経炎症反応に関連するプロセスを調節することができる天然化合物の研究にますます焦点を合わせています。 この点で、いくつかの研究は、ポリフェノール、イソチオシアネート（ITC）などの植物化学物質が、MMPの発現を阻害し、ROS産生を中和する能力に由来する神経保護の可能性を持っていることを示しています（Dinkova-KostovaおよびKostov 2012; Liuzzi et al。2007、2011）。
イソチオシアネートは、病原体の攻撃に対する防御システムとして、アブラナ科に属するいくつかの植物によって生成される代謝物です（Bones and Rossiter2006）。 それらは、酵素ミロシナーゼによるグルコシノレート（GSL）の酵素分解に由来します。 ITCは、ブロッコリー、ブリュッセルもやし、キャベツ、カブ、西洋わさび、コールラビ、マスタード、大根、クレソン、ケールなどの一般的に消費されるアブラナ科の野菜に含まれています。 食品中のそれらの量は非常に変動し、食品加工と調理に依存します。
最近、ITCが抗酸化作用、抗菌作用、抗炎症作用、化学予防作用など、さまざまな治療効果を持っていることが示されています（Dufouretal。2015;Marzoccoet al.2015）。
ITCの保護活動は、解毒、炎症、アポトーシス、および細胞周期の調節に関与するさまざまなシグナル伝達経路の調節を通じて実行されます。 いくつかの証拠は、ITCの抗発がん性および抗炎症性は、主に核因子赤芽球2-関連因子2（Nrf2）経路を活性化する能力に起因する可能性があることを示しています。 Nrf2は酸化還元感受性の転写因子であり、求電子性物質と酸化ストレス状態の存在下で核に移行し、そこで抗酸化応答エレメント（ARE）に結合し、解毒と酸化状態の調節に関与する細胞保護遺伝子の発現を誘導します。炎症過程（Heiss et al 2001）。 この点で、ITCはフェーズII解毒酵素の発現を誘導し、GSH産生をアップレギュレーションすることにより、ヒト細胞の抗酸化能を高めることができると報告されています（Wagner et al2010）。 さらに、炎症の調節をもたらすNrf2と核因子（NF）-κB経路の間にクロストークが存在することが報告されています（Sturm and Wagner 2017; Lee and Johnson2004）。 この点で、神経炎症のさまざまな実験的invitroおよびinvivoモデルは、ITCが炎症性サイトカインおよびMMPの結果としての阻害を伴うNF-κB転座を有意に減少させることができることを示しました（Lee et al.2015; Subedi et al.2017）。
この論文では、3つのITC、すなわちアリルイソチオシアネート（AITC）、2-フェネチルイソチオシアネート（PEITC）、および2-スルフォラファン（SFN）がMMPの放出に及ぼす影響を調査しました-2 -9およびLPS活性化星状細胞によるROS産生について。 私たちの結果は、PEITC、SFN、およびAITCが、LPSで活性化された星状細胞におけるMMP-9およびMMP-2の発現をinvitroで阻害し、H2O2によって誘導されるROS産生を打ち消すことができることを証明しました。 さらに、ITCが細胞外調節プロテインキナーゼ（ERK）活性の阻害に関連するメカニズムでMMPの過剰発現を調節することを実証しました。 これらの結果は、アブラナ科の野菜が豊富な食事が神経疾患の予防と補完的治療に潜在的な利益をもたらす可能性があることを示唆しています。
材料および方法
化学薬品および試薬
ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンは、GIBCO（Paisley、Scotland）から提供されました。 ゼラチン、DNase 1、ポリ-L-リジン
（PLL）、トリプシン、リポ多糖（LPS）、トリパンブルー、3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2。5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT ）、アリルイソチオシアネート（AITC）[cod。 377,430、純度95％（HPLC）]、2-フェネチルイソチオシアネート（PEITC）[cod。 253,731、純度99％）]、2-スルフォラファン（SFN）[cod。 S6317、純度95％以上（HPLC）]は、Sigma（セントルイス、ミズーリ州、米国）から提供されました。 2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）はCalbiochemから購入しました。 標準タンパク質とR-250Coomassie Brilliant Blueは、Bio-Rad（Hercules、CA、USA）から入手しました。 抗グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）抗体（RRID：AB _2294571）は、Serotec（Oxford、UK）から購入しました。 細胞外調節プロテインキナーゼ（ERK）1/2およびリン酸化ERK 1/2（p-ERK 1/2）に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA）から入手しました。 Hybond-P PVDFメンブレン、強化化学発光（ECL）ウエスタンブロッティング分析システム、および抗マウスHRP二次抗体はGEから入手しました。
ヘルスケアライフサイエンス（リトルチャルフォント、バッキンガムシャー、
イギリス）。 MMP -2、MMP -9、および18S rRNAに固有のプライマーペアは、Sigma Genosys（Cambs、UK）から入手しました。 RNeasyミニキットおよびQuantiTect逆転写キットはQiagen（Valencia、CA、USA）から購入しました。 PCR用のEcono-TaqPLUSGREEN 2Xマスターミックス試薬は、Lucigen Corporation（Middleton、WI、USA）から購入しました。
倫理声明
動物を含む実験は、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドの推奨事項に従い、イタリアのバーリ大学の施設内動物管理使用委員会の承認を得て実施されました（許可番号：23-98- A）。
アストロサイト培養の準備
アストロサイトは、{{0}}日齢のウィスターラット（RRID：RGD _737960、Harlan Laboratories srl、イタリア、ウディネ）の新皮質組織から調製しました。 アストロサイトの調製には、12匹の子の6リットルを使用し、雌雄それぞれを使用しました。 動物は二酸化炭素（CO2）への暴露によって安楽死させられ、急速な断頭によって殺された。 新皮質組織を解剖し、ラトローニコらによって報告された方法に従って初代グリア細胞培養物の精製に使用した。 （2 0 18）。 簡単に説明すると、解剖後、ラットの脳から髄膜と血管を枯渇させ、機械的に細かく切り刻み、0。01パーセントのDNaseの存在下で0。25パーセントのトリプシンで消化しました。 遠心分離と細胞生存率の評価後、細胞をPLLコーティングフラスコ（75 cm2）に、DMEM、10％FBS、100 IU mL -1ペニシリン、100 µgmL-1ストレプトマイシン中1.5×107細胞/フラスコの密度で播種しました。 、および5パーセントのCO2で37度に維持されます。 7日後、フラスコを振とうしてオリゴデンドロサイトとミクログリアを除去した。 トリプシン処理（0.25パーセントトリプシン/0.02パーセントEDTA）によって得られた星状細胞の純度は、GFAPの免疫染色によって評価されました。
LPS活性化星状細胞のアリルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネートまたは2-スルフォラファンによる治療
96ウェルプレートに播種されたコンフルエントな星状細胞を10µg mL -1のLPSで刺激し、同時に異なる濃度のアリルイソチオシアネート（AITC）、2-フェネチルイソチオシアネート（PEITC）、または2-スルフォラファンで処理しました。 （SFN）無血清DMEM。 無血清DMEMおよびLPS活性化星状細胞の星状細胞は、それぞれ陰性および陽性対照を表した。 さらに、AITC（100 µM）、PEITC（67 µM）、およびSFN（56.4 µM）のストック溶液はDMSOで作成されたため、DMSOに対する用量反応曲線は、分析されたサンプルは、化合物の毒性を推定するために実行されました。 37度で20時間培養した後、5％CO2の上清を収集し、使用するまで-20度で保存しました。一方、細胞はMTTアッセイを行って、細胞の生存率を評価しました。
MTT細胞生存率アッセイ
アストロサイトに対するAITC、PEITC、およびSFNの細胞毒性は、MTT [{{0}}（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）- 2、{{5 }}ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイ。 このアッセイは、生細胞内のミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼによるMTTの、分光光度法で測定できる不溶性の青いホルマザン生成物への還元に基づいています。 簡単に説明すると、AITC、PEITC、またはSFNで20時間処理した後、培地を除去し、細胞に0.5mgmL-1のMTTをロードしました。 37度で2時間インキュベートした後、5％CO2培地を除去し、細胞内のホルマザン結晶を90％エタノールで可溶化しました。 結晶を完全に可溶化するためにプレートを15分間振とうした後、ホルマザン生成物の量を、参照波長690nmでの560nmでの吸光度によって決定しました。 細胞生存率は、100％に設定された未処理の細胞で表されるコントロール（CTRL）のパーセンテージとして表されました。 各化合物について、細胞生存率の用量反応曲線が得られた。
活性酸素種の検出
活性酸素種（ROS）の検出は、フェノールレッドを含まないDMEMに10μMの2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）を37度で30分間アストロサイトにロードすることによって実行されました。 次に、DCFH-DAをウェルから取り出し、最終濃度100μMのH2O2の存在下で、フェノールレッドを含まないDMEM中のAITC（400μM）、PEITC（10μM）、またはSFN（25μM）で細胞を1時間処理しました。 。 DCFH-DAまたはH2O2のみで処理された細胞は、それぞれネガティブ（CTRL）およびポジティブコントロール（H2O2）を表しています。 インキュベーション後、細胞をPBSでリンスし、
Tris–HCl 10 mM / NaCl 150 mM / Triton X -100 0 .5パーセント、pH 7.5、
次に、10、000×g、4度で10分間遠心分離しました。 上清を収集し、それらの分光蛍光分析を、485nmでの励起下で525nmで実施した。 結果は総タンパク質含有量に対して正規化され、ROS産生は陽性対照に対するフォトルミネッセンス（PL）強度の相対パーセンテージとして表されました。
ゼラチナーゼの検出
細胞上清（SN）のゼラチナーゼ活性は、Latronicoetal。によって報告されたように酵素電気泳動分析によって検出されました。 （2 0 13）。 簡単に説明すると、総タンパク質約10 µgに相当する量のSNを、-メルカプトエタノールを含まない30 µlのLaemmliサンプルバッファーで可溶化しました。 サンプルは、0.1パーセント（wt / v）ゼラチンと共重合した7.5パーセントポリアクリルアミドゲルで泳動しました。 電気泳動を行った後、ゲルを2.5％Triton X -100 / 10mMCaCl2を含む50mMTris–HCl、pH 7.4で2回リンスし、1％TritonX-100で37度で24時間インキュベートしました。 / 50 mM Tris–HCl / 10 mM CaCl2、pH7.4。 ゲルをクマシーブリリアントブルーR-250で染色し、メタノール/酢酸/ H2O（4：1：5 v / v）で脱色しました。 ゼラチナーゼ活性は、ゲルの青色の背景上の明確な消化帯として視覚化され、Image LabTM Software（Bio-Rad Laboratories）を使用したコンピューター化されたデンシトメトリー画像分析によって定量化されました。 ゼラチナーゼ
活性は、光学密度（OD）×mm2として表され、基質溶解ゾーンの明るさと幅の両方を考慮に入れた曲線の下のスキャン領域を表します。 データは、次の式を使用して表されました：パーセント阻害= [100-（ODサンプル/ ODポジティブコントロール）×100]。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT‑PCR）
6ウェルプレートに播種された星状細胞は、LPS（10 µg mL-1）で活性化され、同時に最大非毒性濃度のITCで処理されました。 20時間のインキュベーション後、Qiagen RNeasyミニキットを製造元の指示に従って使用して、アストロサイトからトータルRNAを抽出しました。 相補的DNA（cDNA）は、QuantiTect逆転写キットを製造元の指示に従って使用して500ngのRNAから合成しました。 合計25ngの逆転写産物を使用して、特定のプライマーを使用して591 bpフラグメントを増幅しました（センス5'-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3';アンチセンス5'-GACACATGG GGC ACC TTCラットMMP-2配列のTGA-3'）および特定のプライマーを使用した541 bpフラグメント（センス5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGTATC3';アンチセンス5'-AAGACGAAGラットMMP-9配列のGGGAAGACG CAC ATC 3'）。 並行して、比較的不変の内部参照遺伝子であるラット18S rRNA（センス5'-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3';アンチセンス5'-TCATGGCCTCAGTTCCGAA-3'）の308bpフラグメントの増幅を行いました。 。 他の研究（Latronicoetal。2013;Liuzzietal。2004;Gramegnaet al。2011）ですでに検証されているプライマーセットは、PCRの予想サイズの単一バンドの増幅によって示されるように、目的の遺伝子のみを特異的に認識します。製品。 PCR増幅は、94度での変性、59度でのアニーリング、72度での伸長からなる25サイクルで実施されました。 増幅後、生成物を1.5パーセントアガロースゲルで分析しました。 ゲルのデンシトメトリー分析後、標的遺伝子の増幅は18S rRNA発現に対して正規化され、結果は、ゼラチナーゼ定量化について報告された陽性対照と比較した阻害のパーセンテージとして表されました。
ウエスタンブロット分析によるERK1/2リン酸化の検出
ERK 1/2は、Latronicoetal。で報告されているようにイムノブロット分析によって検出されました。 （2018）。 簡単に言えば、コンフルエントなプライマリ
{{0}}ウェルプレートに播種し、無血清培地で24時間静止させた星状細胞を、AITC（4 00μM）、PEITC（10μM）、またはフェノールレッドを含まないDMEM中のSFN（25μM）。 10 ug mL-1のLPSで2時間刺激した後、細胞を20 mM Tris–HCl、150 mM NaCl、2.5 mM Na-pyrophosphate、1 mM-glycerophosphate 1％Triton X -100、1mMで溶解しました。フェニルメチルスルホニルフルオリド、20 ug / mLアプロチニン、1 mM EGTA、1 mM Na-フルオリド、1 mM Na3VO4、pH7.5。 各サンプルの総タンパク質60ugを10％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、タンパク質をポリフッ化ビニリデンメンブレンにイムノブロットしました。 0.05％Tween 20、1％ミルク、1％ウシ血清アルブミンを含む150 mM NaCl、20 mM Tris–HCl（pH 7.5）で4度で一晩ブロッキングした後、モノクローナル抗p-で4度で一晩膜をプローブしました。 ERK 1/2抗体（1：500）。 次に、膜をトリス緩衝生理食塩水中の0.05パーセントTween 20で3回洗浄し、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体（1:20、000）で24度で2-時間プローブし、検出しました。化学発光が強化されています。 ERKの総量を評価するために、膜を剥がし、リン酸化されていないERK 1/2（1：500）に特異的な抗体とインキュベートしました。 バンド強度はブロットのデンシトメトリースキャンによって定量化され、ERK1/2のリン酸化レベルは非リン酸化ERK1/2に正規化され、陽性対照（LPSで処理された星状細胞）と比較したパーセンテージとして表されました。次の方程式：
パーセントpERK1/ 2 =（ODsample / ODpositiveコントロール）×100。
統計分析
データ分析は、GraphPad Prism 5. 0（GraphPad Software Inc.、San Diego、CA、USA）を使用して実行されました。 データは平均値±SDとして表された。 統計分析は、一元配置分散分析（ANOVA）と、それに続くダネットの多重比較事後検定を使用して実行されました。
結果
アストロサイトの生存率に対するイソチオシアネート化合物の影響
AITC、PEITC、またはSFNの細胞毒性を評価するために予備実験を実施しました。 この目的のために、精製された星状細胞を、5〜400 µMの範囲の濃度のITC化合物で、または方法のセクションで説明したように培地で希釈したDMSOで20時間処理しました。 図1に示すように、DMSOは、テストされたITCソリューションの濃度と一致するすべての使用濃度で毒性がありませんでした。 調査されたITCの中で、AITC
図1イソチオシアネート化合物で処理された星状細胞の細胞生存率。 コンフルエントな初代星状細胞を、アリルイソチオシアネート（AITC）、2-フェネチルイソチオシアネート（PEITC）、または2-スルフォラファン（SFN）で指定の濃度で20時間処理した後、MTTアッセイを行いました。 さらに、ストック溶液はジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解しているため、ITCサンプルに存在するのと同じ溶媒濃度（パーセント）で培養液で希釈したDMSOに対する用量反応曲線を各実験で実行して、 ITC毒性の信頼できる推定。 コントロール（CTRL）が表示されました
無血清DMEMで未処理の星状細胞からの香り。 グラフは、細胞生存率の用量反応曲線を表しており、対照と比較した細胞生存率として表されています。 60％を超える細胞生存率を決定する化合物の用量を、最大の非毒性濃度として選択しました。 値は、さまざまな細胞集団で実行されたn個の= 3実験の平均±SDです。 顕微鏡グラフは、さまざまな化合物で処理した後、位相差顕微鏡（倍率50倍）で観察された細胞形態の代表的な結果を示しています。
アストロサイトに対する毒性は低かった。 特に、AITCは400 µMまでの細胞に対して毒性がありませんでしたが、PEITCとSFNはそれぞれ10 µMと25 µMを超える濃度で毒性がありました。 顕微鏡観察により、MTTアッセイの結果が確認され、PEITCおよびSFNの毒性濃度では、星状細胞の数が減少し、残った星状細胞は細胞質に細胞毒性の変化を示しました。
過酸化水素処理した星状細胞のROS産生に対するITC化合物の保護効果
酸化ストレスに対するITCの保護効果を評価するために、星状細胞をPEITC、AITC、およびSFNで最大非毒性濃度で前処理し、H2O2で刺激しました。 H2O2によって誘発された細胞内ROS産生は、DCFH-DAによって分析されました。 図2に示すように、H2O2への曝露は
図2ITCで処理された星状細胞における活性酸素種（ROS）の生成。 材料と方法のセクションで報告されているように、2'、7'-ジクロロフルオレセイン（DCFA）の蛍光シグナルの変化を測定することにより、ROSの存在をアッセイしました。 6ウェルプレートに播種した星状細胞をDCFAで30分間前処理した後、最終濃度100μMのH2O2の存在下で10μMPEITC、400μMAITC、または25μMSFNで1時間処理しました。 。 DCFAのみ（CTRL）または100μMH2O2で処理された星状細胞は、それぞれネガティブコントロールとポジティブコントロールを表しています。 細胞溶解物で検出された蛍光シグナルは、485nmでの励起下で525nmで蛍光光度計によって測定されました。 ROS生成は、ポジティブコントロールと比較したフォトルミネッセンス（PL）強度のパーセンテージ（パーセント）として表されました。 値は、さまざまな細胞集団で実行されたn個の= 3実験の平均±SDです。 H2O2と比較して統計的に有意な減少は、アスタリスクで示されます（一元配置分散分析とそれに続くダンネットの事後検定; * p <>
コントロール（CTRL）と比較した星状細胞。 DCF蛍光強度の減少によって証明されるように、ITC化合物による星状細胞の前処理は、H2O2によって誘発されるROS生成を打ち消しました。 テストされたITCの中で、PEITCとSFNのみが、ポジティブコントロール（H2O2）と比較して、ROS生成をそれぞれ約20％と24％大幅に削減することができました。
イソチオシアネート化合物は、LPS活性化星状細胞のMMP-2およびMMP-9レベルを阻害します
MMP-2およびMMP-9レベルに対するITC化合物の効果は、ゼラチナーゼの発現を誘導することが知られているLPSで活性化された星状細胞で評価され（Gottschall and Deb 1996）、同時にAITCで処理されました。 PEITC、または細胞に対して毒性がなかった濃度範囲のSFN。 図3aに示すように、72kDaと92kDaの消化の2つの明確なバンドが、それぞれMMP-2とMMP-9に対応するゲル上に存在しました。 LPSによる星状細胞の活性化は、MMP -2のレベルを増加させ、MMP-9の合成を誘導しました。 AITC（図3b）、PEITC（図3c）、またはSFN（図3d）による治療は、用量依存性を決定しました
使用する化合物によって異なるMMP-9レベルの低下。 特に、使用されたITCの中で、SFNは10μMの用量で70％の阻害、25μMの用量で100％の阻害を測定したため、MMP-9の阻害に最も効果的でした。 さらに、最大非毒性濃度のSFNのみがMMP -2を有意に阻害することができました（図2d）。
イソチオシアネート化合物は、LPS活性化星状細胞におけるMMP-2およびMMP-9遺伝子発現を阻害します
研究したITC化合物がMMP-2およびMMP-9の発現を阻害できるかどうかを判断するために、最大非毒性濃度のITCで処理したLPS活性化星状細胞に対してRT-PCRを実施しました。 図4aの代表的なゲルに示されているように、LPSで活性化された星状細胞を個々のITCで処理すると、MMP-2およびMMP-9mRNAの発現増加を打ち消すことができました。 図4bに示すように、結果の定量分析は、最大の非毒性濃度で、ITC化合物がMMP-2とMMP-9の発現の統計的に有意な阻害を比較して決定したことを証明しましたポジティブコントロール（LPS）に。 特に、PEITCとSFNはMMP -2（85パーセント）とMMP -9（100パーセント）に対して同じ割合の抑制を発揮しますが、AITCはPEITCとSFNよりもMMPの抑制に効果がありませんでした{{17} }（65パーセント）およびMMP -9（90パーセント）式。
ERK 1/2は、ITCによるMMP発現の阻害に関与しています
ERK 1/2は、LPS活性化星状細胞におけるMMP-2およびMMP-9発現の調節に関与する主要なシグナル伝達経路であるため（Lee et al。2003）、ITC化合物の細胞外調節プロテインキナーゼ（ERK）1/2の活性化がテストされました。
図5に示すように、LPSは、リン酸化ERK 1/2（p-ERK）のレベルの統計的に有意な増加を誘発しましたが、ITC化合物による前処理によって打ち消されました。
討論
多くの病気に対する主な防御戦略は、主に危険因子を回避し、正しいライフスタイルを採用することにあると広く信じられています。 さまざまな種類の果物や野菜によって通常生成されるいくつかの天然代謝物が、癌、神経疾患、および他の多因子性疾患などの病理学的現象を調節できるという仮説を支持する多くの科学的証拠があります。 このシナリオでは、イソチオシアネート（ITC）は、その抗真菌性、抗菌性、
図3LPS活性化星状細胞のMMP-2およびMMP-9レベルに対するイソチオシアネート化合物の影響。 aには、LPS（10 ug mL -1）で活性化され、同時に20時間AITC、PEITC、またはSFNで示された濃度（μM）で処理された星状細胞からの培養上清の分析の代表的なザイモグラフィーゲルが報告されています。 ネガティブおよびポジティブコントロールは、無血清培地（CTRL）およびLPS-中の刺激されていないおよび未処理の星状細胞から得られました。
それぞれ活性化細胞（LPS）。 ヒストグラムb〜dは、さまざまな細胞集団で実行されたn個の{{0}}実験の結果（平均±SD）を表し、デンシトメトリーのスキャンとゲルのコンピューター分析の後に計算された、LPSと比較したMMP阻害のパーセンテージとして表されます。 。 LPSと比較して統計的に有意な減少は、アスタリスクで示されます（一元配置分散分析とそれに続くダネットの事後検定; * p <0。05、** p=""><>
抗発癌性、抗変異原性、抗酸化性、および抗炎症性の生物学的特性（Dufouretal。2015;Marzoccoetal。2015;Viget al。、2009; Talalay and Fahey 2001）。 イソチオシアン酸塩は、フウチョウソウ目15の植物科に存在する二次代謝産物であり、アブラナ科に非常に豊富に存在するグルコシノレート（GSL）の酵素分解に由来します（Fahey et al.2001）。 GSLは、ITC、亜硝酸塩、チオシアン酸塩、エピチオニトリル、SFGate、グルコース、オキサゾリジンなどのさまざまな成分でミロシナーゼ（-チオグルコシドグルコヒドロラーゼe; EC 3.2.3.147）によって加水分解されます（Li and Kushad2005）。 ITCは化学療法の分野で広く研究されていますが（Grundemann and Huber 2018）、SFNとAITCがBBBを通過して脳実質に蓄積する能力が実証されているにもかかわらず、神経疾患における治療の可能性についてはほとんど調査されていません。 （Clarkeetal。2011;Jazwaetal。2011;Zhang2010）。 このホワイトペーパーでは、3つのITCの効果を比較しました。
リポ多糖（LPS）で活性化された、またはH2O2で処理された星状細胞によって表される神経炎症のインビトロモデルにおける活性酸素種（ROS）産生およびマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）発現に関して、いくつかの一般的に消費されるアブラナ科野菜に存在します。 CNSの最も豊富なグリア細胞タイプである星状細胞は、脳の恒常性の維持に重要な役割を果たし、さまざまな神経疾患の特徴です（Cekanaviciute and Buckwalter 2016; Colombo and Farina2016）。 それらは自然免疫応答の重要な調節因子と考えられており、酸化ストレスなどの有害な傷害に対するそれらの応答は、炎症反応や組織損傷を悪化させたり、組織修復を促進したりする可能性があります。 活性化された星状細胞が、神経疾患における神経炎症および進行性神経細胞喪失を促進する上で重要な役割を果たすMMPなどの神経毒性因子を産生することはよく知られています（Hsieh and Yang2013）。 したがって、
図4LPS活性化星状細胞におけるMMP-2およびMMP-9の発現に対するITC化合物の影響。 6ウェルプレートに播種された星状細胞をLPS（10 µg mL -1）で活性化し、同時にAITC（400 µM）、PEITC（10 µM）、またはSFN（25 µM）で20時間処理した後、 RT-PCR。 MMP-2およびMMP-9発現の代表的なアガロースゲルが（a）に報告されています。 （b）のヒストグラムは、異なるセルで実行されたn個の= 3実験の結果（平均±SD）を表しています。
アストロサイトの活性化に続いて発生するイベントは、炎症反応とニューロンの損傷を軽減する可能性があります。
この研究の結果は、研究されたITCの中で、AITCは、使用されたすべての濃度で細胞生存率の低下をもたらさなかったため、毒性が低いことを示しました。 対照的に、さまざまなグリア細胞株で他の著者によって観察されたものと同様に、PEITCおよびSFNは、それぞれ10および25 µMを超える濃度で細胞毒性を示しました（Lee et al.2015; Eren et al.2018; Su et al 。2015）。
現在の科学文献には、細胞生存率に対するITCの影響の根底にある分子メカニズムに関する多くの物議を醸すデータがあります。 この点で、ほとんどの研究は、ITCが細胞増殖を誘導するアポトーシス、細胞周期停止、癌細胞でのROSの生成を阻害するが、正常細胞では阻害しないことを示唆しています（Fofariaetal。2015; Qin et al.2018; Sestili and Fimognari 2015）。 我々は、AITCではなくSFNとPEITCが星状細胞の酸化ストレスに対して保護的な役割を果たしていることを発見しました。実際、最大の非毒性濃度では、H2O2への曝露によって誘発されるROS生成を打ち消すことができました。 CNSは、その高い酸素消費量、弱い抗酸化システム、および酸化を受けやすい生体高分子の含有量が高いため、酸化ストレスに対して特に脆弱です。 ROSと酸化的損傷の発生は、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症（MS）などの神経障害の病因に関与していると考えられています（Leeetal。 2015）。 したがって、in vitroの実験では、SFNとPEITCがROSの生成を中程度に抑制しましたが、in vivoでのITCの長期投与は、ROSの大幅な減少につながる可能性があり、時間の経過とともに意味のある結果になる可能性があります。デンシトメトリーのスキャンとゲルのコンピューター分析の後に計算された、ポジティブコントロール（LPS）と比較したMMP阻害のパーセンテージとして表される集団の場合。 LPSと比較したMMP-2およびMMP-9発現の統計的に有意な減少は、アスタリスクで示されます（一元配置分散分析とそれに続くダネットの事後検定; * p <>
脳疾患の予防と調節。 ROSは、CNSへの炎症反応のカスケードを引き起こす重要なシグナル伝達分子として機能します。 この点で、ROSが核因子-κB（NF-κB）などの炎症誘発性転写因子の活性化を通じて神経炎症に関与する多くの遺伝子の発現を調節することはよく知られています（Leeetal。2015;Chiurchiùetal。 2016; Martorana et al.2019）。 このシナリオでは、NF-κBの活性化を通じてROSによって発現がアップレギュレーションされるMMPが重要な役割を果たします（Yan and Boyd2007）。
MMPの調節不全は、多くの神経炎症性および神経変性疾患の病因に寄与するため、それらの阻害は重要な治療戦略を表しています。 このため、過去10年間、MMPを阻害する薬物および天然化合物の可能性に関心が高まっています。 数多くのinvitro研究により、野菜や海洋生物に存在するいくつかの薬物や生物活性化合物の抗炎症作用と抗酸化作用が、MMPの発現を阻害する能力に関連していることが証明されています（Latronico et al.2016、2018; Di Bari et al 。2015）。 この研究では、テストしたITCの中で、SFNとPEITCがMMP-2とMMP-9のレベルとLPS活性化星状細胞の発現を阻害するのに最も効果的であることを示しました。 ITCによるMMPの阻害は、他のinvivoおよびinvitro研究で報告されています。 特に、Lietal。 （2013）SFNが実験的自己免疫性脳脊髄炎のinvivoモデルでMMP-9発現を阻害することによりBBB損傷を軽減できることを示しました。 他の著者は、SFNがマウスの脊髄損傷後のMMP -9発現を弱めることができたと報告しました（Mao et al.2010a）。 さらに、in vitro研究では、ITCによる細胞遊走の抑制と
図5細胞外シグナル調節キナーゼ1/2（ERK 1/2）は、ITC化合物によるMMP発現の阻害に関与しています。 AITC（400μM）、PEITC（10μM）またはSFN（25μM）で1時間前処理し、LPS（10 ug mL {{ 13}}）。 未処理および未刺激の細胞は、ネガティブコントロール（CTRL）を表します。 （b）のヒストグラムは、C6神経膠腫細胞へのpERK1 / 2レベルの浸潤が、NF-κBによって媒介されるMMP -9発現の阻害と関連していたことを表しています（Lee et al.2015）。
ITCがMMPを阻害する分子メカニズムは不明であり、初代星状細胞培養におけるITCの抗酸化および抗炎症特性を調査する研究はありません。 いくつかの研究は、ITCの阻害効果がNrf2シグナル伝達経路によってNF-κBをブロックする能力の結果であるという仮説を支持しています。 この点で、in vivo研究は、Nrf2ノックアウトマウスが脊髄のNF-κBを介した炎症反応およびMMPを含むNFκB依存性遺伝子の発現増加に対してより感受性が高いことを示しています-9（Mao et al.2010b ）。 NF-κBとNrf2の経路は相互作用する可能性がありますが、NF-κBの調節は、Nrf2によって独立している分子メカニズムの調節によっても起こることを示しました。 実際、AITC、PEITC、およびSFNは、最終的にMMP遺伝子の転写を調節するシグナル伝達イベントのカスケードにおいて極めて重要な役割を果たすERK1/2の活性化を阻害することを発見しました。
ただし、最大非毒性濃度のSFNがMMP -9の発現とレベルの両方を完全に阻害したのに対し、AITCとPEITCはMMP -9の発現を最大に抑制したが、MMP{{3}を低下させただけであるという実験的証拠}レベルが約50％の場合、これらの化合物がさまざまな作用メカニズムでMMP-9転写を調節していることを示唆している可能性があります。 この点で、LPSが誘導するNF-κBの活性化の阻害に加えて、SFNがLPSのTLR4受容体への結合を妨げることが報告されています（Koo et al2013）。 TLR4に対するSFNの阻害効果は、LPSによる星状細胞の活性化を防ぐ可能性があり、これにより、MMP -9の発現が上流で阻害され、その結果、MMP-9の産生が失われる可能性があります。
オートラジオグラフィーフィルムのデンシトメトリースキャンと非リン酸化ERK1/2への正規化の後に得られます。 データは、さまざまな細胞集団で実行されたn個の= 3実験の平均±SDを表します。 アスタリスクは、1 0 0パーセントに設定された陽性対照（LPS活性化星状細胞）とは統計的に異なる値を表します（一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較事後検定; * p <>
結論
要約すると、私たちのデータは、ITCによる星状細胞の治療がROS形成を減少させ、MMP-2とMMP-9の放出を阻害することを示し、グリア細胞におけるITCの抗酸化および抗炎症特性への新しい洞察を提供します細胞。 これらの結果は、ITCが、神経疾患の予防と補完的治療のために、健康食品の使用に基づいた神経栄養介入の開発のための有望な栄養補助食品である可能性があることを示唆しています。
資金提供CRUI-CARE契約の範囲内でUniversitàDegliStudidiBariAldoMoroによって提供されるオープンアクセス資金。
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