ニコチンは、プログラム細胞死によってタクロリムス誘発性腎障害を悪化させる
Mar 23, 2022
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Yu Ji Jiang、Sheng Cui、Kang Luo、Jun Ding
前書き
新しい免疫抑制剤の発見にもかかわらず、タクロリムス（TAC）は、固形臓器移植における免疫抑制療法の基礎であり続けています。 ただし、TACを長期間使用すると、副作用（腎毒性、神経毒性、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、胃腸の不調など）のリスクが高まります[1]。 これらの中で、急性肝臓けがまたは慢性TAC腎毒性は、肺移植レシピエントの46％[2]および腎臓移植レシピエントの22.4％[3]で報告されています。 急性ながら肝臓けがTACの投与量を減らした後、または完全に離脱した後は、同種移植片の喪失につながる慢性腎毒性は不可逆的であると考えられています。 慢性TAC腎毒性は、糸球体症、輸入細動脈のヒアリン症、および縞状尿細管間質性線維症（TIF）を特徴とします[4]。 この臨床的ジレンマの正確なメカニズムは不明なままですが、最近、酸化ストレスに起因する炎症、トランスフォーミング成長因子1（TGF - 1）、およびプログラム細胞死が重要なプレーヤーである可能性があることを示しました[5]。 喫煙は、生活の質を低下させる重大な公衆衛生上の課題であり、社会的財政的負担です。 疫学報告によると、現在、世界中で10億人以上の喫煙者がおり、タバコの使用により毎年600万人が死亡しています。 これらの率は両方とも、特に発展途上国または未開発国で増加しています[6]。 喫煙は、さまざまな種類のがん、心血管イベント（心筋梗塞および脳卒中）、および閉塞性肺疾患の危険因子であることはよく知られています。 腎臓では、喫煙は糖尿病、高血圧、多嚢胞性卵巣症候群の患者の腎機能障害の重症度を増加させます肝臓疾患、および腎移植後[7]。 さらに、喫煙はまた、既存の慢性腎臓病（CKD）のない健康な集団においてさえ、新たな腎臓損傷を引き起こす可能性があります[8]。 この研究は以下を評価しようとした：（1）かどうかニコチン（NIC）は、喫煙の主要な毒性成分であり、TACによって誘発される腎障害を悪化させます。 そして、もしそうなら、（2）どのメカニズムがNIC（ニコチン）-加速された腎毒性。
結果
NICの効果(ニコチン)基本的なパラメータについて
表1に、NICの効果の概要を示します。(ニコチン)実験グループの基本的なパラメータについて。 両方のNIC(ニコチン)TACはUV（多尿症）を増加させますが、これはNICによってさらに増加しました(ニコチン)およびTAC治療。 どちらのNICも(ニコチン)また、TACはBWの損失を防ぎませんでした。 尿タンパク排泄、Scr、BUN、およびCys-Cは、両方のNICで著しく高かった(ニコチン)およびTACグループとVHグループの比較。 これらのレベルは、2つの薬の組み合わせでさらに増加し、NICが(ニコチン)TAC誘発性腎機能障害を加速します。 グループ間のSBPの有意差はありませんでした。 4週間のTAC治療により、血中TAC濃度は11。0±ogng / mLに増加しましたが、NICは(ニコチン) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 vs. TAC）さらに、NICで正常ラットを治療する(ニコチン)結果-血清および尿中のコチニン濃度は、それぞれ56.5±17ng/mLおよび8;6±192.6ug/日増加します。 これらの血清および尿中コチニン濃度は、活発な喫煙者であるヒトで観察される濃度を模倣しています[13]。
表1.NICの効果(ニコチン)機能パラメータについて
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性における組織病理学に関する研究
慢性TAC腎毒性は、縞模様のTIFや糸球体症などの独特の組織学的特徴を特徴としています。 組織学的染色および電子顕微鏡検査により、TACに起因する糸球体損傷は、糸球体基底膜の肥厚および有足細胞の足突起の消失によって現れることがわかりました（図1A、IC、およびD）。これは、尿タンパク質の排泄の増加に関連している可能性があります。 定量分析では、両方のNIC(ニコチン)TACはメサンギウムの部分面積を増加させ、NICでさらに増加が観察されました(ニコチン)およびTACグループ。 慢性TAC腎毒性の主な変化は、尿細管間質性線維沈着、尿細管萎縮、および縞状線維症によって描写されるように、尿細管間質性領域に限定されていました（図1B、1E、およびF）。 図は、NICのTIFスコアを明確に示しています(ニコチン)さらに、TACgroupはどちらのNICよりも高かった(ニコチン)グループまたはTACグループ。
図1.過ヨウ素酸シッフ（PAS）の代表的な顕微鏡写真（A）、マッソントリクローム（B）、透過電子顕微鏡検査（CF）、および糸球体損傷および尿細管間質性線維症（TIF）の定量分析;（C）糸球体基底膜肥厚（矢印）;（D）有足細胞足の消失プロセス（矢印）;（E）尿細管間質の腫れと広範なコラーゲン沈着（散乱）;（F）萎縮した尿細管（矢印）VH、ビヒクル; NIC(ニコチン), ニコチン; TAC、タクロリムス。 p
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性における線維化促進性サイトカイン発現に関する研究
本研究では、線維化促進性サイトカインTGF - 1とCTGFの発現、およびig-hの細胞外マトリックス（ECM）成分を比較しようとしました。 実験グループ間。 TIFの調査結果と一致して、NIC(ニコチン)線維化促進性TGF- 1およびCTGFおよびECMig-h3のTAC誘発性過剰発現の増強（図2）
図2.イムノブロッティング分析の代表的な顕微鏡写真（A）トランスフォーミング成長因子1（TGF-B1）、（B TGF - -誘導遺伝子-h（ig-h3）、および（C）結合組織成長因子（CTGF）の場合。タンパク質発現の値が表されます。車両（VH）グループを100％の参照として使用し、-actinに正規化。NIC(ニコチン), ニコチン; TAC、タクロリムス。 3p
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性における炎症について
TAC誘発性腎障害における炎症に対するNICの効果を定義するために、免疫ブロッティングと免疫組織化学によって炎症誘発性メディエーターとピロトーシス関連遺伝子の発現を研究しました。 図3は、TAC治療がピロトーシス関連サイトカイン（ⅡL -1、IL -18、およびNLRP3）とMCP -1の発現をアップレギュレートし、ED-1-陽性をもたらしたことを示しています。細胞浸潤、およびNICの併用治療によりさらなる増加が見られた(ニコチン)およびTAC。
図3.外胚葉異形成の免疫組織化学の代表的な顕微鏡写真-1（ED -1）（A）および炎症性サイトカインのイムノブロッティング分析（B）。 VH、車両; NIC(ニコチン), ニコチン; TAC、タクロリムス; MCP -1、単球走化性タンパク質-1; IL、インターロイキン; NLRP3、NOD様受容体パイリンドメイン含有タンパク質3。 p
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性における酸化ストレスに関する研究
図4に示すように、慢性(ニコチン)TAC治療は、酸化酵素と抗酸化酵素の不均衡と密接に関連しています[12,14。 イムノブロッティング分析は、NICがTACによって誘発されたNOX-2およびNOX-4の発現をアップレギュレーションしたが、SOD1およびSOD2の発現を抑制したことを示した。 さらに、酸化ストレスマーカーである8- OHdGの血清および尿中レベルは、VHグループと比較してNICおよびTACグループで高く、NICとTACグループで最も高かった。 これらの発見は、このモデルの酸化ストレスに対するNICとTACの相乗効果を示唆しています。
図4一連の酸化ストレス関連タンパク質（A）と血清（B）および尿（C）のイムノブロッティング分析の代表的な顕微鏡写真8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン（8- OHdG）濃度。 VH、車両; NIC(ニコチン), ニコチン; TAC、タクロリム-私たち; SOD、スーパーオキシドジスムターゼ; NOX、NADPHオキシダーゼ.Bp
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性におけるプログラム細胞死について
I型（アポトーシス）またはII型（オートファジー）のプログラム細胞死は、慢性的なTAC誘発性腎損傷の病因に関与しています[1s]。 TUNELアッセイを使用して、ほとんどのTUNEL陽性細胞またはアポトーシス小体が尿細管上皮細胞および間質血管内皮細胞に局在し、そこで尿細管萎縮および典型的なTIFが進行することを観察しました（図5A）。 定量分析は、両方のNICが(ニコチン) TACはVHグループと比較してTUNEL陽性細胞を有意に増加させました。 これは、NICとTACのグループでより顕著でした。 分子レベルでは、NICの追加(ニコチン)TAC処理ラットに対して、Bcl -2 / Baxの有意な調節不全と、細胞死に向けた切断されたカスパーゼ-3の発現が生じました（図5B）。 さらに、電子顕微鏡は、TAC処理が、NIC、TAC、およびNICで、初期オートファジー液胞（AVi）、分解性オートファジー液胞（Avd）、マイトファジー（選択的オートファジーの一種）などのオートファジーコンパートメントの豊富な形成を誘導することを示しました。プラスTACグループ（図6）。 定量的イムノブロッティングにより、TAC処理ラット腎臓で見られるp62、LC3B、PINK1、およびパーキンタンパク質の過剰発現がNICでさらに増加することが明らかになりました（図6Gおよび6H）。
図5.TdTを介したdUTP-ビオチンニックエンドラベリング（TUNEL）アッセイの代表的な顕微鏡写真（A）およびアポトーシス制御遺伝子のイムノブロッティング分析（B）。ニコチン治療により、タクロリムスで治療したラット腎臓のTUNEL陽性細胞（矢印）が増加します。VH、ビヒクル。 NIC(ニコチン)、ニコチン; TAC、タクロリムス; Bcl、B-細胞リンパ腫; Bax、Bcl2-関連X.p
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性におけるミトコンドリア機能障害に関する研究
透過型電子顕微鏡により、両方のNICが明確に観察されました(ニコチン)TACは、ミトコンドリアのサイズと数の減少、無秩序なクリステ、空胞化、融合、マイトファジー形成、およびミトコンドリアが2つまたは3つの娘オルガネラ分裂に分割されることによって示されるように、ミトコンドリア構造を破壊しました）（図6）。 定量分析の結果、NICは(ニコチン) 治療は、NICまたはTAC治療単独と比較して、ミトコンドリアの数とサイズをさらに減少させました。 イムノブロッティング分析により、Nicor TACのいずれかによって誘発されたミトコンドリア関連タンパク質（OPA1およびDrpi）の調節不全が、NICとTACの同時投与によって悪化したことが明らかになりました（図6）。
図6.オートファジーとミトコンドリアの形態の代表的な透過型電子顕微鏡写真（AF）、イムノブロッティング分析（G、H）、および各治療群におけるミトコンドリアの数とサイズの定量化。 （A）タクロリムス（TAC）および/または腎臓のオートファジー形成ニコチン（NIC）処理されたラット（矢印）;（B）ミトコンドリアを含むオートファジーコンパートメント'TACおよび/またはNICの腎臓(ニコチン)処理されたラット（マイトファジー、矢印）; （C）正常なミトコンドリア;（D）TACおよび/またはNICの腎臓におけるミトコンドリア数の減少(ニコチン)処理されたラット;（E）TACおよび/またはNIC処理されたラットの腎臓で見られるミトコンドリア融合（円）;（F）TACおよび/またはNIC処理されたラットの腎臓で2つ以上の娘細胞小器官に分割されたミトコンドリア（分裂、円） 。 VH、ビヒクル; LC3B、軽鎖3B; PINK1、リン酸および張力ホモログが染色体10誘導キナーゼ1で削除された; OPA、視神経萎縮タンパク質; Drp、ダイナミン関連タンパク質.p
フィセチン約肝臓
NICの効果(ニコチン)慢性TAC腎毒性における小胞体ストレスに関する研究
図7に示すように、Nicor TACは、リボソームの脱顆粒、切断および拡張したシステルナ、粗面小胞体（ER）でのペルオキシソーム空胞化を誘発しましたが、滑らかなER構造はほぼ正常なままでした（図7B）。 イムノブロッティング分析により、いずれかのNICが(ニコチン)またはTACは、CHOP、Bip、IRE -1、およびATF -6を含むERストレス関連遺伝子の発現を増加させましたが、それらの発現は、2つの組み合わせによってさらに増加しました（図7C）。
図7.透過型電子顕微鏡（A、B）の代表的な顕微鏡写真と小胞体（ER）ストレス関連遺伝子のイムノブロッティング分析（C）。（A）通常の粗い小胞体（矢印）;（B）リボソームの脱顆粒、切断および拡張したシステルナ、および粗い小胞体の小胞拡張ニコチン（NIC）および/またはタクロリムス（TAC）で処理されたラットの腎臓。 VH、ビヒクル; CHOP、C /EBP相同タンパク質;Bip、結合免疫グロブリンタンパク質; IRE -1 c、イノシトールを必要とするタンパク質-1 c; ATF、活性化転写因子。 p< o.01="" vs.vh,="">
討論
喫煙は、健康な集団と基礎疾患（糖尿病、高血圧など）の患者の両方におけるCKDの進行の重要な修正可能な危険因子です。 臨床試験では、喫煙は尿中アルブミン排泄を増加させ、腎臓機能に悪影響を与えることが示されています[16]。 さらに、禁煙は、CKDおよび2型糖尿病の患者のタンパク尿を改善し、末期腎疾患への進行を遅らせる可能性があります[1-、18]。 さらに、レシピエントまたはドナーの喫煙は、拒絶反応および慢性同種移植腎症の一因となり、腎臓移植における同種移植片の喪失につながります[19,2o]。 喫煙のこれらの有害な影響（NIC(ニコチン)）s/6腎摘出術の齧歯類モデル[2alおよび糖尿病性腎症[o]]の研究によって反映されています。 本研究では、NICが(ニコチン)悪化したTAC誘発性のメサンギウム分画領域とTIF。 これらの病理学的変化は、より顕著な腎機能障害と尿中タンパク質排泄の促進につながりました。 これらの結果および他の報告に基づいて、我々は、喫煙が、TACベースの免疫抑制剤を投与された移植レシピエントにおける腎同種移植片喪失を加速する可能性があることを示唆している。
炎症は、進行中の腎瘢痕に先行するため、慢性TAC腎毒性の進展において極めて重要な役割を果たします。 有害な刺激に応答して炎症誘発性メディエーターが増加すると、炎症性細胞が動員され、化学誘引物質、接着分子、TGFなどの炎症誘発性および線維化促進性サイトカインが過剰発現する可能性があります- 1。 最近、NLRP3-依存性および非依存性インフラマソームが慢性TAC腎毒性の病因に関与していることを示しました[s]。 私たちの結果は、NICの管理が(ニコチン)TAC治療ラットは、ピロトーシス関連遺伝子（NLRP3、IL -1、およびI -18）、炎症性メディエーターMCP -1、および線維化促進性サイトカインTGF-およびCTGFの発現を増幅します。過剰なED-1-陽性細胞の流入とig-hのアップレギュレーション。 これらの反応は、糸球体および尿細管の損傷の重症度を反映しています。 私たちの発見は、腎臓の炎症と線維症に対するNICの効果を示したAranyetal。[22]とAgarwaletal。[23]の発見と一致しています。
NICですが(ニコチン)このモデルにおける慢性TAC腎毒性のベースの悪化は多因子である可能性があり、酸化ストレスの影響に関連している可能性があります。 慢性的なTAC治療は、求心性動脈症に関連する低酸素症と密接に関連していることはよく知られています。これは、その後、酸化ストレスにつながり、線維化促進性TGF - 1の過剰発現を活性化し、線維症を引き起こします。 このコンストラクトは、抗酸化療法（例、コエンザイムQ10）が慢性TAC腎毒性におけるミトコンドリアの完全性の維持を介してTGF- 1の発現とTIFを弱めるという観察によって裏付けられています24]。 最近、in vitro研究からの圧倒的な証拠は、慢性NIC曝露とさまざまな腎損傷における酸化ストレスとの相互関係を示しています[o、25,26。 ここで、NICは血清および尿中の8- OHdGレベルを増加させ、酸化剤タンパク質の発現を増強する一方で、抗酸化タンパク質の発現を抑制し、それによってTAC誘発性の酸化ストレスおよび線維症を促進することを発見しました。 確かに、この研究におけるTAC治療腎臓のNIC悪化は、酸化ストレスに起因する可能性があります。
cistanche勃起不全
アポトーシス（タイプIプログラム細胞死）とオートファジー（タイプIIプログラム細胞死）の両方がNICに関与している可能性もあります(ニコチン)-加速された慢性TAC腎毒性。 前に示したように、NICは有足細胞と腎近位尿細管細胞のアポトーシスを直接誘導します[27,28]。 また、酸化ストレス[2g]またはTGF - 1 [22] .NICの活性化を介して、アポトーシス細胞死を間接的に誘導します。(ニコチン)また、膵臓星細胞Bo]、新生児マウス心筋細胞31]、および血管平滑筋細胞32]でオートファジーを誘発する可能性があります。 したがって、酸化ストレスとプログラム細胞死は相互に関連しています。 TUNELアッセイと電子顕微鏡を使用して、NICが尿細管上皮細胞、間質血管内皮細胞、およびTAC処理ラット腎臓のオートファジーコンパートメントのTUNEL陽性細胞の数を有意に増加させることを明確に観察しました。 これらの形態学的変化は、ラット腎臓におけるアポトーシスまたはオートファジー関連遺伝子の調節不全を伴い、細胞死を引き起こしました。 この累積的な証拠は、NICが(ニコチン)それ自体が酸化ストレスとプログラム細胞死を誘発するだけでなく、腎臓に対するTACの悪影響を促進し、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病性腎症[o]とCKD（ s / 6腎摘出術）B3]。
さらに、ミトコンドリア機能障害やERストレスなどの酸化ストレスに起因する細胞内小器官は、慢性TAC腎毒性の完全性に重要な役割を果たし、ERストレスを引き起こし、ミトコンドリアおよびERストレス制御遺伝子の調節不全を引き起こします。 。 したがって、ミトコンドリアの健康状態の悪化とERストレスがNICの影響を説明している可能性があります(ニコチン) TAC誘発腎障害について
私たちの調査では、NICが(ニコチン)15mg / kgの用量では、以前の研究と一致して、酸化ストレス、炎症、およびプログラム細胞死を介してTAC誘発性腎損傷を悪化させます[27、37、38]。 しかし、他の人は反対の発見を観察しました。 Sadis et al.Bg]は、投与量o.s mg / kgのNICが、コリン性抗炎症経路を介して虚血/再灌流傷害から腎臓を保護することを示しました。 Agarwalらによる別の研究。[23] NICによる長期経口治療が報告されました(ニコチン)（28週間）自発性タンパク尿のラットモデル（ミュンヘン-Wistar-Frömterラット）に腎保護効果を与える。 腎臓におけるNICの役割におけるこの不一致の理由は不明ですが、NICの投与量、薬物治療期間、または齧歯動物モデルによって異なる場合があります。 これらの問題を解決するには、さらなる研究が必要です。 この研究は、NICが慢性TAC腎毒性のラットモデルにおいてTAC誘発性腎障害を悪化させることを明確に示しています。 酸化ストレスの悪化とプログラム細胞死は、NICの有害な影響の根底にあるメカニズムの1つである可能性があります。 私たちの調査結果は、移植レシピエント間の喫煙の影響についてのより深い洞察を提供します。
腎臓の機能におけるcistamche
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