酸化ストレス、エネルギー代謝の機能不全、神経伝達物質の不安定化により、ヘリオックス飽和度が4.0 MPaにまで低下したシミュレーションのラットモデルの脳代謝プロファイルが変化した

概要

本研究の主な目的は、海水深 400 メートルへのヘリオックス飽和潜水 (HSD) を模擬した後のラットの脳の代謝プロファイルの変化を、ブランク対照と比較して測定することでした。 HSD によるラット脳の極性メタボロームの変化は、皮質, 海馬、 と線条体組織皮質における生化学的検出と組み合わせた NMR ベースのメタボロミクス アプローチを適用することにより、サンプルを採取します。 のグルタチオンとタウリンレベルの低下仮定的にはそうかも知れません抗酸化防御を高めるこれは飽和潜水中にも証明されました。マロンジアルデヒドレベルの上昇、スーパーオキシドジスムターゼの減少、 そしてそのグルタチオンペルオキシダーゼの減少皮質で。 好気性および嫌気性の代謝経路の同時減少には、下方制御されたエネルギー代謝が含まれており、これは大脳皮質組織における代謝酵素 Na-K ATPase および LDH の生化学的定量化によっても証明されました。 のアミノ酸神経伝達物質の重大な代謝異常GABA、グリシン、アスパラギン酸などの芳香族アミノ酸が減少します。チロシンとフェニルアラニン、どちらもドーパミンの代謝ノルアドレナリンは皮質で下方制御されています。 特に、N-アセチルアスパラギン酸の減少は神経損傷と関連しています。 要約すると、400 msw HSD の高圧減圧は、脳メタボロームラットモデルでは、広範囲のアミノ酸恒常性を乱すもの、酸化ストレスやエネルギー代謝に関連する代謝産物、不安定化する神経伝達物質成分が含まれる可能性があります。 これらは妨害に貢献する可能性があります神経化学的そしてHSD の神経学的表現型.

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序章

1.3 MPaを超える高圧（約120-メートルの海水）は、中枢神経系（CNS）の変化の危険にさらされているヒトおよび哺乳類に誘発されます[1、2]。 CNS は、過剰な大気圧、体内のガス泡、深海ダイビングによって引き起こされる減圧症 (DCS) の影響を最も受けやすいターゲットの 1 つである可能性があります。 このような状態では、一連の精神運動症状および認知症状は非常に複雑で、遠位および近位の振戦、脳波異常、線維束性収縮、ミオクローヌス、睡眠障害、吐き気、頭痛、めまい、認知検査の成績低下などを伴います[2-4]。 モーエンら。 拡散強調および灌流強調磁気共鳴画像法 (MRI) によって局所的な神経学的異常を測定しました。 動脈微小塞栓による脳微小血管機能の灌流障害[5]が北海のダイバーで発見され、微小血管または毛細血管系の複雑さの低下による平均移行時間の短縮によって証明されました。 アルヴヒルド・アレット・ビョルカム 他 例えば、シナプス小胞においてタンパク質の恒常性を乱し、ラットモデルでヘリオックス飽和状態に陥った後に細胞骨格成分を不安定化させることを発見した。 ただし、Arvid Hope ら。 Heliox 飽和減圧後の減圧症の重度の神経学的症状を呈するラットでは、MRI スキャン下で形態学的変化による目に見える CNS 損傷は観察されなかったと報告しました [6]。 したがって、我々は、このような重要だが曖昧な生理学的異常の背後にある潜在的な分子プロファイルの変化が、ヘリオックス飽和潜水後のCNS組織で観察される可能性があると仮説を立てています。

細胞の生理学的メカニズムの状態をモニタリングするためのバイオマーカーの同定は、生化学的事象を理解するために重要です。 特定の瞬間または条件におけるさまざまな要因に対する生体系の反応に関与する分子経路の複雑さと多様性を考慮することは、常に課題です。 個々のバイオマーカーを中枢神経系の機能的混乱と結び付けるこれまでの試みにより、酸化的損傷と飽和後のエネルギー代謝に関する洞察が得られました[3、4、7]。 同様に、いくつかの研究では、高血圧神経症候群のラットのアミノ酸神経伝達物質プロファイルを健康な人のアミノ酸神経伝達物質プロファイルと比較しています[2]。 CNS レジャーの神経学的代謝フィンガープリントを示すことは、病因仮説 [8、9]、予防 [10]、および治療アプローチ [11] に有利になる可能性があります。 しかし、ヘリオックス飽和潜水の深い深さによって引き起こされる統合的な神経学的代謝の摂動は調査されていません。 複雑な生物学的システムから出力されるこのような情報は、技術的手段の進歩により迅速に記録できるようになりました [12]。 高分解能核磁気共鳴 (NMR) 分光法の応用により、非常に複雑だが解釈可能で堅牢な代謝プロファイリング データを大量に得ることができます。 生体液および組織代謝産物抽出物のスペクトル データは、生理学的または病理学的状態の情報を明らかにするために、化学測定法および生物情報学的な方法によって取得できます。 NMR 分光法は、生体サンプル中に存在する約 102 種類の異なる小分子に関する定性的および定量的な情報を即座に提供します。 NMR 検出により、特定の生化学経路を事前に選択することなく、広範かつ公平なアプローチが可能になります。 さらに、NMR はハイスループット分析と高い再現性を可能にし、濃度内での NMR シグナルの線形応答により、広いダイナミック レンジにわたって本質的に定量的な手法です。 この技術は、前臨床研究と臨床研究の両方で、小脳失調症 [13]、ハンチントン病 [14、15]、アルツハイマー病 [16、17] などの神経疾患への適用に成功しています。

NMR ベースのメタボロミクスの応用可能性は有望であるにもかかわらず、ヘリオックス飽和ダイビングの中枢神経代謝摂動効果の評価への応用は報告されていません。 本研究の目的は、海水 (MSW) 400 メートルのヘリオックス飽和ダイビングを模擬した後のラットモデルにおける脳のさまざまな解剖学的区画 (皮質、海馬、線条体) における代謝学的変化と皮質における生化学指数レベルの変化を調査することでした。図1の本研究の概略的な実験計画に示されているように、標的臓器の代謝フィンガープリントの図は、ダイビング手順の改善に貢献できる利用可能なバイオマーカーのセットを提供する可能性があります。

図 1. 本研究の実験計画の概略

実験手順

私たちは、倫理的出版に関わる問題についてのジャーナルの立場を読んだことを確認し、この報告書がそれらのガイドラインと一致していることを確認します。

試薬および材料 分析グレードの塩化ナトリウム、DMSO、NaN3、NaH2PO4・2H2O、および Na2HPO4・12H2O は、Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (上海、中国) から購入しました。 HPLC グレードの CHCl3 および CH3OH は Merck (ドイツ、ダルムシュタット) から入手しました。 化学シフト参照用の内部標準として、プロピオン酸ナトリウム 3-(トリメチルシリル)-2、2、3、3、d4 (TSP) を含む D2O (D で 99.9 パーセント) は、Sigma-Aldrich から提供されました。 （ミズーリ州、米国）。 異なる濃度での代謝産物の化学シフトに対する pH の影響を防ぐために、pH 7.4 の D2O 中に 0.2 M Na2HPO4/NaH2PO4 を含む緩衝液系を調製しました。 ナトリウム-カリウム ATPase (Na-K-ATPase)、コリンエステラーゼ (AChE)、および乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) を測定するためのアッセイ キットは、Abcam (USA) から購入しました。 ドーパミン (DA) のアッセイ キットは米国 RD から購入しました。エピネフリン (E) およびノルエピネフリン (NE) のアッセイ キットは台湾の Abnova から購入しました。5-ヒドロキシトリプタミン (5HT) アッセイ キットは BioSource から購入しました。ガンマアミノ酪酸 (GABA) アッセイ キットは、米国サンタ クルーズから入手しました。 スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、マロンジアルデヒド (MDA)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ (GPx) のアッセイ キットは、米国ケイマン社から購入しました。

倫理承認

すべての実験プロトコールは、海軍医科大学の人民解放軍海軍医療センターの動物倫理委員会によって承認されました（承認番号: SYXK（上海）2017-0019、承認年: 2020）。 すべての動物は、海軍医科大学の実験動物の管理と使用のガイドに従って適切な管理を受けました。 すべての方法が動物実験の報告に関する ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って報告されていることを確認します。 この研究で調査された参加者は人間ではなくラットでした。 したがって、参加への同意はありませんでした。

動物とグループのデザイン

この研究には、平均年齢8週、体重200〜220gの成体雄Sprague-Dawleyラットが含まれた。 動物は、Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。 動物の苦痛を最小限に抑え、信頼できるデータを取得するために必要な動物の数を最小限に抑えるために最大限の努力が払われました。 標準的なラットの餌と飲料水はすべての動物に自由に与えられました。 動物は、ケージあたり 3 匹のラットを含む特定病原体除去 (SPF) 動物室 (温度、22 ～ 24 ℃、湿度 45 ～ 55 パーセント) および制御された光条件 (12/12 時間の明暗サイクル) で飼育されました。実験の1週間前まで。 潜水実験を開始する前に、ラットを高圧室を含む実験室環境に5日間順応させた。 16匹のラットの体重を量り、ラベルを付け、制限を加えて、対照群（常圧空気に曝露するが同様の光と騒音に耐える、CON群、n= 8と名付けた）群と実験群（模擬ヘリオックス飽和潜水にさらした）にランダムに割り当てた。 4.0 MPa (400 msw)、HSD グループ、n=8) と呼ばれます。

400mswの刺激飽和潜水

HSD グループのラットは、高圧室でヘリウム酸素ガス中で加圧されました。 簡単に説明すると、圧縮、保管、解凍、曲げ監視の 4 つのフェーズが含まれていました。

飽和期。 ラットの圧迫速度は、20% He O 混合ガスの場合は 1 msw/min から 10 msw まで、純粋な He の場合は 10 msw から 400 msw まで 3.54 msw/min でした。 表面から 400 msw までの時間圧縮には約 120 分かかりました。 400 msw での底相は 120 分でした。 圧縮プロセスおよび貯蔵深さ中の酸素分圧を35〜50 kPaに維持するために、酸素濃度を純酸素で補充しました。 減圧ベンドウォッチの期間は、300 msw で 40 分、200 msw で 45 分、105 msw で 50 分、45 msw で 60 分、10 msw で 75 分、3 msw で 75 分、その後表面で行いました。 この減圧モデルで使用される上昇速度は、毎分約 10 メートル (33 フィート) です。 減圧段階中、酸素分圧は38〜67 kPaに維持されました。 10 メートルまで減圧した後、酸素濃度は 20 ～ 24 パーセントに維持されました。 飽和潜水タイムラインの概要を図 2 に示します。空気対照群 (8 匹のラットを含む対照群と名付けられた CON 群) のラットは、HSD 群と同じチャンバーを備えた同じ実験室の大気環境内で飼育されました。 対照群は圧迫または減圧処置を受けなかったが、HSD 群と同様の騒音と光に耐えた。

サンプル収集

減圧期間の後、ラットをペントバルビタールナトリウム（{{0}.3パーセント、1.0ml/ラット体重kg）で腹腔内麻酔し、続いて脳を摘出した。 左大脳半球を迅速に解剖した。 2 つの動物グループでは、皮質、海馬、線条体組織が解剖され、それぞれ HSDC、HSDH、HSDS、CONC、CONH、CONS と略称されました。 3 つの区画の中で最大の組織として、各皮質サンプルをほぼ同じ重さの 2 つの部分に切断しました (サンプルの 1 部分はメタボロミクス分析用、サンプルの他の部分は生化学的評価用)。 すべての組織は液体窒素中で急速冷凍され、さらなる分析まで-80℃で保存されました。

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