酸化ストレスは、さまざまな代謝性疾患の重要な前駆体の1つですパート2

お問い合わせくださいoscar.xiao@wecistanche.com詳細については

3.ディスカッション

フリーラジカルは、タンパク質、脂質、またはDNAを攻撃して電子を調達し、さまざまな健康上の問題を引き起こす可能性があります。 このため、体の抗酸化システムと酸化によって形成されるフリーラジカルのバランスをとることが不可欠です。 このバランスが悪くなると、酸化ストレスが発生します[29]。 酸化ストレスは、癌、糖尿病、心血管疾患、アルツハイマー病などのさまざまな慢性疾患を引き起こす主な要因の1つです。人体には、組織や臓器への酸化的損傷に対抗する自己抗酸化システムがありますが、これらの防御システムは、アルコールの過剰摂取、喫煙、ストレス、慢性的な薬物使用、放射線などのさまざまな条件のために効率を失う可能性があります[30]。 さまざまな科学的報告は、二次植物代謝物が酸化ストレスとその有害な影響を防ぐのに重要な役割を果たすことを示しています[13,14,31]バイオアベイラビリティはこれらの化合物の生物活性に影響を与える重要なパラメータですが、ほとんどの研究。 しかし、二次代謝産物は、胃腸系のさまざまなpH条件、酵素活性、および体温のために構造変化を受けることはよく知られています。 さらに、分子量、極性、植物マトリックス中の高分子への結合度などの二次代謝産物の化学的特性も、それらのバイオアベイラビリティに影響を与える重要な要因です[13]。 したがって、一度摂取された化合物またはそれらの代謝物の血流への吸収は、それらの全身的な生理学的効果を発揮するために不可欠である。 インビトロ消化シミュレーションモデルは、物質の可能なバイオアベイラビリティ特性の評価のための証拠を提供するかもしれません。 機能特性を主張するには、ヒトでの治験での確認が必要ですが、in vitroシミュレーションモデルは、倫理的に議論の余地があり、リソースを大量に消費し、費用と時間がかかることが多いinvivo試験またはヒト治験の代替として広く使用されています[32]。

詳細については、ここをクリックしてください

何人かの研究者はまた、シスタス種の異なる器官から調製された抽出物の抗酸化能を調査しました。 文献調査によると、これはフェノール性物質のバイオアベイラビリティと、invitro消化シミュレーションモデルを使用した抗酸化活性への影響に関するCistus種に関する最初の研究です。 Karasetal。 [33]は、ポリフェノール成分の10％が植物マトリックスで未消化のままであり、それらの90％が胃または腸の段階で消化されることを示唆しています（それぞれ約48％および52％）。 先に述べたように、水性抽出物中のすべてのフェノール量は、invitroでの人間の消化シミュレーション手順によって悪影響を受けました。 したがって、すべての抽出物の生物学的に利用可能なサンプルのフェノール含有量に重大な損失が検出されました。 さらに、INサンプルの総プロアントシアニジン濃度は、すべての水性抽出物で検出限界を下回りました。 さまざまな研究により、植物抽出物中のフェノール化合物、したがって関連する生物活性に対する消化手順の悪影響も促されました。 たとえば、SalviavirgataJacqの総フェノール含有量を報告しました。 また、以前の研究での消化手順によって悪影響を受けました。さらに、抽出物の主要代謝物、つまりルチンとロスマリン酸の量は減少する傾向がありました[13]。 対照的に、いくつかの研究は矛盾した結果を報告しています。 セレブらによる研究では。 [34]、彼らは、Hypericum perfoliatum Lからのメタノール抽出物の生物学的に利用可能なサンプル中の総フェノール酸、フラボノイド、およびフェノール量の増加を観察しました。実際、主要代謝物であるケルシトリン、クロロゲン酸、没食子酸は、100を超えるバイオアクセシビリティ比を示しました。パーセント。 これらの研究は、消化手順の効果が植物材料によって異なる可能性があることを示しました。 これらの違いを明らかにするためには、フェノール性物質に対する消化器系の作用機序を考慮することが不可欠です。 （（ビオフラボノイドの利点）Serraetal。[35] フェノール化合物は主に植物マトリックスの配糖体、ポリマー、エステルの形で見られ、吸収される前に消化器系で加水分解されることが示唆されました。 さまざまな要因が、消化管内のフェノール化合物の構造変化に影響を与える可能性があります。 たとえば、プロアントシアニジンやプロシアニジンなどの高分子量の化合物は、腸に吸収される前に加水分解する必要があります。 植物マトリックスの構造も、フェノール類のバイオアベイラビリティの重要な要素です。 （（cistancheを購入する）フェノール化合物は、繊維、タンパク質、脂質分子などの植物マトリックス中の高分子に結合できます。 したがって、マトリックスから遊離したフェノール成分のみが胃腸管から吸収されるようになる可能性があります。 さらに、腸内細菌叢のさまざまなpH値と酵素作用は、フェノール化合物の化学構造の変換に影響を与える他の重要な要因の1つです[36]。 これらのデータに照らして、同様のタイプの実験的研究から得られた異なる結果は、消化システムの複雑さと植物マトリックスの組成に起因する可能性があると仮定することができます。 表3に示すように、Cistus抽出物の生物学的に利用可能なサンプルは、フェノール含有量が低いため、消化されていない胃後のサンプルよりも弱い抗酸化活性を示しました。

Cistancheできる免疫力を向上させる

さらに、C.saluifoliusの両方の抽出物は、他の種と比較した場合、DPPH、CUPRAC、FRAP、およびTOACアッセイでより優れた抗酸化活性を示しました。 さらに、C.paroifforusの両方の抽出物は、他の種の抽出物よりも高いDMPDラジカル捕捉活性を示しました。 表1に示されているように、総フェノール類、フラボノイド、cistanche bienfaitsC.salviifoliusのフェノール酸含有量は他のサンプルよりも高かった。 したがって、C。salviifolius抽出物のより高い抗酸化能は、そのフェノール含有量に関連している可能性があります。

さらに、抗酸化能、炭水化物関連酵素に対する阻害活性、および生物学的に利用可能なサンプルのAGEの低下は、マーカーフラボノイド配糖体の低下に関連している可能性があります。 ただし、図1に示すように、シスタス抽出物には他のフェノール物質も含まれていました。したがって、消化が生物活性に及ぼす影響を監視するには、抽出物の詳細なクロマトグラフィー分析が必要です。

消化酵素に対する植物抽出物の阻害能力は、合成阻害剤の安全性の懸念から、最近より注目を集めています。 したがって、植物抽出物の阻害効果はいくつかの研究で決定され、この効果は一般にフラボノイド、フェノール酸、プロアントシアニジンなどのフェノール性物質に関連していました。Sunetal。 [37]は、ポリフェノール化合物が、疎水性の力と非共有結合の助けを借りて、上記の酵素と結合することによって阻害効果を発揮することを示唆しました。 したがって、ポリフェノールによるo-アミラーゼおよびα-グルコシダーゼ酵素活性の阻害は、それらの分子構造に関連しています。 この相互作用メカニズムは、阻害速度論、分子ドッキング、蛍光消光などのさまざまな技術を使用して研究されてきましたが、特定の結論はまだ得られていません[38]。 しかし、多くの研究は、植物抽出物の消化酵素阻害がそれらのフェノール含有量に直接関係していることを報告しています。 シスタス種の酵素阻害活性に関する同様の研究も以前に報告されています。 Sayahetal。 [39]は、C。monspeliensisおよびC.saluifoliusからの8{{10}}パーセントのメタノール抽出物および水性抽出物の-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ阻害活性を調査しました。 それらの結果は本研究と一致しており、C。salvifolius水性抽出物がより高いo-グルコシダーゼ（ICso ug / mL：0。95±0。14）および-アミラーゼ（IC5 { {55}} ug / mL：217.1±0.15）C。monspeliensis水性抽出物（IC50 ug / mL∶14.58±1.26）および（IC 50 4 g / mL：886.10±0.10）よりもそれぞれ阻害活性。 これらの酵素に対する両方の水性抽出物の阻害率は、参照化合物のアカルボースよりも高かった（ICso ug / mL：18.01±2。00）私たちの研究と同様に、彼らは酵素阻害率と合計との相関を発見しましたフェノールとフラボノイドの量。 C. saloijfolius水性抽出物（それぞれ408.43±1.09mgGAEおよび140。00±1.15RE）の総フェノールおよび総フラボノイド含有量は、C.monspeliensis水性抽出物（261.76±1.9mgGAEおよび78。00±1.15REそれぞれ）。 Orhanetal。 [40]はまた、C.laurifoliusの葉からの80％の水性およびエタノール抽出物の消化酵素阻害の可能性を調査しました。 彼らの結果によると、80パーセントのエタノール抽出物（71.7パーセント±0.6）は、1mg / mL濃度の水性抽出物（39.3パーセント±2.2）と比較して強い-アミラーゼ阻害活性を示しました。 彼らは、フェノール化合物、特にフラボノイドが、ベータ細胞のアポトーシスを防ぎ、抗糖尿病活性をサポートすることにより、インスリン分泌に直接影響を与えることを示唆しました。 この仮説は、我々の結果と相関しており、C。salviifoliusの水性抽出物のNDサンプルが、最高の総フラボノイドおよびフェノール含有量と、最大の-アミラーゼおよびo-グルコシダーゼ阻害活性を発揮したことを示しています。 表4に示すように、C。salviifoliusの水性抽出物は、他の抽出物よりも消化酵素に対して優れた阻害活性を示しました。 さらに、cistancheコレステロール水性抽出物のINサンプルは、NDサンプルよりもフェノールおよびフラボノイドの量が少ないため、本研究では酵素阻害活性が低いことが明らかになりました。 抽出物のフェノール含有量は消化手順によって悪影響を受けましたが、それでも有意な消化酵素阻害活性を示しました。 いくつかの研究では、フラボノイド配糖体が強力な-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ阻害能を持つ植物抽出物の主要代謝物として報告されました[41-43]消化酵素に対するフェノール化合物の阻害メカニズムはまだ明らかにされていませんが、構造-フラボノイド、フェノール酸、プロアントシアニジン、タンニンなどのいくつかのフェノール成分について、活性関係の研究が行われています。 フラボノイドに関する構造活性相関研究は、C環のC2=C3二重結合がそのような化合物の消化酵素阻害の可能性を高めることを示しました。 この結合は電子密度を高めるので、フラボノイドと酵素の間の相互作用の強さが増加します[44]。 さらに、C-5およびC-7のヒドロキシル基は、フラボノイドの-アミラーゼ阻害能を促進します。 また、フラボノイド骨格のヒドロキシル化は、それらのα-アミラーゼおよび-グルコシダーゼ酵素阻害能にプラスの影響を与えることが示唆されました[45]。 前に示したように、本研究のすべてのマーカーフラボノイドは、上記のこれらの構造要件を持つフラボノール配糖体でした。 ただし、in vitro消化手順の後、それらの関連する活動は、水性抽出物の生物学的に利用可能なサンプルで大幅に低下しました。

一般に、AGEに対する植物抽出物の阻害能力は、いくつかの要因、すなわち、それらのフェノール含有量、抗酸化能、金属キレート能力、タンパク質相互作用、およびAGE受容体遮断活性に関連しています[13]。 表4に示すように、水性抽出物の生物学的に利用可能なサンプルは、in vitro消化手順が抽出物のフェノール含有量に悪影響を及ぼしたため、NDサンプルと比較して低いAGE阻害活性を示しました。 現在の研究結果によると、Cの水性抽出物のNDサンプル（cistancheとtongkatalireddit）saluifoliusは、最高のAGE阻害活性と、フェノールおよびフラボノイドの総含有量を持っていました。 比較すると、C。monspeliensisの水性抽出物のINサンプルは、最も弱いAGE阻害の可能性を示しました。これは、フラボノイドとフェノールの総含有量が最も低いためと考えられます。 フラボノイドは植物抽出物、果物、野菜、飲料に広く分布しているため、AGE形成に対するフラボノイドの阻害の可能性についていくつかの研究が強化されています。 この研究でマーカーフェノールとして割り当てられたのと同じフラボノイドが、他の研究でもマーカー化合物として報告されました[46-48]。

消化酵素阻害と同様に、フラボノイドのAGE阻害活性は、C2=C3二重結合とAおよびC環のヒドロキシル化によって刺激されました。 しかし、フラボノイド骨格への糖の付着は、阻害活性の低下につながります[49]。 一方、Cervantes-Laurenetal。[50] 配糖体のフラボン-3-は、他のフラボノイド配糖体よりも大きなAGE阻害能を持っていることが示唆されました。 この仮説は、生物学的に利用可能なサンプルにおけるAGE阻害の減少の説明である可能性があります。 たとえば、ケルシトリンとヒペロシドは、C.monspeliensisの水性抽出物の生物学的に利用可能なサンプルでは検出されませんでした。これは、他の種からの抽出物と比較してC.monspeliensisのINサンプルの活性が低い理由です。 C. saloifoliusの水性抽出物ではケルシトリンは検出されませんでしたが、ヒペロシドとサリドロシドの量が大幅に多いことが、その高いAGE阻害活性の原因である可能性があります。 一般に、サンプルのマーカーフラボノイド含有量とAGEsに対するそれらの阻害能との間に正の相関が観察されました。

4.材料と方法

4.1。化学薬品

実験で使用したすべての参照、酵素、および化学物質は、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 実験では分析グレードの材料を使用しました。

4.2。植物サンプル

C.creticusとC.saloifoliusの空中部分は、2018年4月の最後の週にイェディテペ大学（Kayisdagi、イスタンブール）のキャンパスから収集されました。C.mon-speliensisとC. paroiflorusの空中部分は、AlacantKutluAktasの近くから収集されました。 2018年5月の第2週にイズミール、チェシメのバラジ。2018年6月の第1週に、コンヤのケメール-ドガンヒサール道路からC.ラウリフォリアスの空中部分が収集されました。エルデムイェシラダ博士が植物材料を認証しました。 C. creticus（YEF18013）、C。Lauri folium（YEF18017）、C.monspeliensis（YEF18015）、C.paroiflorus（YEF18016）、C.salvifolius（YEF18014）のバウチャー標本は、生薬学部の植物標本室に保管されていました。トルコ、イスタンブールのイェディテペ大学生薬学部。 4.3。抽出手順

水性抽出は、伝統医学の調製技術として一般的に使用されているため、選択されました。 粗く風乾し粉末化したシスタス種の空中部分（100 g）を、振とう装置を使用して15分間熱蒸留水（80度、1.5 L）で抽出しました。 次に、水性抽出物を濾紙で濾過し、減圧下で蒸発乾固させた。 凍結乾燥手順が完了した後、抽出物を蒸留水に溶解してさらに処理しました（非消化サンプル：ND）（抽出物の収率：C.creticusで13.04％、C.laurifolusで15.7％、C.monspeliensisで12.8％ 、C.parviflorusの場合は14.94パーセント、C.salvifoliusの場合は14.74パーセント）。 4.4。体外人間消化シミュレーション法

人間の消化シミュレーションモデルは、Celeb et al。[34]によって以前に詳述された方法に従って、invitroでCistusサンプルに適用されました。 まず、1gのNaClと1.6gのペプシンを500 mLの蒸留水に溶解して、模擬胃液（SGF）を得ました。その後、SGF溶液のpHをHCl（5 M）で2に調整しました。この溶液の17.5mLを使用します。を2.5mLの植物サンプルと混合し、この混合物を37度の振とう水浴に2時間入れて、消化システムの蠕動運動を模倣しました。 2時間後、サンプルを氷浴に入れて酵素反応を不活性化しました。2mLのサンプルを、さらなる実験のために「胃後」（PG）サンプルとして取っておきました。 適切な量​​のNaHCO3（1 M、pH7）をロードしたセルロース透析膜を冷たいサンプル溶液に配置しました。 したがって、胃腸の吸収が模倣されました。 次に、4.5mLの胆汁酸/パンクレリパーゼ溶液を溶液と混合し、混合物を37度でさらに2時間インキュベートした。 最後に、透析膜内の液体が「生物学的に利用可能な」サンプル（IN）として取得されました。 手順が終了した後、すべてのサンプルは、さらなる実験のために-20度で保存されました。 4.5。フェノールプロファイルのinvitro推定4.5.1。 総フェノール含有量アッセイサンプルの総フェノール含有量の分光光度法による測定は、96-ウェルプレートテンプレートで、Barakらによって以前に詳述された方法に従って実施されました。【32】; 75uLのNagCO3（H2O中20パーセント） ）を新たに調製したサンプルおよび参照溶液20μLに添加しました。 次に、100μLのFolin-Ciocalteu試薬を混合物と混合しました。 暗所で室温で30分間インキュベートした後、690nmで吸光度を測定しました。 没食子酸をさまざまな濃度の参照溶液として使用して検量線を作成し、総フェノール含有量を没食子酸当量（GAE）として表した。 4.5.2。 総フラボノイド含有量アッセイサンプルの総フラボノイド含有量の分光光度測定は、Bardakciらによって以前に説明された方法に従って96-ウェルプレートテンプレートで管理されました。 【51】;150μLの75％エタノール、10μLの塩化アルミニウムおよび10uLの1M酢酸ナトリウム三水和物を50uLのサンプルおよび参照溶液と別々に組み合わせました。 次に、これらの混合物を暗室温度で30分間インキュベートした。 インキュベーション期間後、405nmで吸光度を計算しました。 検量線を確立するために、ケルセチンをさまざまな濃度の参照溶液として使用し、総フラボノイド含有量をケルセチン当量（QE）として表した。

4.5.3。総フェノール酸含有量アッセイ

サンプルの総フェノール酸含有量は、Barakらによって以前に報告された手順に従って分光光度的に測定されました。 [52]。 まず、適量の亜硝酸ナトリウムとモリブデン酸ナトリウムを蒸留水に溶解し、Arnow試薬を得ました。 次に、1mlのサンプルを1mLのArnow試薬、1mLの0。1M HCl、および1mLの1MNaOHと別々に混合しました。 その後、蒸留水で混合物の容量を10mlに調整し、490nmで直ちに吸光度を読み取った。 検量線を得るために、さまざまな濃度の参照溶液としてコーヒー酸を使用し、総フェノール酸含有量をコーヒー酸当量（CAE）として示しました。

4.5.4。総プロアントシアニジン含有量アッセイ

サンプルの総プロアントシアニジン含有量の分光光度測定は、Baraketal。の方法に従って96-ウェルプレートテンプレートで実施されました。 [11]。 簡単に説明すると、25uLのサンプル溶液を150uLの4％バニリンおよび75 uLのHCl溶液（32％）とそれぞれ混合しました。 暗室温度で15分間インキュベートした後、吸光度を492nmに調整しました。 カテキン水和物をさまざまな濃度の参照溶液として使用して、検量線を取得しました。 対照溶液としてメタノールを使用した。 サンプルの総プロアントシアニジン含有量は、カテキン当量（CE）として示されました。

4.6。フリーラジカル捕捉活性アッセイ4.6.1.DPPHラジカル捕捉活性アッセイ

サンプルのDPPHラジカル捕捉活性は、Celeb et al。[53]によって修正された方法に従って、96-ウェルプレートテンプレートで測定されました。 最初に、150μMのDPPH溶液を新たに調製しました。 次に、200μLのDPPH溶液を25uLのサンプル溶液と混合しました。 次に、この混合物を暗室温度で50分間インキュベートした。 吸光度は540nmで計算されました。 ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）を、さまざまな濃度の参照溶液として使用しました。 対照溶液としてメタノールを使用した。 サンプルの活性は、50％の活性を示す濃度に対応するEC50として表されました。

4.6.2.DMPDラジカル捕捉活性アッセイ

サンプルのDMPD*（N、N-ジメチル-p-フェニレンジアミン）ラジカル捕捉活性は、イナンらによって以前に記載された方法に従って、96-ウェルプレートテンプレートで実施された。 [13]。 まず、1 0 {{1 0}} mM DMPDプラス溶液、0.05 M FeCl; 6H2O溶液と0.01M酢酸緩衝液を新たに調製しました。 次に、1 mLのDMPD溶液、100 mLの酢酸緩衝液、および0.2mLのFeCl3-6 H2O溶液を混合し、その後15uLのサンプル溶液を210μLのこの混合物と混合しました。 暗室温度で50分間インキュベートした後、492nmで吸光度を測定しました。 Troloxをさまざまな濃度の参照溶液として使用して、検量線を取得しました。 サンプル溶液の濃度は1mg/mLでした。 サンプルのDMPDラジカル捕捉活性はトロロックス同等物（TE）として述べられました。 4.7。金属還元活性アッセイ

4.7.1。鉄還元抗酸化力アッセイ（FRAP）

サンプルのFRAP活性の測定は、Bardakcietal。[54]によって以前に報告された手順に従って96ウェルプレートテンプレートで達成されました。 実験の開始時に、FRAP試薬は、酢酸緩衝液、第二鉄-トリピリジルトリアジン、およびFeCl;6H2O溶液を混合することによって形成されました。 その後、FRAP試薬を37度のオーブンに30分間入れました。 次に、10uLのサンプル溶液を30μLの蒸留水および260uLのFRAP試薬とそれぞれ組み合わせました。 37度で30分間のインキュベーション時間の後、吸光度を593nmに調整した。 異なるモル濃度の硫酸第一鉄（0。25-2 mM）溶液を使用して検量線を作成し、結果を評価しました。 BHTは、さまざまな濃度の参照溶液として使用されました。 サンプルのFRAP活性は、1gの乾燥抽出物中のmMFeSO4として表されました。

4.7.2。CupricReducingAntioxidant Capacity Assay（CUPRAC）

サンプルのCUPRAC活性は、Celebetal。によって修正された方法に従って96-ウェルプレートテンプレートで決定されました。 【31】; 85μLのCuSO4（10 mM）、ネオキュプライン、および酢酸アンモニウム溶液と51uLの蒸留水を43uLのサンプル溶液に別々に添加しました。 水浴中で50度でのインキュベーション期間（20分）に続いて、450nmで吸光度を測定した。 検量線を取得するために、アスコルビン酸をさまざまな濃度の参照溶液として使用しました。 サンプルのCUPRAC活性は、アスコルビン酸当量（AAE）として表されました。 4.8。総抗酸化活性アッセイ（TOAC）

サンプルの総抗酸化活性の測定は、Celeb et al。による手順に従って、96-ウェルプレートテンプレートで実行されました。 [55]。 最初に、一定量のリン酸二水素ナトリウム、モリブデン酸アンモニウム四水和物、および硫酸を混合して、TOAC溶液を得た。 次に、300μLのTOAC溶液を30uLのサンプル溶液に加えました。 水浴中で95度で90分間のインキュベーション期間の後、690nmでの吸光度を測定した。 検量線を取得するために、アスコルビン酸をさまざまな濃度の参照溶液として使用しました。 サンプルのTOAC活性は、アスコルビン酸当量（AAE）として表されました。 4.9。バイオアベイラビリティ指数の推定

バイオアベイラビリティ指数（BAvI）は、Inanetal。[13]によって記述された理論式に従って計算されました。

BAVI=CIN / CND「バイオアベイラビリティインデックス」（BAvI）は、非消化サンプル（ND）のフェノール類数に対するバイオアベイラビリティサンプル（IN）のフェノール類数の比率として表されました。 4.10。 HPTLCによるマーカーフラボノイドの定量化

シスタス種からの水性抽出物のすべてのシミュレーションサンプル（ND、PG、IN）におけるサリドロシド、ヒペロシド、およびケルシトリン濃度の定量的測定は、高性能薄層クロマトグラフィー（HPILC）（CAMAG、Muttenz、スイス）によって実行されました。 Guzelmericらによって検証された方法に従う。 [16]。 ヒペロシド、サリドロシド、ケルシトリンは25,50と10 {{3 0}} ug / mLの濃度で調製され、新たに調製されたサンプル溶液の濃度は次のように調整されました。 10mg/mL。 これらの溶液は、100μLのシリンジを使用して、一定量（1-5μLの標準溶液と5μLのサンプル溶液）で順相ガラス裏打ちシリカゲルプレート（20cm×10cm、Merck、ダルムシュタット、ドイツ）に適用されました（ハミルトン、ボナドゥズ、スイス）。アプリケーション手順は、Linomat 5サンプルアプリケーターを使用して実行されました。開発プロセスは、自動開発チャンバー（ADC 2）および酢酸エチル：ジクロロメタン、酢酸、ギ酸：水（10:25:10）で実行されました。移動相として10：10：10me）を選択した後、液浸装置（CAMAG）でNatural Product Reagent（NPR）（200mLの酢酸エチル中の1gジフェニルホウ酸2-アミノエチルエステル）でプレートを誘導体化しました。 。ハイパーオシドとケルシトリンは260nmで分光光度的に分析され、サリドロシドの量はUVスキャナーによって330 nmで測定されました。標準のRf値は、ハイパーオシド（≈0.35）、ケルシトリン（c0.45）、チリロシド（≈ 0.65）。相関係数（r²）は マーカーフラボノイドの定量化のために×0.98である。

4.11。糖尿病関連酵素の阻害活性4.11.1。 -グルコシダーゼ阻害活性

-シスタス種の水性抽出物から得られた非消化および生物学的に利用可能なサンプルのグルコシダーゼ阻害活性を、Balanらによって以前に説明された方法に従って調べた。 [56]。 まず、適切な量のリン酸一ナトリウムとリン酸二ナトリウムを、1 0 0 mMリン酸緩衝液（pH7）を調達して混合しました。 acグルコシダーゼ酵素をリン酸緩衝液に溶解し、-グルコシダーゼ溶液（0。2U / mL）を得た。 次に、17 0 uLのリン酸緩衝液、20μLの-グルコシダーゼ溶液、および20μLのサンプル溶液を組み合わせ、37度のオーブンで15分間インキュベートしました。 その後、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）中の2.5mMp-ニトロフェニル- -D-グルコピラノシド溶液20μLを混合物に添加し、37度で15分間の別のインキュベーション期間を実施した。 次に、80μLの0.2M炭酸ナトリウム溶液を混合物に加えて反応を停止させた。 吸光度は405nmで測定されました。 さまざまな濃度のケルセチン溶液を参照として使用しました。 結果は、Cistus種の水性抽出物のNDおよびINサンプルの1 mg/mLおよび0.5mg/mL濃度における阻害活性のパーセンテージとして推定されました。

4.11.2。 -アミラーゼ阻害活性

-シスタス種の水性抽出物から得られた非消化および生物学的に利用可能なサンプルのアミラーゼ阻害活性は、Balanらによって以前に詳述された手順に従って決定された[56]。 サンプルのα-アミラーゼ阻害活性の分光光度測定は、DNS（3、5-ジニトロサリチル酸）試薬を使用して実行されました。 この方法で述べたように、マルトースはでんぷんの変換によって形成され、アルカリ性DNSの黄色は、でんぷんから生成されるマルトースによってオレンジレッド色に変わります。 したがって、酒石酸カリウムナトリウム溶液（2 M NaOHに溶解）と一定量のDNS（蒸留水に溶解）の混合物から96mMDNS溶液を調製しました。 次に、6.7 mMNaCl（α-アミラーゼ酵素の補因子）を含む2 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液を20度（pH：6.9）で調製した。 この緩衝液にα-アミラーゼ酵素（1U / mL）とでんぷん（10mg / mL）を溶解しました。 その後、50μLのリン酸ナトリウム緩衝液と10μLのα-アミラーゼ酵素溶液を20μLのサンプル溶液と混合しました。 この混合物を37度で45分間インキュベートした。 インキュベーション期間後、20μLのデンプン溶液を混合物に加えた。 別のインキュベーション期間を37度で45分間開始した。 「サンプルバックグラウンド」と呼ばれるo-アミラーゼ酵素溶液を添加せずに同じ手順をサンプルに適用しました。対照群は、サンプル溶液がない場合に同じ手順で研究しました。 吸光度は540nmで測定されました。 アカルボースをさまざまな濃度の参照溶液として使用しました。結果は、Cistus種の水性抽出物からのNDおよびINサンプルの1mg/mLおよび0.5mg/mL濃度における阻害活性のパーセンテージとして表されました。 4.11.3.AGE阻害活性

シスタス種の水性抽出物からの非消化および生物学的に利用可能なサンプルのAGE阻害活性は、Starow-iczらによって記載された方法に従って決定された。 [57]。 プロセスの前に、1 mg/mLおよび0。5mg/mLの濃度のNDおよびINサンプルを新たに調製しました。 次に、1mLの10 mg / mL濃度のウシ血清アルブミン（BSA）溶液を1mLのNDおよびINサンプル溶液に添加しました。 対照サンプルはNDおよびINサンプル溶液を添加せずに調製し、ブランクサンプルは0.5Mグルコースを添加せずに調製しました。 次に、調製したすべてのサンプルを、55度の振とう水浴中で40時間インキュベートしました。 インキュベーション期間が終了した後、ThermoScientificTMVarioskanTMLUXマルチモードマイクロプレートリーダーを370nm励起/440nm発光範囲で使用して蛍光強度を計算しました。 ケルセチンは、さまざまな濃度の参照溶液として使用されました。

5。結論

本研究では、トルコの植物相で記録されたすべてのシスタス種の水性抽出物を、それらのフェノールプロファイルとinvitro抗酸化および抗糖尿病の可能性について調査しました。 煎じ薬または注入は伝統的な薬の一般的な形式であるため、実験的研究での活性評価に水性抽出物を使用することは特に重要です。 一方、水性抽出物中の親水性成分は、摂取されると胃腸系で一連の代謝変換を受けます。 したがって、従来の製剤の正しい活性評価のために、生物学的に利用可能な代謝物の活性も調査する必要があります。

これは、トルコのシスタス種に対するinvitroでの人間の消化シミュレーション法の結果を調べる最初の研究です。 さらに、AGEsに対するトルコのシスタス種の阻害能力がこの研究で初めて研究されました。 さらに、サリドロシド、ヒペロシド、およびケルシトリンにマーカーフラボノイドが割り当てられ、それらの濃度の変化がinvitro消化手順で監視されました。 抽出物のフェノール含有量と抗糖尿病および抗酸化活性は、胃腸消化手順によって悪影響を受けましたが、それでも有意な生物活性を示しました。 結果によると、C。salviifolius抽出物は、フェノール含有量と抗酸化および抗糖尿病活性の点で最も強力な植物として検出されました。 結論として、トルコのシスタス種からの空中部分は、豊富なフェノール含有量と潜在的な抗酸化および抗糖尿病活性を持っています。 バイオアベイラビリティを評価するためにinvitro消化シミュレーション法が採用されましたが、それは生物で発生する代謝経路を完全に模倣していない可能性があります。 したがって、フェノール化合物のバイオアベイラビリティと報告された薬理学的効果へのそれらの寄与を詳細に評価するには、さらなるinvivoおよび臨床研究が必要です。

著者の貢献：概念化、YI、EC、EY; 方法論、YI、SA、IK、EC正式分析、YI、IK.-C.、SA; 調査、YI、IK.-C、SA; リソース、YI、IK.SA、EC、およびEY; データキュレーション、YI、IK-C。、SA; 執筆---YI、執筆-レビューと編集、YI、EC、EY; 視覚化、YI; 監督、ECおよびEYすべての著者は、原稿の公開されたバージョンを読み、同意しました。

資金：この研究は外部からの資金提供を受けていません。 倫理委員会の声明：該当なし。 インフォームドコンセント声明：該当なし。

データ可用性ステートメント：この研究で提示されたデータは、対応する著者からの要求に応じて利用可能です。

利害の対立：著者は、利害の衝突はないと宣言します。

サンプルの入手可能性：化合物のサンプルは、著者から入手できません。

この記事は、Molecules 2021、26、5322から抽出されています。https：//doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules