パート1HerbaCistancheの水性抽出物は、カハール介在細胞を改善することにより、ロペラミド誘発便秘ラットの腸運動を促進しました

Shuai Yan、1,2 Yin-zi Yue、1 Xiao-peng Wang、1 Hong-li Dong、1 Shu-guang Zhen、1 Ben-sheng Wu、1、Hai-hua Qian3

1蘇州病院繁体字中国語医学、蘇州、江蘇215009、中国

2南京大学繁体字中国語医学、南京、江蘇210023、中国

3江蘇省病院肛門直腸外科繁体字中国語医学、南京、江蘇210029、中国

Correspondence should be addressed to Hai-Hua Qian; haihuaqian@126.com

2017年5月24日に受領。 2017年10月5日改訂。 2017年10月25日受理。 2017年12月28日公開

アカデミックエディター：Samra Bashir

Copyright©2017ShuaiYanetal。 これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの下で配布されるオープンアクセスの記事であり、元の作品が適切に引用されている限り、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、および複製を許可します。

繁体字中国語医学機能性便秘の治療に良い効果があると報告されました。 この作業は、STC治療に対するHerba Cistanche（AEHC）の水性抽出物の効果を証明し、ロペラミド誘発性の遅い通過便秘（STC）モデルによって考えられるメカニズムを決定することを試みました。 AEHCの生物活性成分の同定と確認のためにHPLCを実施した。 AEHCは、糞便量、水分含有量、腸通過率の増加、およびGAS、MTL、SS、およびCGRPの血清レベルに基づいてSTC応答を減衰させることがわかりました。 カハール介在細胞（ICC）の標識であるc-kitのタンパク質およびmRNAレベルも増加しました。 一方、c-kitのリガンドであるSCFのタンパク質レベルのみが増加しました。 私たちのデータの分析は、AEHCがPI3K、SCF、およびc-kitを含むシグナル伝達経路を介してICCの機能を明らかに改善し、GAS、MTL、SS、およびCGRPなどの結腸運動指数を強化できることを示唆しました。 AEHCは便秘に効果があるように見えたので、関与する正確なメカニズムを明らかにするためにさらなる実験が必要であることに注意することは興味深いです。

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1.はじめに

便秘は、一般的な機能性胃腸疾患および公衆衛生上の問題であり、継続的に困難、まれ、または不完全な排便を特徴とします[1]。 便秘の有病率は、世界中で0 .7％から81％までさまざまであり、特に高齢者では[2、3]。 遅い通過便秘（STC）は、慢性治療抵抗性便秘の患者の13〜37％によく見られる胃腸の不調です[4、5]。 疫学データは、STC男性より若い女性の間で[6]。STC難治性の便秘を引き起こし、保存的治療に対する反応がほとんどなく、神経変性疾患の傾向を示します。 機能性疾患ほど単純ではなく、侵襲的かつ積極的な治療が必要です[7]。

浸透圧性または分泌性下剤や増量剤などの現在の多くの化学薬品は、

便秘を治療します[8]。ただし、費用が高く、痛み、けいれん、腹部膨満などの腹部の副作用があるため、その用途は限られています[9]。 現在、胃腸管の調節が便秘治療の主な焦点です。 シサプリドは、胃疾患の治療のための促進剤として最初に生成されましたが、心不整脈のリスクがあるため、後に中止されました[10]。

テガセロドは、腸の蠕動と分泌を刺激することができる選択的な5-ヒドロキシトリプタミン受容体拮抗薬です[11、12]。 プルカロプリドは、新しいジヒドロベンゾフランカルボキサミド誘導体であり、5- HT受容体アゴニストであり、高い選択性と特異性を備えており、胃、小腸、結腸の運動性を高め、ダイナミクスでより速く作用します[13–15]。 プロスタグランジンE1誘導体として、ルビプロストンはCICチャネルを選択的に活性化して、胃腸の分泌を促進し、腸の伝達の効果を高めることができます[16]。

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便秘の運動性は広範囲にわたる問題ですが、その病因はまだ明らかではありません。 それにもかかわらず、説得力のある証拠は、便秘の病因に対するカハール介在細胞（ICC）の寄与を示しています[17]。 ICCは、消化管の神経終末と平滑筋細胞の間に見られます。 ICCは、胃腸活動のペースメーカー細胞として、また神経筋伝達メディエーターとして一般的に認められています[18]。 研究によると、通過便秘が遅い患者の結腸のICC密度は、正常な患者の結腸に比べて著しく低いことが示されています[19]。 したがって、ICCの数が減少すると、徐波活動が不足する可能性があり、したがって、収縮反応に影響を及ぼし、徐波便秘患者の通過遅延を誘発する可能性があります。 この点で、医薬品を使用したICCの改善は、遅い通過便秘を治療するために重要である可能性があります。

最近、さまざまな漢方薬や繁体字中国語の処方が、便の生成が改善された結果としての慢性便秘の治療のための新しい治療法として注目されています[20、21]。 Herba Cistancheは、慢性腎疾患、女性の不妊症、大量の月経過多、およびインポテンスの治療に使用される伝統的な漢方薬です[22、23]。 Herba Cistancheは、MES23.5細胞でアポトーシス関連因子と神経栄養因子を発現させることにより、脳ニューロンのアポトーシスを防ぎます[24]。 Herba Cistancheは、Yang-Qi Kidney-YangDeficiencySyndromeの治療においても医薬品の可能性を示しています。 最近の研究では、HerbaCistancheがH9c2心筋細胞のミトコンドリア呼吸とグルタチオン抗酸化状態を高めることが示されています[25]。

TCMは、便秘は腎臓と密接な関係があると考えています。 外性器と肛門で開く腎臓は、排尿と排便を支配します。 廃棄物の輸送は、腎臓の気の促進と腎臓の陰の栄養に依存しています。 腎臓の陽が不足している場合、またはライフゲートの火が消えた場合、大腸の冷たい混雑は廃棄物の停滞をもたらします。 便秘は、腎臓のエッセンスが不足すると十分な水分を生成できないため、排便が乾燥することによっても引き起こされます[26]。

ハーブCistancheは一般的な統一ハーブで、甘くて塩辛く、自然の中で温かいです。 大腸と腎臓の経絡に起因し、腎臓の陽を強め、腸を湿らせて便秘を和らげることができます。 この単一のハーブとその中国語便秘を治療するために医薬品が広く使用されており、顕著な効果があります[27]。

中国では、ハーブの効果Cistanche便秘の根は記録されており[28、29]、神農の中国のマテリアメディカでは「Cistanche種の乾燥した多肉植物の茎」と呼ばれています[30]。 しかし、Herba Cistancheの根が便秘に及ぼす影響に関する科学的証拠はこれまで存在していません。臨床的に有効な用量は、1日あたり20gです。中国薬局方、および臨床効果は投与量でさらに増加し​​ません。

Herba Cistancheは非常に少ないため[31]、その臨床投与量を標準化してSTC実験的研究により、不十分な投与量による治療の失敗を防ぐだけでなく、患者を経済的損失や乱用による投薬の失敗から遠ざけることができます。 望みでは

その結果は、便秘の新薬の科学的基礎を築く可能性があります。 したがって、本研究では、腸の促進の水性HerbaCistancheの機能とICCに対するその作用を調査することが重要です。

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2。材料と方法

2.1。 HerbaCistancheの水抽出物の調製。

すべてのHerbaCistancheは、中国の新疆ウイグル自治区のプランテーションからの標準的な民族植物学的慣行に従って収穫、収集、および処理されたNanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.、Ltd.（中国、南京）から購入しました。 植物の正体は、中国の南京にある南京中医薬大学のTuLinLu教授によって形態学的に確認されました。 バウチャー標本（NUCMCHS -2015628）は、中国の南京にある南京中医薬大学の健康科学部に寄託されました。

重量500gのHerbaCistancheのスライスを電気ブレンダーを使用して粉砕し、5000 mlの蒸留水で抽出した後、循環抽出装置を使用して水性抽出物を100℃で2時間精製しました。

膜の細孔（ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）、および抽出物から得られた残留物を4000mlの水に溶解した。 還流抽出後、抽出物を収集し、蒸発させて、最終的なサンプル生成物を得た。 水性抽出物は、以下を使用して乾燥ペレット（1g / ml）に濃縮された。

その後の使用のため。 固体サンプルを蒸留水で再構成して、実験に必要な用量10、20、および40 mg/kg体重を与えました。

2.2。 動物。

この研究で使用された実験プロトコルは、蘇州病院による倫理的手順と科学的ケアに基づいてレビューされ、承認されました。繁体字中国語医学-中国蘇州市の施設内動物管理使用委員会（SHTCM-IACUC;承認番号：PNU - 2016-0003）。 agのオスのラット（Sprague Dawley系統）はすべて、国立衛生研究所のガイドラインに従って上海実験動物研究センターから購入しました。 動物は標準食（AIN -93 M）と水道水を自由に摂取でき、ステンレス鋼の相対湿度で個別に飼育され、毎日12時間の自然光と12時間の暗闇にさらされました。

2.3実験計画。

以前の研究[32、33]に従って、ロペラミドを使用してラットの便秘を誘発しました。 合計60匹のラットをランダムに5つのグループに分けました（グループごと）：A：正常グループ（NG）、B：モデルグループ（Lopとビヒクル処理グループ）、C：低水性抽出物で処理した便秘ラットのグループHerba Cistanche（Lop + LAEHC治療群）、D：Herba Cistancheの中水抽出物で治療された便秘ラットのグループ（Lop + MAEHC治療群）、およびE：Herbaの高水性抽出物で治療された便秘ラットのグループCistanche（LopとHAEHC治療群）。 グループAは通常の生理食塩水（10ml / kg）で治療されました。 グループBはロペラミドで治療されました

（4 mg / kg）; グループCはロペラミド（4 mg / kg）とHerba Cistancheの低水性抽出物（1 g / kg）で処理されました。 グループDはロペラミド（4 mg / kg）とHerba Cistancheの中水性抽出物（2 g / kg）で処理され、グループEはロペラミド（4 mg / kg）とHerba Cistancheの高水性抽出物（4 g / kg）で処理されました。 kg）。 正常群のすべてのラットに0。9％塩化ナトリウムを注射し、他のラットには0。9％塩化ナトリウム中のロペラミドを1日2回、連続3日間注射して便秘を誘発しました。 Herba Cistancheの水性抽出物を水に懸濁し、グループC、グループD、およびグループEでは4日目から18日目まで1日1回経口投与しましたが、グループAおよびBは強制経口投与により一定量の水を摂取しました。

2.4。 クロマトグラフィー条件。

HPLCプロファイリングは、LC-20ATポンプと

33 0 nm、3 0 Cでモニターしました。アイソクラティック移動相は、メタノール0.1％ギ酸（80：20、v / v）で構成され、1.0 ml/minの流速で分析しました。 。 クロマトグラフィーによる分離は

粒子サイズ5m、Beijing Dikma Science and Technology Co.、Ltd.、北京、中国）。

2.5。 運動、食物摂取、水分摂取、体の分析

耕作可能なガム（20パーセントの木炭と10パーセントの耕作可能なガムの水性懸濁液）を各動物の25ml/kgの量で経口投与した。 30分後、動物を頸椎脱臼により人道的に犠牲にし、解剖した。 幽門から盲腸までの小腸を横断し、木炭粉で覆われた距離と小腸の全長を測定した。 個々のラットについて、腸通過のパーセントは、小腸の全長に対する木炭ミールが移動した距離のパーセンテージとして計算されました。 次の式は、腸の通過率（パーセント）を計算します。木炭が幽門から盲腸までの距離を100パーセント移動した距離。

2.6。 血液サンプルと組織の収集。 実験期間の終わりに、ラットを12時間絶食させたが、水を自由に摂取させた。 次に、すべてのラットを30分後にペントバルビタールナトリウム（50 mg / kg）の腹腔内注射によって麻酔し、温度調節されたテーブルに置いた。 血液サンプルを採取し、3500 rpmで15分間遠心分離して、血清を得ました。 結腸を直ちに分割し、4℃の生理食塩水で洗い流した後、2つに分けた。 1つのフラグメントは10％ホルマリンで固定され、その後の免疫組織化学（IHC）分析のために分割パラフィンで処理され、もう1つは体重と髪の毛でした。 運動、食物摂取、水分の変化

それらが分析されるまで80℃で保存された。 摂取量、体重、および毛髪は、実験期間を通して毎日観察および記録された。 特定の手順に従って「運動の変化」を観察しました。自作の箱（高さ60 cm、長さ50 cm、幅80 cm、周囲の壁が暗い）をオープンフィールド試験に使用します。 暗くて静かな部屋で、白い地面は黒い線でダイアモンド（12 cm）に分割されました。 ボックスの中心から1m上に100Wの電球がぶら下がっています。 ラットは、モデリングの4日目、6日目、12日目、および18日目にボックスの中央に配置されました。 ラットが5分以内に通過した正方形の数を水平運動スコアとして使用し、5分以内のラットの直立時間を垂直運動スコアとして使用した。 水平および運動スコアと垂直運動スコアは、ラットの運動量を示します。 各ラットを1回測定した[34、35]。

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2.7。 糞便パラメータ測定。

経口投与の最終日に、各SDラットからの新鮮な糞便ペレットを丸底栓付きチューブに6時間収集し、各グループの総重量を記録した。 糞便の水分含有量を測定するために、電気天秤を使用して、一定の重量になるまで便ペレットを乾燥させ、乾燥重量を測定しました。 水分含有量

2.8。 GAS、MTL、SS、およびCGRPの評価。

血清中のガストリン（GAS）、モチリン（MTL）、ソマトスタチン（SS）、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）の濃度は、市販のキットを使用したELISAによって推定されました。

2.9。 組織学的分析。

SDラットから収集した横結腸を10％ホルマリンで12時間固定し、埋め込み

ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E、Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国）で染色されたm厚のスライス。 これらの切片の形態的特徴を光学顕微鏡で観察した後、絨毛の長さ、陰窩の厚さ、および筋肉の厚さをLeica Application Suite（Leica Microsystems、Switzerland）を使用して測定しました。

2.10。 免疫組織化学的分析。

Zhuらの方法に従いました。 （2016）[36]; 染色されていない5mのセクションは

ウサギ抗cキット（1：100）で4℃で一晩染色した。 二次抗体およびアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体法は、製造元の指示に従って使用されました。 非特異的結合を排除するために免疫グロブリン陰性対照を使用した。 c-kitの発現レベル

2.11。 腸通過率の分析。

腸通過率は、以前に報告されたプロトコル[36]に従って実施されました。 簡単に言えば、14日間の治療後、すべてのSDラットを12時間絶食させたが、水を自由に摂取させた。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。 結腸におけるc-kit、SCF、およびPI3K mRNAの遺伝子発現レベルは、トータルRNA抽出キット（TIANGEN Biotech、

北京、中国）メーカーのプロトコルに従って。 リアルタイムPCRは、ABI StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（ABI）を使用して実行されました。 SYBR Green IリアルタイムPCRマスターミックス（QPK2 0 1、東洋紡、日本）を使用してPCR産物を検出しました。 反応は3回の実行で実行されました。 続いて、0.5gの新鮮なラット結腸組織が同族体であった-

l）TRIzol試薬（Invitrogen、USA）を使用して、製造元の指示に従って抽出しました。 逆転写PCRキット（Takara Biotechnology Co.、Inc.）を使用して、製造元のプロトコルに従ってcDNAの最初の鎖を合成しました。 対象となるすべてのパラメーターを表1に示します。サイクリングプロトコルは次の条件下で行われました：95°Cで5分間（DNA変性）、続いて95°Cで15秒間、60°Cで20秒間、72°Cで40サイクル40秒 増幅サイクルの最後に融解曲線分析を行った。

2.12。 ウエスタンブロット分析。

結腸サンプルホモジネート中のc-kitおよびSCFのタンパク質含有量をウエスタンブロットによって評価した。 手短に言えば、ホモジネートの総タンパク質は、ビシンコニン酸アッセイ（Pierce Biotechnology、ロックフォード、イリノイ、米国）を使用して決定された。 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）を使用して、BioRad電気泳動システム（BioRad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）でタンパク質を分離しました。 次に、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンに転写しました。 室温で5％脱脂乳を含むTBS中のブロッキングバッファーで2時間処理した後、PVDFメンブレンを1：1000希釈の抗c-kit（Santa Cruz、CA、USA）、1：500希釈の抗c-kitとともに一晩インキュベートしました。 SCF（Sigma、MO、

米国）、および1：8000希釈抗アクチン（Kangchen、上海、中国）抗体。 一次抗体の結合は、対応するHRP結合二次抗体（Beyotime、江蘇省、中国）を使用して検出されました。 化学発光検出には、強化された化学発光キット（Pierce Biotechnology Inc.、Rockford、IL、USA）およびOdyssey Infrared Imaging System（Gene Company Ltd.、Hong Kong）を使用しました。 ハウスキーピングプロラクチンをローディングコントロールとして使用しました。 タンパク質発現量は、アクチンのレベルと比較して示されています。

2.13。 統計分析。

測定データは、平均の平均標準誤差（SEM）として報告され、SPSSによって分析されました。

16. 0ソフトウェア（SPSS、シカゴ、イリノイ、米国）。 一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続くダンカンの複数範囲検定を使用して、すべてのパラメーターの有意差を決定しました。 値はで統計的に有意であると見なされました

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3.結果

3.1。 HerbaCistancheの組成と機能成分。

図1に示すように、Herba Cistancheの根には、下剤効果に関連するいくつかの生物活性成分が高濃度で含まれています。 総エキナコシドと総ベルバスコシドの濃度は、それぞれ0 .64 mg/gと0.16mg/gでした。 高エキナコシドおよびベルバスコシドレベルを示す2つのピークが、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって適切な保持時間でLPで検出されました。

3.2。 一般的な観察。

SPラットは実験の過程で死亡しなかった。これは、動物モデルの安全性と操作性が優れていることを示している。 グループAと比較して、モデルグループのラットは、ふわふわの毛皮、怠惰、乾いた便、および

モデリング時間の延長により悪化。

3.3。 ロペラミド誘発便秘ラットの糞便数と水分含有量に及ぼすAEHCの影響

通常の糞便と比較して、グループB、C、D、およびEの糞便は、乾燥しており、小さく、硬く、治療前にバニシングすることはありませんでした。

結局のところ、ラットにロペラミドを注射しました（薬で治療すると、体や3（b）などの症状が緩和されました）。

グループEは他のグループよりわずかに低い体重を示しましたが、体重はすべての実験グループ間で有意差はありませんでした（図2（a））。 さらに、便秘のあるSDラットは、グループA（）よりも有意に少ない食物を食べましたが、グループB、C、D、およびEの間の違い（図2（b））は有意ではありませんでした。 水の消費量もグループAとグループBの間で変化しませんでした。さらに、水の消費量の有意な増加は検出されませんでした。

AEHCによる治療は変化を誘発しなかった。 グループC、D、およびの腸通過率も有意に高かったがグループC、D、およびEは、グループAよりも大幅に低い比率でした。

3.4。 ロペラミド誘発便秘ラットの小腸通過率に対するAEHCの効果。

図4からわかるように、5つのグループ間でベースラインの小腸通過時間に差は検出されませんでした。 グループBは、グループAと比較して木炭粉末の推進率が著しく低くなっています（𝑃<0。0 1）。=""><>

3.5。 AEHCによる介入は、結腸運動指数機能を部分的に強化します。

グループBラットから得られたGASおよびMTLの血清レベルは、グループAから得られたものと比較して有意に減少しました（𝑃<{{0}}。0 1、それぞれ）。=""><0。0 5、それぞれ）は、グループbと比較して、herbacistanche抽出物の投与によるgasおよびmtlのレベルが効果的に高くなっています。=""><0。01）;><0.05）（図5）。><0.01）およびherba cistancheを投与したグループc、d、およびeのcgrpレベルは一定でした（𝑃=""> 0.05）。

3.6。 結腸の組織学的変化。

AEHC治療が結腸組織の構造変化を誘発できるかどうかを調べるために、H＆E染色後、5つのグループのラットの横結腸で絨毛の長さ、陰窩層の厚さ、および筋肉の厚さを測定しました。 すべてのグループのラットの結腸の病理を比較することにより、結腸粘膜は滑らかであり、粘膜下組織および多数の脂肪細胞に小さな動脈および小さな静脈が含まれている。 また、筋層は平滑筋細胞で構成され、漿膜下組織が完成しました。 絨毛の平均の長さは、グループAよりもグループBの方が有意に短かった（𝑃<{{0}}。0 1）。=""><0.05）。><0.01）。 さらに、筋肉の厚さの変化は絨毛の長さと非常に似ていました。="">

グループAと比較すると、劇的に薄くなりました。ただし、グループC、D、およびEの筋厚レベルは、グループBの筋厚レベルと比較して30〜35パーセント増加しました（図6および7）。 全体として、これらの発見は、AEHCが便秘ラットの結腸の絨毛の長さと筋肉の厚さを増加させる可能性があることを示しています。

3.7。 AHEC治療の投与は、c-KitおよびSCFのタンパク質発現を増加させました。

すべてのグループの細胞がc-kitについて陽性であるとテストされたので、それの免疫反応性は結腸で検出されました。 図8に示すように、グループBのc-kitの発現レベルは、グループAの発現レベルよりも低かった（𝑃<0。0 5）。=""><0。{{2 0}}=""><0。05）。 異なる濃度のherbacistancheの水性抽出物で2週間処理した後、c-kitおよびscfのタンパク質発現レベルをウエスタンブロット分析によって検出しました。="" ウエスタンブロット分析は、ラットの結腸でのロペラミド処理後、c-kitおよびscfの発現レベルが著しく低いことを示しました（図9）。="" 図8（e）は、便秘ラットのc-kitの減少が、ラットを500𝜇g=""><0.05）。 さらに、100および200="" g="" ml="" aehcで処理すると、c-kitタンパク質の発現レベルが上昇しました。="" scfタンパク質の発現は、100、200、および500𝜇g="" mlaehcでの処理でそれぞれ20.1、24.7、および8.4パーセント有意に増加しました（図9）。="" 3.8。="" c-kit、scf、およびpi3kのmrna発現に対するaehcの効果。="" aehc治療が筋収縮に関連するmrnaの調節に影響を与えるかどうかを調べるために、特定のプライマーを使用して、便秘ラットの結腸でc-kit、scf、およびpi3kの発現レベルの変化を観察しました。=""><><0.05） （図10）。="">

キットのリガンドであるSCFの発現。 グループBラットのSCFのmRNA発現は、グループAよりも有意に低かったのに対し、グループC、D、およびEのAEHCによる治療は、SCF mRNA発現を増加させました（図1 0）。 さらに、PI3K遺伝子発現に対するAEHCの影響を調べました。 14日目に、PI3K遺伝子発現レベルはグループBよりもグループC、D、およびEで有意に高かった（𝑃<>