パート1UPLC-QTOF/MSおよびDNAバーコーディングに基づくCistanchesHerbaの化学的および遺伝的識別
Mar 03, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
概要
Cistanches Herba「砂漠の高麗人参」として知られる（Rou Cong Rong）は、特に陽を強化するための腎臓の強化において、強さと栄養に顕著な治療効果があります。 ただし、Cistanches Herbaの2つの植物起源、CistanchedeserticolaとCistanchetubulosaは、薬理作用と化学成分の点で異なります。 Cistanches Herbaの植物起源を識別するために、この研究では、化学的および遺伝的複合法システム（UPLC-QTOF / MSテクノロジーとDNAバーコーディング）が最初に採用されました。 結果は、PCAおよびOPLS-DA分析によって2つの起源を区別するために、3つの潜在的なマーカー化合物（カンプネオシドII、シスタノシドC、およびシスタノシドAの異性体）が得られたことを示しました。 DNAバーコーディングにより、2つの起源を正確に区別することができました。 NJツリーは、2つの原点が2つの分岐群にクラスター化されていることを示しました。 私たちの調査結果は、CistanchesHerbaの2つの起源が異なる化学組成と遺伝的変異を持っていることを示しています。 これは、Cistanches Herbaの2つの起源について最初に報告された評価であり、この発見により、品質管理とその臨床応用が容易になります。
序章
Cistanches Herba（砂漠の高麗人参」として知られている（Rou Cong Rong）は、乾燥した多肉植物の茎に由来しますニクジュヨウYCMaとカンカニクジュヨウ（シュレンク）中国薬局方（2010年版）によると、かつらは腎臓陰を強め、生命の本質に利益をもたらし、腸をリラックスさせることで人気があります。 現在、Cistanches Herba主に中国北西部の乾燥した暖かい砂漠、特に新疆ウイグル自治区と内モンゴル地方に分布しています。 しかし、の2つの起源Cistanches Herbaそれらの薬理学的活性と化学成分の点で異なります。 トゥら。 3つのCistanche種の煎じ薬を調査しました（ニクジュヨウ, カンカニクジュヨウ, ホンオニクサルサ）そしてそれを見つけたカンカニクジュヨウヤン欠乏マウスモデルで最も低い効果を示した[1]。 張ら。 間の薬理活性の比較ニクジュヨウ, カンカニクジュヨウ、とC.サルサ、そして、これらの種は抗倦怠感や低酸素耐性などの薬効があるが、同じ程度ではないことを発見しました[2]。 以前の研究は化学成分を報告し、植物起源の化学成分と含有量の違いを示しましたCistanches Herba[3]。 臨床応用と市場循環に関しては、強壮剤として、カンカニクジュヨウ日本では、血液循環促進剤として、またインポテンス、不妊症、腰痛、体の衰弱の治療に伝統的に使用されてきました[4–8]。 したがって、2つの起源を区別することは非常に重要です。Cistanches Herba品質管理および臨床応用のため。 しかし、2つの起源の識別に焦点を当てた研究はありませんCistanches Herba。 顕微鏡、紫外線、および赤外線検出を含む多くの研究された方法、単純なシーケンスリピート法は、の属を識別するために使用されてきましたホンオニク、ただし、特に[9–20]の2つの起源だけではありません。 ここでは、化学的および分子的手法を組み合わせて利用して、Cistanches Herbaの2つの起源、UPLC QTOF / MS（四重極飛行時間型質量分析と組み合わせた超高性能液体クロマトグラフィー）とDNAバーコーディングを区別しました。 UPLC-QTOF / MSは、他の手法と比較して、より迅速かつ効率的に情報を提供します。 UPLC-QTOF / MSの高い選択性と感度により、定量分析と定性分析の両方に適用できるほか、漢方薬の代謝物分析と複雑な化合物の同定にも使用できます[21–22]。 主成分分析（PCA）および潜在構造判別分析（OPLSDA）への正射影も、潜在的なマーカー化合物を特定するために開発されています。 より簡単で普遍的な分子マーカー技術であるDNAバーコーディングは、DNAフラグメントを使用して種または属を識別します。 これは、従来の識別方法や他の分子マーカー技術よりも客観的で、正確で、実行が簡単です。 さらに、DNAバーコーディングは、薬用植物を含む動植物の識別にうまく適用されています[23–26]。 この研究の目的は、UPLC-QTOF / MSとDNAバーコーディングを組み合わせた、2つの植物起源を識別するための科学的方法システムを確立することです。Cistanches Herba.
根全体をCistanches
材料および方法
倫理声明フィールド調査には絶滅危惧種や保護種が含まれていないことを確認します。 GPS座標はサンプル情報に含まれています。表1を参照してください。」
植物材料と試薬
Cistanches Herbaの多肉植物の茎は、2012年5月に、中華人民共和国の新疆ウイグル自治区、青海省、内モンゴルの野生の砂漠地域から収集されました（表1）。調査のサンプルはすべて、野生の砂漠地域で収集されました。特定の許可が必要とされなかった私有地で。 茎の植物の同一性は、LinfangHuang博士によって確認されました。 バウチャー標本は、薬用植物開発研究所に寄託されました。 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードのアセトニトリル（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）とギ酸（Tedia、米国）をUPLC分析に使用しました。 Milli-Qシステム（Millipore、Bedford、MA、USA）を使用して、脱イオン水を精製しました。 他のすべての化学物質は分析グレードのものでした。
サンプル準備
Cistanches Herbaサンプル（1. 0 g、65-メッシュ）を50- mL三角フラスコに移し、50mLの70パーセントメタノールを加えました。 30分間浸漬した後、室温で30分間超音波処理（35kHz）を行った。 10、000 rev / minで10分間遠心分離した後、上清を4uCで保存し、分析のためにUPLC-QTOF/MSシステムに注入する前に0。22-mmメンブレンでろ過しました。
UPLC-QTOF / MS
UPLC分析では、次のシステム/パラメーターを使用しました。ウォーターズエンパワー2データステーションに接続されたバイナリ溶媒デリバリーポンプ、オートサンプラー、およびPDA検出器を備えたウォーターズアクイティシステム（ウォーターズ）。 超音波処理（25 0 W、5 0 kHz、昆山超音波機器株式会社、浙江省、中国）; 電子分析天びんモデルAB135-2（Mettler Toledo。、Greifensee、チューリッヒ、スイス）。 Waters Acquity UPLC BEH C18カラム（1.7 mm、2.161 0 0 mm、Waters）およびWaters C18ガードカラム（同じ材料、Waters）を使用し、30uCに維持しました。 移動相は0.1％ギ酸水溶液（A）とアセトニトリル（B）で、グラジエントプログラムは次のとおりです。0〜3分、10〜22％B。 3〜4分、22〜23パーセントB; 4〜6分、23〜35パーセントB; 6〜8分、35〜37パーセントB; 8〜11分、37〜42パーセントB; 11〜12分、42〜48パーセントB; 0.3 mL / minの流量で12〜15分、48パーセント〜50パーセントのB。 注入量は5mLでした。
UPLC / MS分析は、負イオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン化（ESI）ソースを備えたQTOF Synapt G2 HDMSシステム（Waters、マンチェスター、英国）で実行されました。 脱溶媒ガスとしてN2を使用しました。 脱溶媒和温度は、800 L/hの流量で45{{10}} uCに設定され、ソース温度は120uCに設定されました。 キャピラリー電圧とコーン電圧は、それぞれ2500Vと40Vに設定されました。 データは、0。1-秒のスキャン時間と0。01-秒のスキャン間遅延で15-分の分析時間で50〜1200Daの間に収集されました。 アルゴンを7.06661023Paの圧力で衝突ガスとして使用しました。すべてのMSデータは、質量の精度と再現性を確保するためにLockSprayシステムを使用して収集されました。 m / z 554.2615のロイシン-エンケファリンの[MH]-イオンを、負のESIモードのロックマスとして使用しました。
データ分析
CistanchesHerbaサンプルのUPLC-QTOF/MSデータを分析して、潜在的な判別変数を特定しました。 ES生データのピーク検出、アラインメント、およびフィルタリングは、Marker Lynxアプリケーションマネージャーバージョン4.1（Waters、マンチェスター、英国）を使用して実行されました。 使用したパラメータは次のとおりです。保持時間（tR）0 –15分、質量5 0 – 12 0 0 Da、保持時間許容値0.02分、質量許容値0.02Daの 各地理的位置から収集された3つの複製サンプルが使用されました（n=3）。 モデルの作成には、合計6,339個の変数が使用されました。
DNAバーコーディング：DNA抽出、PCR増幅、シーケンシング
ニクジュヨウとカンカニクジュヨウの乾燥した肉質の茎から採取したサンプル（30 mg）を、30 r/sの頻度で2分間こすりました。 DNAは製造元の指示（Tiangen）に従って抽出されました。 具体的には、プロトコルを変更して、クロロホルムをクロロホルム：イソアミルアルコール（同量で24：1）、および緩衝液GP2とイソプロパノール（同量）の混合物に置き換えました。 こすった粉末を1.5mlのエペンドルフチューブに入れ、700mLの65uC予熱したGP1と1mLのb-メルカプトエタノールを加えて、ボルテックスを使用して10〜20秒間混合し、65uCで60分間インキュベートしました。 クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）の混合物700 mLを加え、12000 rpm（、134006g）で5分間遠心分離します。 上清を新しいチューブにピペットで移し、700 mLのイソプロパノールを加え、15〜20分間ブレンドします。 すべての混合物をスピンカラムCB3に配管し、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、500 mL GDを添加し（使用前に定量的無水エタノールを添加）、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、700 mLのPW（使用前に定量的無水エタノールを添加）を加えてメンブレンを洗浄し、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、500 mL PWを加え、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、12000 rpmで2分間遠心分離して、残留洗浄バッファーPWを除去します。 スピンカラムCB3をきれいな1.5mlのエペンドルフチューブに移し、室温で3〜5分間乾燥させます。 12000 rpmで2分間遠心分離し、トータルDNAを取得します。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のプライマーは、以前に報告された配列に基づいていました[4,5]。 PCR反応混合物には、2- mL DNAテンプレート、8。5- mL ddH2O、12。5- mL 26Taq PCRマスターミックス（北京TransGen Biotech Co.、中国）、1 / {{57 }} mLフォワード/リバース（F / R）プライマー（2.5 mM）、最終容量25mL。 クレスらによって記載されたように、ＰＣＲ増幅を実施した。 [4]。 PCR反応のプライマーはfwdPA：GTTATGCATGAACGTAATGCTC（59- 39）およびrev TH：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC（59-39）でした。 PCR産物を分離し、1％アガロースゲル電気泳動で検出しました。 PCR産物はメーカーのプロトコルに従って精製され、直接シーケンシングを受けました。
ホンオニクの主な効果的な化合物：アクテオシド
結果
UPLC-QTOF /MSによる暫定的なピークの割り当て異なる生産地域からのC.deserticolaとC.tubulosaの代表的なクロマトグラムを図1に示します。フィンガープリントクロマトグラムは、CistanchesHerbaサンプル間の類似性を示しています。 合計23の適格な質量ピークが検出され、保持時間と質量スペクトルを以前に報告されたものと照合することによって16のピークが特定されました（表2）[29–35]。 ピーク2、3、5、6、7、8、9、11、12、15、16、17、20、21、22、および23は、シスタノシドF、ムセノシド酸、シスタンブロシドC1 / C2、カンプネオシドIIとして暫定的に同定されました。 、カンプネオシドII、エキナコシド、シスタノシドA、アクテオシド、イソアクテオシド、シリンガリドA -39- aL-ラムノピラノシド、シスタノシドC、29-アセチルアクテオシド、オスマンツシドB、シスタノシドD、ツブロシドB、およびシスタンシネンシドの異性体。 化学成分は主にフェニルエタノイド配糖体（PhG）であると決定されましたが、1つの化合物であるムサエノシド酸はイリドイド多糖類でした。 PhGは、腎臓欠乏症の治療、抗酸化作用および神経保護作用の観点から、主要な活性化合物です[36]。
C.deserticolaとC.tubulosaのPCA
PCAは、さまざまな植物種のサンプルを区別するために使用されました。 PCAは、二次代謝産物組成の多変量データ内の類似点および/または相違点を視覚化することを目的とした、教師なし多変量データ分析メソッドです[37]。 2成分PCAモデルは、累積的に変動の46.04パーセントを占めました（PC1、36.43パーセント、PC2、9.61パーセント）。 図2は、種の起源に従ってプロットされたPCAスコアで24のサンプルが2つのグループにクラスター化されたことを示しています。これは、C.deserticolaとC.tubulosaの化学組成が大幅に異なることを示しています。
ホンオニクの主な効果的な化合物：エキナコシド
