CistancheDeserticolaからの生製品スライスとワイン蒸気処理製品の化学成分と生物活性の違い
Mar 03, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Ying Zhang、Yuewu Wang、Song Yang、Yunfeng Xiao、Haibin Guan、Xin Yue、Xiaoqin Wang、Xiangri Li
アブストラct
よく知られている漢方薬として、ニクジュヨウの治療に使用されています腎不全症候群（関連商品をクリックしてください）何千年もの間中国で。 両方の生の製品ニクジュヨウスライス（RCD）とそのワイン蒸気処理製品（WSCD）は、さまざまな効果のために臨床的に使用されています。 この研究では、ワインを使った蒸しプロセス（SPW）の影響ニクジュヨウ化学組成と生物学的効果について調査した。 主成分分析（PCA）と定量分析を使用して、化学組成の違いを調べました。 RCDとWSCDの違いを比較するために、腎臓に栄養を与える効果も調査しました。 PCAの結果は、RCDとWSCDで明らかな分離が達成されたことを示しています。 定量分析の結果は、WSCDがRCDよりも総多糖類、総PhG、イソアクテオシド、およびオスマンツシドBの量が多いことを示しましたが、含有量は2？ -アセチルアクテオシドとアクテオシドはSPW後に減少しました。 生物学的活性に関するRCDとWSCDの比較は、両方が腎臓陽欠乏症のモデルにおける性ホルモンのレベルを回復し、抗酸化効果を改善できることを示しました。 Te WSCDは、腎臓と精嚢の内臓重量を増やすのにはるかに優れていました。 結果は、SPWがその化学成分を変化させ、その生物学的活性を高めたことを示した。
AKA：ホンオニクの王-- Dr.You
序章
ニクジュヨウは一般的な漢方薬であり、中国と日本で長年にわたって強壮剤として一般的に使用されており、一般に「砂漠の高麗人参」として知られています。ニクジュヨウ紀元前100年頃に「神農本草経のマテリアメディカ（神農本草経）」のトップグレードとして最初に記録され、腎臓欠乏症、インポテンス、女性不妊症、病的白帯下、大量の白帯下（白人）などのさまざまな病気の治療に使用されました。 、腰と膝の冷感、および高齢者の慢性便秘[1]。 これまでに、多糖類[2、3]、フェニルエタノイド配糖体（PhG）[1、4]、イリドイド[1]、リグナノイド[1、5]などのいくつかの主成分が単離されています。 それらの中で、PhGsと多糖類はニクジュヨウ[6–9]。 現代の薬理学的実験はそれを証明しましたニクジュヨウテストステロンの生成を高め、精子を保護し、細胞増殖を刺激し、細胞の生存率を高め、性的能力、記憶力の改善、老化防止、フリーラジカル捕捉、および神経保護のための顕著な活性を示します[10–13]。
毒性を減らし、および/または効果を高めるために、伝統的な中国のハーブのほとんどは処方の前に処理されるべきです。 従来のプロセスステップには、洗浄、水プロセス（水中での粉砕、蒸し、焙煎）、およびフリープロセス（ワイン、酢、塩、または蜂蜜との攪拌加熱）が含まれます[14]。 プロセス中に、化学成分が変化する可能性があります。特定の成分の相対的な含有量が変化したり、新しい成分が形成されたりする可能性があります[15]。 のプロセスニクジュヨウ長い歴史があり、ニクジュヨウ中国の薬局方（2015年版）[16]に記載されているように、酒に浸し、蒸して処理する必要があります。 SPWは、漢方薬（TCM）の理論[17]に従って、腎臓経絡への影響に影響を与えることが証明されています。 WSCDは、中国の南北朝時代の「マテリアメディカの準備と沸騰に関するLei Gongs論文（Lei Gong Pao Zhi Lun）」で最初に文書化されました。 WSCDは、中国の宋王朝の「Taiping Shenghui Fang」に記録されているように、腎臓の欠陥を治療し、精液を保護するためによく使用されます。 ただし、これまでのところ、RCDとWSCDの化学成分に関する比較研究はありませんでした。
現代の薬理学的調査は、WSCDが視床下部-下垂体-性腺軸をさまざまな程度で刺激することによって本質を確保するために腎臓を緊張させることができ、腎臓陽の欠乏などの腎臓の欠乏の治療に使用されることを示しました[18]。 しかし、これまで、RCDとWSCDの生物活性の違いは研究されていません。 最近、実験研究を容易にするために、高用量のヒドロコルチゾンをラットに注射することにより、腎臓陽欠乏動物モデルが複製されました。このモデルでは、ラットはTCMの腎臓陽欠乏で説明されている症状と非常によく似た症状を示します[19、20]。 。 腎臓陽欠乏症のラットには、体重減少、摂餌量の減少、脱力感、水分摂取量の増加、活動の低下などの症状が常にあります。 この動物モデルに基づいて、RCDとWSCDの間の栄養腎臓効果の違いが検出され、伝統的な中国のプロセスの科学的本質さえ明らかにしました。
ニクジュヨウ
2。材料と方法
2.1材料と化学物質
アクテオシド、イソアクテオシド、エキナコシド、シスタノシドA、2などの標準物質？ -アセチルアクテオシドはShanghaiYuanyeBiotechnology Co. Ltd（Shanghai、China）から購入しました。 Cistanoside F、cistanoside C、osmanthuside B、およびtubuloside Bは、Chengdu Pfeide Biotechnology Co. Ltd（Chengdu、China）から購入しました。 すべての標準の純度は98％以上でした。 HPLCグレードのメタノールとアセトニトリルはAladdinChemistryInc.（上海、中国）から購入しました。 脱イオン水は、MilliQ50 SP試薬水システム（米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して、サンプルとモバイルソリューションを準備するために取得しました。 この研究で使用された他のすべての有機溶媒は分析グレードであり、Shanghai Chemical Co. Ltd（Shanghai、China）から購入しました。
2.2サンプルコレクション
すべての生ニクジュヨウ（サンプルの7バッチ）は、内モンゴルと寧夏回族自治区から内モンゴル医科大学によって収集されました。 すべてがとして識別されましたcistancheニクジュヨウYC Ma内モンゴル医科大学の生薬学部の教授であるXiaoqinWangによる。 バウチャーの標本は、内モンゴル医科大学の薬科大学に寄託されました。 収集後、花序ニクジュヨウ茎を取り除き、茎をスライスし、室温で空気中で乾燥させた後、スライスを各バッチでランダムに2つのグループに分けました。1つはRCDで、もう1つはWSCDの準備に使用されます。
WSCDは、Chinese pharmacopeia（2015年版）[16]に従ってラボで準備されました。つまり、スライスされたRCDは、密閉容器を備えたライスワインに柔らかくなるまで6時間浸され、水浴でさらに12時間蒸されました。表面が黒くなり、室温で風乾します。
2.3主成分分析（PCA）
主成分分析（PCA）は、多変量問題の次元を減らすために広く使用されている高度な手法です。 情報を大幅に失うことなく、少数の基礎となる要因の観点から多数の変数間の相関を説明することにより、元のデータセットの次元を減らします。 この研究では、RCDとWSCDの違いは、HPLCクロマトグラフィーの相対ピーク面積に基づいて、SIMCA13.0ソフトウェアを使用した教師なしPCAによって実行されました。 PCAの助けを借りて、異なるサンプル間の分類に対する主要な化学物質の影響が発見されました。
2.4サンプル準備
2.4.1動物のための抽出物の準備
RCDとWSCDは、セクション2.2で説明されているように収集および準備されたサンプルから選択されました。
風乾してスライスしたRCDを粉砕機（FW135、Tianjin Taisite Instrument Co.、Ltd.）で粉末化し、正確に1. 0 kgの重さを量り、50％エタノールに30分間浸し、植物の比率を調べました。使用した/エタノールは1/10（w / w）でした。 そして、それを毎回１時間２回還流下で抽出した。 2つの抽出物を合わせてろ過し、エタノールを60°Cで減圧下で回収しました。PhGの全粗抽出物を60°Cで真空乾燥し、マクロポーラス樹脂で精製しました。 最後に、RCDのPhGs抽出物が得られ、正確に計量されました。 WSCDのPhGs抽出物は、上記と同じ手順に従って取得しました。
PhGを抽出した堆積物を風乾し、20倍の水で毎回1.5時間2回煎じました。 2つの抽出物を合わせ、4000 rpmで10分間遠心分離し、上清を濃縮して95％エタノールで沈殿させました。 遠心分離後、沈殿物を60℃の真空で乾燥させました。最後に、RCDの多糖抽出物を取得し、正確に秤量しました。
WSCDの多糖抽出物は、上記と同じ手順に従って得られました。
ラットを経口投与した場合、RCDおよびWSCDのPhGおよび多糖類抽出物はそれぞれ水中の混合懸濁液でした。
2.4.2。 PhGの決定のためのサンプル準備
セクション2.4.1のPhGs抽出物は、正確に0 .15 gとして計量され、5 0 mLの50％メタノール水溶液で40分間超音波処理されて抽出されました。 冷却後、減量したものに50％のメタノールを補充しました。 すべてのサンプルと溶媒は、分析前に0.45μmメンブレンでろ過されました。 RCDおよびWSCDの4つのPhGの含有量は、HPLCを使用して決定され、総PhGは、UV分光光度法を使用して決定されました。
2.5。 HPLCのクロマトグラフィー条件と4つのPhGの測定。
クロマトグラフィー分離は、デュアルグラジエントポンプ、カラムコンパートメント、およびDAD検出器を備えたUltiMate 3 0 0 0 HPLCシステム（Thermo Fisher Scientific、USA）で実施しました。 。 データは、ChromeLeonクロマトグラフィーデータシステムを使用して収集および処理されました。 サンプルは、C18ガードカラム（4.6mm×12.5 mm、5 µm）を備えたAgilent Zorbax SB-C18（25 0 mm×4.6mm、5 µm）で分離しました。 移動相は、アセトニトリル（A）と0。1％リン酸溶液（B）で構成され、流速は1 mL / minです。グラジエント溶出は次のとおりです。初期0–13分、AB（5：95、v / v）からAB（15：85、v / v）への線形変化。 13〜25分、ABへの線形変化（20：80、v / v）; 25〜43分、ABへの線形変化（25：75、v / v）。 検出器の波長は330nmでモニターされました。 カラム温度は30°Cに設定され、注入されたサンプル量は10Lでした[21]。 4つの参照標準を含むストック溶液は、参照標準を50％メタノールに溶解して、2-アセチルアクテオシドで0.20 mg / mL、アクテオシドで0.20 mg / mL、オスマンツシドBで0.05 mg/mLの最終濃度になるように調製しました。イソアクテオシドの場合は0.10mg/mL。 次に、溶液を3回繰り返して5つの異なる濃度に希釈し、検量線を作成しました。 サンプル含有量は、生重量のg/kgで表されました。
2.6。 総PhGの決定。
総PhGは、UV1000分光光度計（Shanghai Tianmei Scientific Instrument Co.、Ltd.）で330nmの波長でUV分光光度法を使用して決定されました。 エキナコシド標準液を50％メタノールに溶解して最終濃度を0.10 mg / mLにした後、3回繰り返して5つの異なる濃度に希釈し、検量線を作成してストック溶液を調製しました。
2.7。 多糖類の測定。
多糖類の測定は、フェノール硫酸法を使用して実施しました。 1mLのサンプル溶液をガラス栓付きの20mL試験管に入れ、1mLの6％フェノール溶液と5mLの濃硫酸を加えて5分間振とうしました。 混合物を沸騰水浴に１０分間移し、紫外線検出のために室温に冷却した。 紫外線吸収は、UV1000分光光度計で480nmでモニターされました。 無水D-グルコースの参照標準を正確に秤量し、蒸留水に溶解して最終濃度を0.10 mg/mLにしました。 次に、溶液を5つの異なる濃度に希釈し、3回繰り返して検量線を作成しました。
2.8。 動物実験
2.8.1。 動物と住居。
性的成熟（180-200 g）のオスのSDラットは、Xinglong（Beijing）Experimental Animal Farm（年齢：6週齢）から購入し、実験動物のライセンスはSCXK（Jing）：2016-0003でした。 すべての動物の手順は、内モンゴル医科大学の動物研究委員会によって承認され、動物の世話の原則に関する国立衛生研究所のガイドライン（2004年）に従って実施されました。 すべての動物は、21〜23度の温度調節、40〜65パーセントの相対湿度、および12時間の暗/明サイクルのバリアシステムで飼育されました。 ラットに自由に餌と水を与え、上記の環境に1週間順応させた。
2.8.2。 投与量とサンプリング。
ラットを個々の代謝ケージに移し、ランダムに6つのグループに分けました（各グループで？= 10）。 等量の生理食塩水を注射したグループ1を除いて、15 mg / kgのコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム（Tianjin Biochemical Pharmaceutical Co.、Ltd.、Tianjin、Chinaから購入）を2週間筋肉内注射しました。 14日目に、体重、摂餌量、水分摂取量、尿量、および5分以内の自発的活動を収集して、腎臓陽欠乏モデルが正常に作成されたかどうかを確認しました。 15日目から、6つのグループを次のように処理しました。グループ1とグループ2（モデルグループ、M）を等量の蒸留水で処理し、グループ3（RCDグループのPhGs抽出物、PR）を{{12 }}。42g/kgRCDのPhGs抽出物。これは生の約1.8g/kgに相当します。ニクジュヨウ他のグループは同じで、グループ4（WSCDグループのPhGs抽出物、PW）は0の用量で処理されました。WSCDのPhGs抽出物は49 g / kg、グループ5（RCDグループの多糖抽出物、SR）は0。18g/ kgのRCDの多糖抽出物で処理され、グループ6は（WSCDグループの多糖抽出物、SW）0。22 g/kgの多糖抽出物の用量で処理されました。 WSCD。 すべてのラットは、1日あたりの胃灌流によって治療された。 １ヶ月の治療後、採血前の１２時間、ラットは餌を与えられなかった。 翌日、すべてのラットに麻酔をかけ、犠牲にした。 試験中、投与量を調整するためにラットの体重を週に一度測定し、犠牲にする前に再度体重を測定した。 血液サンプルは、10パーセントのEDTA-2Na溶液を含むEppendorfチューブに収集されました。 血清を2000rpmで15分間の遠心分離により分離し、-80度で保存した。 さらなる使用のため。 さらに、腎臓、睾丸、精巣上体、前立腺、および精嚢を取り除き、迅速に秤量した。 秤量後、精巣を液体窒素で凍結し、SODとMDAを測定しました。
2.9。 ホルモンと抗酸化効果の分析。
テストステロン（T）とエストラジオール（E2）のレベルは、青島ケチュアン品質検査センターで放射線免疫と比色法によって測定されました。 凍結した睾丸の重さを量り、20倍の冷生理食塩水（W / W）と混合しました。 氷浴中の組織ホモジネートによって得られた睾丸ホモジネートを遠心分離して上澄みを得た。 睾丸のSODおよびMDAの含有量は、指示に従ってSODおよびMDAキットによって決定されました。
2.10。 統計分析。
グループ間の差異の有意性は、一元配置分散分析と、それに続くSPSSソフトウェア25.0を使用した0。05の有意限界でのSchefeの検定によって比較されました。 すべてのデータは平均±標準偏差（SD）として表されました
(n=3).
ニクジュヨウエキス
3.結果
3.1。 PCAを使用したSPW後のPhGの変化の分析。
SPW後のPhGの変化を比較するために、9つのクロマトグラフィーピークが特徴的なピークとして選択され、特定されました。 それらの構造を図1に示し、その相対的なピーク面積を定量的に計算しました。 図2に示すHPLCクロマトグラムは、主要なPhGの相対含有量がSPW中に変化したことを示しています。 さまざまなサンプルを識別するために、9つの成分の相対ピーク面積に関するPCA分析が得られました。 スコアのプロット（図3（a））では、RCDとWSCDは互いに遠く離れていました。これは、サンプルが2つのクラスターに分類されたことを示しています。 そのため、化学成分の含有量が異なっていたと考えられます。 識別のための潜在的な化学マーカーをさらに見つけるために、拡張統計分析を実行して、ローディングBiplotを生成しました（図3（b））。 ピーク2、3、4、6、および7はSPW後に減少し、ピーク5、8、および9は増加します。これらはすべて、RCDとWSCDを区別するための最も重要なコンポーネントでした。 ピーク1の相対的な内容は、SPW後もあまり変化しません。
3.2。 全多糖類とPhGの含有量はSPW後に変化しました。
図3（b）に示すように、8つのコンポーネント（5、8、および9が増加し、2、3、4、6、および7が減少）が大幅に変化し、サンプルのクラスタリングに大きな影響を与えました。 その中で、イソアクテオシドとオスマンツシドBが最も増加したのは2？ -アセチルアクテオシドとアクテオシドが最も減少しました。 それで、イソアクテオシド、オスマンツシドB、2の内容？ -アセチルアクテオシド、およびアクテオシドは、HPLCによって決定された。 図1に示すように、ピーク4はアクテオシド、ピーク5はイソアクテオシド、ピーク7は2？ -アセチルアクテオシドとピーク8はオスマンツシドBでした。RCDとWSCDの総PhGはUV法を使用して決定し、総多糖類はフェノール硫酸法を使用して実行しました。結果を表1、イソアクテオシド、オスマンツシドBに示しました。 、WSCDの総多糖類とPhGは、RCDと比較して大幅に増加しました。 2？ -アセチルアクテオシドとアクテオシドは大幅に減少しました。
3.3。 Teヒドロコルチゾン誘発腎臓-陽欠乏モデルが作成されました。
正常群と比較して、15mg / kgのコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウムを2週間筋肉内注射した後、体重、摂餌量、および自発的活動が有意に減少しました（P<0.05), and="" the="" water="" intake="" and="" urine="" volume="" were="" increased;="" the="" results="" were="" shown="" in="" table="" 2.te="" t="" and="" e2="" levels="" in="" the="" serum="" of="" the="" model="" group="" were="" lower="" than="" the="" normal="" group="" as="" shown="" in="" figure="" 4.="" from="" the="" above,="" the="" kidney-yang="" deficiency="" model="" was="" successfully="">
3.4。 平均内臓重量および指数に対する抽出物の影響。
すべてのラットとその内臓の重さを量り、次に平均内臓指数を計算した。 N群と比較して、M群は腎臓、精嚢、精巣上体、および睾丸の内臓重量を即座に減少させ、これはまた、ヒドロコルチゾン誘発性の腎臓-陽欠乏モデルが首尾よく作成されたことを示した。 M群と比較して、PWおよびSR群では観察されたすべての内臓重量が増加し、PR群では睾丸、精巣上体、精嚢、および前立腺の重量が増加し、SW群では腎臓、睾丸、精巣上体の重量が増加しました。精嚢。 PR群と比較して、PW群は腎臓、精嚢、および前立腺で優れていた。 睾丸、精巣上体、精嚢、および前立腺の重量において、SR群とSW群の間に有意差はありませんでした。 結果を表3に示した。
N群と比較して、M群では腎臓、睾丸、精巣上体、精嚢の内臓指数が低下していた。 M群と比較して、PWおよびSR群は腎臓、睾丸、前立腺、および精嚢の指数を増加させ、PR群は睾丸、前立腺、および精嚢の指数を増加させ、SW群は腎臓、睾丸および精嚢の指数を増加させました。 PR群と比較して、PW群は腎臓、精嚢、および前立腺で優れていた。 Te SWおよびSRグループは、腎臓、睾丸、精嚢、および精巣上体の同様の指標を持っていました。 結果を表4に示した。
3.5。 ホルモンレベル（TおよびE）に対する抽出物の影響2)
図4に示すように、M群と比較して、すべての治療群（PW、PR、SW、およびSR群）のTおよびE2のレベルは有意に増加しました（P<0.05). however,="" the="" pw="" group="" was="" better="" than="" pr="" group="" in="" the="" level="" t="" and="" e2.="" te="" sr="" and="" sw="" groups="" had="" no="" significant="">
3.6。 抗酸化効果に対する抽出物の影響。
SODは重要な抗酸化酵素です。 MDAは脂質過酸化の産物であり、酸化剤による損傷の程度を反映する指標です。 SODとMDAの含有量は、酸化剤と抗酸化剤の能力の程度を反映しています。 図5に示すように、M群と比較して、すべての治療群（PW、PR、SW、およびSR）で抗酸化効果が強化されました。 SWグループは最大の抗酸化効果を持っていました。
ニクジュヨウ
4。議論
臨床応用の前に、原油は伝統的な中国のプロセス技術にかけられるべきです。 蒸しは、いくつかの中国の薬草の伝統的な処理アプローチの1つであり、メイラード反応[22]によって生成される黒色を与え、いくつかの生物活性成分[23]および薬理学的活性の量を増加させます。 プロセス製品の1つとしてのWSCDは、中国薬局方の2015年版に記載されているRCDと比較して、腎臓に栄養を与えるという点で優れています。 この研究では、PCAの結果は、SPWがRCDの化学的プロファイルを変更する必要があることを示しています。 さらに、PhGの8つのコンポーネントが大幅に変更されました。 総PhG、総多糖類、イソアクテオシド、およびオスマンツシドBが最も増加しましたが、2？ -アセチルアクテオシドとアクテオシドはSPW後に減少しました。 結果は、SPWがRCDの化学成分を変える可能性があることを示しました。 WSCDでは、1,3、4-三置換グルコピラノシル部分（アクテオシド、2？-アセチルアクテオシド、シスタノシドCなど）を含むPhGの含有量は減少しましたが、異性体の濃度は1,3、{{13 }}三置換グルコピラノシル部分（イソアクテオシドやツブロシドBなど）が増加しました。これは、化学成分の変換がSPW中に発生した可能性があることを示しており、加水分解反応が理由の1つになります。 提案された変換経路を図6に示しました。SPW後の多糖類のTeの増加は朝鮮人参でも報告されていました[24]。
ニクジュヨウ腎臓を活性化し、テストステロンレベルの低下を逆転させ、抗酸化作用と抗炎症作用を有することが報告されており[25]、PhGと多糖類はニクジュヨウ。 PhGとして、イソアクテオシドとオスマンツシドBには、抗酸化作用と抗炎症作用の欠陥がありました[26、27]。 そこで、テストステロンレベルの薬理効果とRCDおよびWSCDの抗酸化効果の比較を検討しました。 ヒドロコルチゾン誘発性の腎臓陽欠乏症のモデルでは、内分泌が破壊され、血中の性ホルモンのレベルが大幅に低下しました。 この研究では、性ホルモン分析の結果は、RCDとWSCDの両方がTとE2のレベルを大幅に増加させる可能性があり、PhGと多糖類の両方が性ホルモンの改善を示したことを示しました。 特にPhG抽出グループでは、WSCDはRCDよりも優れていました。 内臓指数の結果は、PhGと多糖類の両方が内臓重量とそれらの重量指数を改善できることを示しました。 PhGs抽出物グループでは、腎臓と精嚢の重量と指標を増加させる点で、WSCDはRCDよりも優れています。 加えて、ニクジュヨウ特に多糖類はWSCDでグループを抽出します。 上記のように、RCDとWSCDの両方が腎臓陽欠乏症候群を改善する可能性があります。 ただし、精巣上体と睾丸のT、E2、重み、およびインデックスのレベルを上げるには、WSCDの方がRCDよりも優れています。 薬理効果の研究結果は、SPWがPhGの化学成分を変化させ、多糖類の含有量を増加させ、それが性ホルモンレベルを増加させ、抗酸化効果を高めたことを示しました。
5。結論
この研究は、PhGの変化、総多糖類、およびRCDとWSCDの腎臓陽欠乏ラットに対する薬理学的効果、特にホルモンレベルと抗酸化作用を発見することでした。 この研究は、伝統的な中国のハーブのプロセスがそれらの化学成分を変え、それらの生物活性に影響を与える可能性があることを示しました。 生の製品と加工された製品がクリニックで異なって処方されたことも支持されています。
cistancheカプセル
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