パート1：Cistanche抽出物は、新しい変異型DJ-1をトランスフェクトした神経芽細胞腫細胞モデルにおいて過酸化水素によって誘発される神経毒性を改善します
Mar 02, 2022
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com
1.はじめに
主な神経変性疾患には以下が含まれますアルツハイマー病疾患、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病など。 これらの疾患の中で、PD（パーキンソン病）は世界で2番目であり、60歳以上の人々で1％〜2％を達成しています（Burke＆O'Malley、2013; Mullard、2017; Shen＆Ji、2013）。 PDの主要な神経学的特徴として、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンは進行性の変性であり（Glizer＆MacDonald、2016）、レビー小体（Zhang、An、Zhang、Pu）と呼ばれるシヌクレイン封入体の出現を伴います。 、2010）。 パーキンソン病の病因では、安静時振戦、硬直、動作緩慢、姿勢異常がパーキンソン病の主な症状として診療所で診断されています。 ドーパミン作動性ニューロンの正確な進行性変性メカニズムは理解できませんが、殺虫剤、神経毒性物質、重金属への曝露などの環境的原因、またはパーキン（Kitada et al。、1998）、α-シヌクレイン（Polymeropoulosetal。 al。、1997）、およびDJ-1（Biosa et al。、2017; Bonifati et al。、2003）は、PDの発生につながると考えられています。 現在までに、DJ-1遺伝子変異によって引き起こされるミスセンス変異、フレームシフト変異、および大きな断片の欠失の数は10を超えています（Andres-Mateos et al。、2007; Bonifati et al。、2003; Hague et al。、2003）。 DJ-1タンパク質内では、Leucine166Proline（L166P）の置換が重要です。 さらに、酸化ストレスがPDで発生し（Dexter et al。、1989、1994; Nikam、Nikam、Ahaley、＆Sontakke、2009）、その病因に関与していることも示されています（Hague et al。、2003）。
24 kbに分布する8つのエクソンを含むDJ-1遺伝子は、ヒトの染色体1p36に位置し（Bonifati et al。、2003）、189アミノ酸を含む高度に保存されたタンパク質をコードします。 ThiJ / PfpIファミリーに属するタンパク質は、ホモ二量体の形で存在します。 大脳皮質と黒質および線条体内のグリア細胞は、DJ-1タンパク質の領域で主に見られます（Olzmann et al。、2007）。 これらの細胞では、DJ-1は癌遺伝子（Nagakubo et al。、1997）、転写調節（Kim et al。、2005; Niki、Takahashi-Niki、Taira、Iguchi-Ariga、＆Agria、2003）などの役割を果たします。 ）、抗酸化ストレス（Taira et al。、2004; Zhou＆Freed、2005）、シャペロン（Shendelman、Jonason、Marlinat、Leete、＆Abeliovich、2004; Zhou、Zhu、Wioson、Petsko、＆Fink、2006）、およびプロテアーゼ（Abou-Sleiman、Healy、Quinn、Lees、およびWood、2003年）。
Cistancheは伝統的な漢方薬であり、主にアンドロロジー病を治療するために古くから使用されてきました。 の主な有効成分Cistancheアクテオシド、エキナコシドなどの34の化合物を含むフェニルグリコシドです。Cistanche抽出物性機能の改善、老化防止、学習能力と記憶能力の向上、神経保護、免疫調節、抗疲労、抗虚血、および肝臓保護が含まれます（Tu et al。、2011）。 コーヒー酸は、Cistancheの主要代謝物の1つです（Yan、2018）。
PDの一般的に使用される細胞モデルには、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン誘導PC12細胞（Abou-Sleiman et al。、2003）および過酸化水素（H2O2）誘導神経芽細胞腫（SH-SY5Y）細胞（Zhangetal。 。、2009）。 ただし、PDの典型的な病理学的特徴はこれらのモデルには存在しません。 PDのより生理学的に関連性のある細胞モデルを開発するために、この研究では、H2O2誘導L166PおよびC106S DJ-1トランスフェクトSH-SY5Y細胞を確立し、Cistanche抽出物アクテオシド、エキナコシド、カフェー酸、およびCistanche総配糖体これらの2つのモデルで初めて。
Cistanche抽出物の抗神経変性疾患
2。材料と方法
2.1|プラスミド、薬物、化学物質、および細胞
FLAG-L166P DJ-1、FLAG-C106S DJ-1プラスミド、および抗DJ-1ポリクローナル抗体は、北海道大学大学院薬学研究科の有賀博義博士から提供されました。 脱水最小必須培地（MEM）およびF-12培地はGibcoから購入しました。 リポフェクチンはInvitrogenからのものでした。 FastDigestXhoIとFastDigestEcoRIはFermentasからのものでした。 エンドトキシンフリーのプラスミド調製キットは、biotechから入手しました。 SH-SY5Y細胞株は、中国医科学アカデミーのセルバンクから入手しました。 BCAタンパク質アッセイ試薬キットはPierceから入手しました。 PVDFメンブレンはミリポア製です。 抗FLAGポリクローナル抗体はGeneTexから入手しました。Cistanche抽出物アクテオシド、エキナコシド、カフェー酸、およびCistanche総配糖体を含むは、北京大学薬学部自然医学科から供給されました。
2.2|プラスミドの増幅、抽出、精製
大腸菌JM109細胞をLB液体培地でOD600=0.5まで培養した後、塩化カルシウム法を使用してコンピテントセルを調製しました。 次に、コンピテント大腸菌をヒートショック法を使用してプラスミドDNAで形質転換し、その後、形質転換体をアンピシリンを含むLBプレート上で37度で16〜24時間培養しました。 次に、形質転換に成功したモノクローナルコロニーを選択し、50 ug/mLアンピシリンを含むLB液体培地で37度でさらに12時間培養しました。 プラスミドは、エンドトキシンフリーのプラスミド調製キットを製造元の指示に従って使用して抽出および精製しました。
2.3|プラスミドの同定
抽出したプラスミドを酵素消化した後、1％アガロースゲル電気泳動を用いてプラスミドと消化断片を調べました。 得られたゲルをEB溶液で室温で20〜25分間染色し、写真を撮りました。
2.4|SH-SY5Y細胞へのプラスミドトランスフェクション
精製したプラスミドDNAを、10％ウシ胎児血清を含むMEM/F-12培地で培養したSH-SY5Y細胞にトランスフェクトしました。 次に、トランスフェクトされた細胞を400 ug / mL G418を含む培地で選択し、その後、200 ug /mLG418を使用して安定的にトランスフェクトされた細胞株を維持しました。
2.5|ウエスタンブロットによるトランスフェクト細胞の同定
トランスフェクトしたSH-SY5Y細胞をRIPAバッファーで溶解しました。 ライセートを遠心分離した後、BCAタンパク質アッセイ試薬キットを使用して上清中の総タンパク質濃度を測定しました。 次に、等量のタンパク質抽出物を12.5％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、PVDFメンブレンに転写しました。 PVDFメンブレンは、TBST溶液中の5％脱脂粉乳でブロックされ、免疫検出のために処理されました。 一次抗体として抗FLAGと抗DJ-1を使用し、二次抗体としてHRP標識IgGを使用しました。 強化された化学発光検出システムを適用して、標的タンパク質を検出しました。
2.6|トランスフェクトされた細胞の免疫細胞化学的同定
トランスフェクトされたSH-SY5Y細胞は、4％パラホルムアルデヒド溶液で固定され、0 .3％Triton X-100溶液で透過処理され、10％ヤギ血清でブロックされました。 次に、ブロックされた細胞を最初に抗FLAGおよび抗DJ-1ポリクローナル抗体とインキュベートし、次にFITC結合ヤギ抗ウサギ二次抗体とインキュベートしました。 細胞核をHoechst33342で染色し、倒立蛍光顕微鏡（IX-71、Olympus）で細胞を可視化しました。
2.7|細胞生存率アッセイ
トランスフェクトされていないSH-SY5Y細胞とトランスフェクトされたSH-SY5Y細胞を、アクテオシド、エキナコシド、コーヒー酸、Cistanche総配糖体（それぞれ1 0、20、40 ug / mL）を含む96抽出物にプレーティングし、細胞を6時間インキュベートした後、0.2mMH2O2でさらに1時間処理しました。 培地を廃棄し、細胞生存率を上記のようにMTTを使用してアッセイした。
2.8|細胞生存率に対するCistanche抽出物の効果
アクテオシド、エキナコシド、カフェー酸、およびCistanche総グリコシド（それぞれ1 0、20、および40 ug / mL）を含む抽出物を添加し、細胞を6時間インキュベートした後、0.2mMH2O2で処理しました。さらに1時間。 培地を廃棄し、細胞生存率を上記のようにMTTを使用してアッセイした。
2.9|統計分析
データは、3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。 一元配置分散分析とSPSS22。0ソフトウェアを使用したLSD法を使用して、グループ間の差異を分析しました。 p<>
Cistancheハーブ
3|結果
3.1|プラスミドの形質転換と精製に成功しました。 E. coli JM1 0 9で別々に発現させた後、プラスミドを抽出し、制限酵素で消化した後、1％アガロースゲル電気泳動を使用して調べました（図1）。 6.2kbのプラスミドは5.4kbと0.8kbの線状DNAフラグメントに切断され、L166PとC106SDJ-1プラスミドの両方が正常に発現および精製されたことを確認しました。
3.2|ウエスタンブロッティングによるトランスフェクト細胞の同定。 図2に示すように、約70kDaでFLAG-L166PDJ-1およびFLAG-C106SDJ-1バンドが検出されました。 トランスフェクトされたSH-SY5Y細胞における高レベルのFLAGタグ付きタンパク質は、L166PおよびC106SDJ-1変異体がそれぞれのトランスフェクタントで強く発現されたことを示しています。
3.3|トランスフェクトされた細胞の免疫細胞化学的同定。 抗DJ-1または抗FLAG抗体とのインキュベーション後のトランスフェクトされたSH-SY5Y細胞からの強い蛍光シグナルを示しています。 これは、トランスフェクタントで発現された高レベルのL166PおよびC106SDJ-1を確認します。
3.4|トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされていない細胞よりもH2O2に対して感受性が高かった。 段階的濃度のH2O2（0。1、0。2、0。3、0 .4、{{15}）の存在下で1時間インキュベートした後}.5および1mM）、L166PまたはC106S DJ-1でトランスフェクトされたSH-SY5Y細胞の生存率は、トランスフェクトされていない細胞と比較して用量依存的に低下しました。
3.5|Cistanche抽出物は、H2O2による低下を抑制しました。SH-SY5Y細胞の生存率は、Cistanche抽出物、アクテオシド、エキナコシド、カフェー酸、およびCistanche総グリコシド（それぞれ、すべて10、20、および40 ug / mL）を含みます。
Cistanche