パート1：エキナコシドはラット大脳皮質神経終末における電位依存性Ca2プラスエントリーおよびプロテインキナーゼCを抑制することによりグルタミン酸放出を阻害する
Mar 05, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2、Tzu Yu Lin 1,2、Shu Kuei Huang 1、Su Jane Wang 3 *
概要：
グルタミン酸作動性システムは、神経保護療法の効果に関与している可能性があります。エキナコシド、薬草から抽出されたフェニルエタノイド配糖体ハーブシスタンチェ、神経保護効果があります。 この研究では、エキナコシドラット大脳皮質神経終末（シナプトソーム）における4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出について。 エキナコシドは、Ca2プラス依存性を阻害しましたが、Ca2プラス非依存性の4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を濃度依存的に阻害しませんでした。 エキナコシドはまた、4-アミノピリジンによって引き起こされる細胞質遊離Ca2プラス濃度の増加を減少させましたが、シナプトソーム膜電位を変化させませんでした。 4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出に対するエキナコシドの阻害効果は、Cav2.2（N型）およびCav2.1（P / Q型）チャネルの広域スペクトル遮断薬であるo-コノトキシンMVIICによって防止されました。 、しかし細胞内Ca2プラス放出阻害剤ダントロレンおよび7-クロロ-5-（2-クロロフェニル）-1、5-ジヒドロ-4には非感受性でした、1-ベンゾジアゼピン-2（3H）-オン（CGP37157）。 さらに、エキナコシドは、4-アミノピリジンが誘導するプロテインキナーゼCのリン酸化を減少させ、プロテインキナーゼC阻害剤は、グルタミン酸放出に対するエキナコシドの効果を無効にしました。 これらの結果によると、誘発されたグルタミン酸放出に対するエキナコシドの阻害効果は、電位依存性Ca2プラス流入の減少およびその後のプロテインキナーゼC活性の抑制に関連していることを示唆している。
キーワード：エキナコシド; グルタミン酸放出; 大脳皮質神経終末; 電位依存性Ca2プラスチャネル; プロテインキナーゼC
1.はじめに
エキナコシドに存在する主要なフェニルエタノイド配糖体ですハーブCistanche、忘却、インポテンス、慢性便秘の治療に使用される有名な漢方薬[1]。エキナコシド抗酸化、抗炎症、抗癌、肝保護、免疫調節などのさまざまな生物活性を持っています[2–4]。 特に、エキナコシドには神経保護効果があります。 たとえば、初代ラット皮質ニューロン、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞、褐色細胞腫（PC12）細胞における酸化ストレスまたは神経毒誘発性神経毒性から保護することができます[5–8]。 さらに、エキナコシドは、パーキンソン病、アルツハイマー病、および中大脳動脈閉塞の動物モデルにおいて、脳の損傷を軽減し、認知機能を改善します[9–12]。 しかし、それを介してメカニズムエキナコシド神経保護を誘発することは完全には理解されていません。
神経保護は、有毒な傷害の際にニューロンの構造と機能を維持する複雑なプロセスです。 グルタミン酸興奮毒性の低下は、脳の神経保護に関与する潜在的なメカニズムと考えられています。 興奮性アミノ酸神経伝達物質であるグルタミン酸は、いくつかの脳機能において重要な役割を果たしています[13]。 しかし、高グルタミン酸濃度下でのグルタミン酸受容体の過剰活性化は、細胞内Ca2に加えて過負荷、ミトコンドリア機能障害、フリーラジカル産生、および神経細胞死を引き起こします[14,15]。 この病理学的プロセスは、脳虚血、外傷性脳損傷、てんかん、神経変性疾患など、多くの脳障害に関係しています[16,17]。 したがって、病態生理学的グルタミン酸作動性伝達を遮断する阻害剤は、潜在的な神経保護薬と見なされます。 これらの注目すべき例は、グルタミン酸受容体拮抗薬です[18,19]。 しかし、これらの薬剤の臨床試験は、有効性が低く、望ましくない、あるいは細胞毒性の副作用でさえあるために失敗しました[20,21]。 直接的なグルタミン酸受容体遮断に加えて、グルタミン酸放出阻害は神経保護のための効果的な戦略かもしれません。 いくつかの神経保護剤（例えば、メマンチンやリルゾール）は、ラットの脳組織におけるグルタミン酸の放出を減らすことができます[22–24]。
興奮毒性におけるグルタミン酸の役割とエキナコシドの神経保護プロファイルを考慮して、本研究では、ラット大脳皮質から精製した単離神経終末（シナプトソーム）を使用して、グルタミン酸放出に対するエキナコシドの効果を調査し、潜在的なメカニズムをさらに調査しました。 孤立した神経終末の準備は、シナプス後の影響がない場合の薬物による神経伝達物質放出のシナプス前調節を研究するための確立されたモデルです[25]。 このモデルを使用して、グルタミン酸放出、膜電位、シナプス前Ca2と流入、およびプロテインキナーゼC活性に対するエキナコシドの効果を評価しました。 文献のレビューによると、これはエキナコシドがシナプス前レベルで内因性グルタミン酸放出を阻害するメカニズムを文書化した最初の報告です。
2.結果
2.1. エキナコシド小胞エキソサイトーシスを減少させることにより、ラット大脳皮質神経終末からの4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を阻害する
図1は、精製ラット大脳皮質シナプトソームからの4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出に対するエキナコシドの濃度依存性効果を示しています。 1 mM CaCl2とインキュベートしたシナプトソームでは、1mM4-アミノピリジンが7.4±{{1{{20}}}}。1nmol/ mg/5分のグルタミン酸放出を引き起こしました。 1、5、1 0、30、および50 uMのエキナコシドを6.5±0.2、5.8±0.3、4.8±0.2、
4.1±0.1、または2.3±0。4 nmol / mg / 5 min、それぞれ（F（5,24）= 67。1、p= 0。 000）。 用量反応曲線から導き出された、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出のエキナコシド媒介阻害のIC50値は24uMでした。 さらに、300 uMのエチレングリコールビス（-アミノエチルエーテル）-N、N、N /、N /-四酢酸（EGTA）を含む細胞外Ca2プラスフリー溶液中の1mM4-アミノピリジンによって誘発されるグルタミン酸放出2。1 0。2nmol/ mg / 5 min（F（2,12）= 310。65、p=0。000）、
そして、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出のこのCa2プラス非依存性成分は、2 0 uMエキナコシド（1.8±0 .2 nmol / mg/5分;p{{1 0}}。58;図1）。 0。1uMバフィロマイシンA1、小胞輸送阻害剤[26]で処理されたシナプトソームでは、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出が大幅に減少しました（2.2±0。2 nmol / mg / 5分;F（2,12）= 249。518、p=0。000）。 バフィロマイシンA1の存在下では、2 0 uMエキナコシドはグルタミン酸の放出を有意に阻害できませんでした（2.1±0.2 nmol / mg/5分;p= 0。94;図1）。 対照的に、10 uMのDL-スレオ-ベータ-ベンジル-オキシアスパラギン酸（DL-TBOA、グルタミン酸再取り込み阻害剤）[27]は、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を11.8±0.4 nmol / mg / 5分に増加させました（ t（8）= -11。31、p=0。000）。 DL-TBOAの存在下でも、20 uMのエキナコシドは4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を有意に阻害しました（7.7±0.2 nmol / mg /5分;F（2,12）= 87。23、p=0。000;図1）。
2.2エキナコシドは細胞質ゾルのCa2と濃度を低下させますが、シナプトソーム膜電位は変化させません
1 mM 4-アミノピリジンによって引き起こされるシナプトソーム脱分極は、Ca2プラス濃度を増加させました（p=0。000;表1）。 20 uMのエキナコシドの適用は、基礎Ca2プラス濃度に有意な影響を与えませんでしたが（t（8）= 0。06、p=0。95）、4-アミノピリジンによる増加を有意に減少させました。 Ca2と濃度（t（10）= 6。16、p=0。000）。 さらに、1 mM 4-アミノピリジンは3'、3'、3'-ジプロピルチアジカルボシアニンヨージド[DiSC3（5）]蛍光で増加しました（p=0。000）。 20 uMのエキナコシドを添加しても、静止膜電位は変化せず（t（8）= 0。976、p=0。36）、4-アミノピリジンを介したDiSC3の増加も大幅に変化しませんでした。 （5）蛍光（t（8）= -0。014、p=0。99;表1）。
2.3 Cav2.2（N型）およびCav2.1（P / Q型）チャネルを介したCa2と流入の減少は、エキナコシドによる4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出の阻害に関連している可能性があります
図2は、N型およびP /Q型のCa2とチャネルブロッカーである2uMのo-コノトキシンMVIICが、4-アミノピリジンによって誘発されるグルタミン酸の放出を7.4±{{10}}から減少させたことを示しています。 2から2。0±0。1nmol/ mg / 5分（t（9）= 25。35、p=0。000）。 o-コノトキシンMVIICの存在下では、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出に対する20 uMエキナコシドの影響は有意ではありませんでした（1。8 2±プラス0.2 nmol / mg /5分;t（8）=1。06、p=0。32）。 小胞体からの細胞内Ca放出の阻害剤であるダントロレン（10uM）
網状組織[28]、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出の減少（5.6±0。3 nmol / mg /5分;F（2,14）{{10}}。 95、p=0。000）。 ただし、ダントロレンの存在下でも、20 uMのエキナコシドはグルタミン酸の放出を大幅に阻害する可能性があります（3.3±0.2 nmol / mg/5分;p= 0。000）。 100 uMの7-クロロ-5-（2-クロロフェニー）-1、5-ジヒドロ-4、1-ベンゾチアゼピンを使用しても同様の結果が観察されました-2（3H）-one（CGP37157）、ミトコンドリアNaプラス/Ca2プラス交換の膜透過性ブロッカー。 調べた5つのシナプトソーム調製物では、20uMのエキナコシドと100uMのCGP37157を組み合わせて、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸の放出を48.3パーセント±5.2パーセント減少させました（F（2,13）= 136。79、p {{ 49}}。000）、エキナコシド単独による阻害と同様（46.2パーセント±2.3パーセント; p=0。89;図2）。
2.4 エキナコシドプロテインキナーゼCを介したシグナル伝達により4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を阻害する
図3に示すように、10 uM 2- [1-（3-ジメチルアミノプロピル）インドール-3-イル] -3-（インドール-3-イル）マレイミド（GF109203X）、一般的なプロテインキナーゼC阻害剤[29]は、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を減少させました（F（2,13）= 19。46、p= 0。{{17 }}）。 GF109203Xで処理されたシナプトソームでは、20 uMのエキナコシドが4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出をわずか5.5％±1.8％（p=0。89）減少させ、エキナコシド単独の場合（42.4％±2.3）よりも少なくなりました。パーセント;p= 0。000）。 同様の結果が、5,6,7、13-テトラヒドロ-13-メチル-5-オキソ-12 H-インドロ[2、3-a]ピロロ[3 、4- c]カルバゾール-12-プロパンニトリル（Go6976）、Ca2プラス依存性プロテインキナーゼCアイソフォーム（、I、II、y）に選択的[29]。 3 uM Go6976の存在下で、20 uMエキナコシドはグルタミン酸放出を11.9パーセント±2.9パーセント（p=0。59）減少させ、エキナコシド単独の場合（42.4パーセント2.3パーセント; p {{ 65}}。000;図3）。 対照的に、Ca2プラス非依存性プロテインキナーゼC6阻害剤である3 uMロットレリン[30]は、4-アミノピリジン（1 mM）誘発グルタミン酸放出を有意に変化させませんでした（p=0。45）。 それにもかかわらず、ロットレリンの存在下で、20 uMのエキナコシドは効果的に放出の37.1パーセント±5.6パーセントの平均阻害を引き起こしました（F（2,13）= 19。72、p= 0。{{88 }}）、エキナコシド単独によるものと同様（p=0。41;図3）。 さらに、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤2-（2-アミノ-3-メトキシフェニル）-4 H -1-ベンゾピラン-4-オン）（PD98059 ）（50 uM）およびプロテインキナーゼA阻害剤N-[2-（p-ブロモシンナミルアミノ）エチル] -5-イソキノリンスルホンアミド（H89）（100 uM）は4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を減少させた（p=0。000）。 PD98059またはH89の存在下でも、20 uMのエキナコシドは放出を効果的に減少させました（F（2,13）= 52。3、p= 0。000;図3）。
図4は、1 mM 4-アミノピリジンがシナプトソームのプロテインキナーゼCのリン酸化を増加させたことを示しています（t（4）= -6。871、p=0。002）。 4-アミノピリジンを添加する前にシナプトソームを20uMエキナコシドで10分間前処理すると、4-アミノピリジンによるプロテインキナーゼCのリン酸化が大幅に減少しました（F（2,6）= 29。202 、p=0。001）。
2.5エキナコシドを介したグルタミン酸放出の阻害にはガンマアミノ酪酸A型（GABAA）受容体は関与しない
図5では、SR95531（GABA A受容体のアンタゴニスト）の非存在下または存在下での4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出に対するエキナコシドの効果を比較しました。 さらに、100 uM SR95531は、4-アミノピリジン（1 mM）によって誘発されるグルタミン酸放出を有意に変化させませんでした。 SR 95531-で処理されたシナプトソームでは、20 uMのエキナコシドを適用すると、4-アミノピリジンによって誘発されるグルタミン酸の放出が43％抑制されました（F（2,12）= 42。63、p { {18}}。000）、これはエキナコシド単独による阻害と有意差はありませんでした（40パーセント; p=0。000）。 同様の結果が、別のGABA A受容体拮抗薬であるビククリン（50 uM）でも得られました。 ビククリンとエキナコシドの存在下で測定された放出は、ビククリンのみの存在下で得られた放出とは有意に異なっていました（p=0。000）。
3.ディスカッション
この研究では、エキナコシド、ハーブの活性化合物Cistanche、ラット大脳皮質神経終末における4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を抑制した。 の可能な基礎となるメカニズムエキナコシドグルタミン酸放出の媒介阻害はさらに調査され、ここで議論されます。
3.1エキナコシドを介したグルタミン酸放出阻害の根底にあるメカニズム
4-アミノピリジンによって引き起こされるグルタミン酸放出は、2つの成分で構成されます。グルタミン酸を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスによって生成される、生理学的に関連するCa2プラス依存性成分。 また、Ca2プラスに依存しない成分は、長期の脱分極に起因し、膜電位を介したグルタミン酸トランスポーターの定常状態の外向きへのシフトを引き起こし、細胞質ゾルのグルタミン酸流出に影響を及ぼします[31]。 ここでは、エキナコシドがCa2プラスフリー培地（Ca2プラス非依存放出）の存在下で4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を有意に阻害しなかったことを観察しました。 さらに、観察されたエキナコシドを介した4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出の阻害は、バフィロマイシンA1（シナプス小胞のグルタミン酸含有量を枯渇させる）によって効果的に防止されましたが、DL-TBOA（すべての興奮性アミノ酸を非選択的に阻害する）によっては防止されませんでしたトランスポーターサブタイプ）。 これらの結果は、エキナコシドが、神経終末原形質膜グルタミン酸トランスポーターの逆転を介して、グルタミン酸のCa2プラス非依存性細胞質ゾル流出に影響を与えることなく、グルタミン酸放出のCa2プラス依存性エキソサイトーシスに影響を与えることを示唆している。 シナプス終末では、Naとチャネルの阻害またはKとチャネルの活性化が膜の興奮性を安定させ、その結果、誘発されたCa2と神経伝達物質の放出を減少させます[32,33]。 したがって、エキナコシドを介したグルタミン酸放出阻害の根底にある潜在的なメカニズムには、シナプトソームの興奮性の低下が含まれます。 ただし、この可能性は2つの観察に基づいて受け入れられません。（1）膜電位感受性色素DiSC3（5）で測定された4-アミノピリジン誘発膜電位脱分極は、エキナコシドの添加による影響を受けませんでした。 （2）エキナコシドは4-アミノピリジン誘発Ca2プラス非依存性グルタミン酸放出に影響を与えませんでした。これは膜電位のみに依存する放出の成分です[31]。 効果がシナプトソーム興奮性抑制によって引き起こされない場合、それは、Cav2.2（N型）およびCav2.1（P / Q型）Ca2プラスチャネルの活性の低下とグルタミン酸エキソサイトーシスの組み合わせによって現れる可能性があります。神経終末[34–36]。 フラ-2を使用することにより、エキナコシドが4-アミノピリジンによって引き起こされるCa2プラス濃度の増加を大幅に減少させることを示します。 さらに、私たちのデータは、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出に対するエキナコシドの阻害効果が、Cav2.2（N型）およびCav2の遮断薬への曝露後に42.4パーセント2.3パーセントから12.1パーセント3.9パーセントに減少したことを示しています.1（P / Qタイプ）Ca2プラスチャネル。 さらに、我々は、エキナコシドが、細胞内Ca2プラス放出阻害剤の存在下で、4-アミノピリジン誘発グルタミン酸放出を有意に阻害し続けることを観察した。 これらの結果は、Cav2.2（N型）とCav2.1（P / Q型）のCa2とチャネル活性の同時抑制が、エキナコシドを介したグルタミン酸放出阻害の根底にある潜在的なメカニズムであることを示しています。 ただし、Cav2.2（N型）とCav2.1（P / Q型）のCa2とチャネルの活動を組み合わせた活性化では、エキナコシドの作用を完全にブロックすることはできませんでした。 したがって、他の未確認のタイプのCa2プラスチャネルまたは他のシナプス前経路が阻害に関与している可能性があります。 たとえば、GABA A受容体はシナプス前レベルで存在し、それらの活性化はCa2に加えて流入とグルタミン酸の放出を阻害することが示されています[37]。 本研究では、GABAA受容体拮抗薬SR95531とビキュクリンはエキナコシドを介したグルタミン酸放出の阻害をブロックしなかった。これはGABAA受容体が電位依存性Ca2プラスチャネル活性の低下とそれに続くグルタミン酸放出の阻害に関与していないことを示唆している。電位依存性Ca2プラスチャネルを介したCa2プラス流入は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼC、プロテインキナーゼAなどの神経終末におけるグルタミン酸放出に関連するいくつかのプロテインキナーゼを活性化します。ここでは、プロテインキナーゼC阻害剤がエキナコシドに効率的に拮抗することを示しますグルタミン酸放出の媒介阻害; それにもかかわらず、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤PD98059またはプロテインキナーゼA阻害剤H89は効果がなかった。 さらに、4-アミノピリジンが誘導するプロテインキナーゼCのリン酸化は、グルタミン酸放出の阻害に有効な濃度のエキナコシドで前処理した後、シナプトソームで減少しました。 したがって、エキナコシドを介したグルタミン酸放出阻害のシグナル伝達経路には、プロテインキナーゼCが関与している可能性があります。プロテインキナーゼCは、シナプス前レベルに存在し、神経伝達物質のエキソサイトーシスに重要な役割を果たす重要な細胞内シグナル伝達システムです。 たとえば、ミリストイル化されたアラニンに富むCキナーゼ基質など、シナプス小胞の輸送または動員およびエキソサイトーシスに関与するいくつかのシナプスタンパク質は、プロテインキナーゼCによってリン酸化されます[38,39]。 このリン酸化プロセスは、脱分極によって刺激されるCa2プラスエントリーによって増加する可能性があり、これによりグルタミン酸の放出が促進されます[40]。 したがって、ここで観察されたCa2プラスエントリーに対するエキナコシドの阻害効果は、プロテインキナーゼC活性を低下させ、その結果、グルタミン酸放出を低下させる可能性があると合理的に推測できます。
