エキナコシドは、ROS産生の低下を介して、PC12細胞における6-ヒドロキシドーパミン誘発性ミトコンドリア機能障害および炎症反応から保護します
Mar 05, 2022
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Yue-Hua Wang、1,2 Zhao-Hong Xuan、3 Shuo Tian、1およびGuan-Hua Du1,2
パーキンソン病（PD）は、黒質でのドーパミン作動性（DA）ニューロンの進行性喪失を特徴とする神経変性疾患です。 ミトコンドリアの機能障害と炎症反応は、PDの細胞損傷のメカニズムに関与しています。 ドーパミン類似体である6-ヒドロキシドーパミン（6- OHDA）は、特にドーパミン作動性ニューロンに損傷を与えます。エキナコシド（ECH）は、の茎から単離されたフェニルエタノイド配糖体です。Cistanche サルサ、以前の研究でさまざまな神経保護効果を示しています。 本研究は、PC12細胞における6-OHDA誘発神経毒性および考えられるメカニズムに対するその効果を調査することでした。 結果は、6- OHDAが、未処理のPC12細胞と比較して、細胞生存率を低下させ、酸化還元活性を低下させ、ミトコンドリア膜電位を低下させ、ミトコンドリアを介したアポトーシスを誘導したことを示しました。 でも、エキナコシド治療は、6-OHDAによって誘発されたこれらの変化を大幅に弱めました。 加えて、エキナコシドまた、6-OHDAによって誘発される炎症反応を大幅に軽減する可能性があります。 さらなる研究はそれを示しましたエキナコシドPC12細胞における6-OHDA誘発性のROS産生を減少させる可能性があります。 これらの結果は、エキナコシド6- OHDA誘発性神経毒性に対しては、ROS産生を減少させることにより、ミトコンドリア機能障害と炎症反応を弱めることに関与している可能性があります。
1.はじめに
パーキンソン病（PD）黒質緻密部のドーパミンニューロンのゆっくりと進行する変性を特徴とする神経変性疾患です[1]。 PDの神経病理学的特徴は十分に説明されていますが、病因はまだ定義されていません。 特に、いくつかの観察結果は、ミトコンドリア機能障害がPDの病因とドーパミン作動性ニューロンの変性に関与していることを示唆しています[2、3]。 ミトコンドリアには多くの酸化還元酵素が含まれており、酸化的リン酸化の非効率性が自然に発生すると、活性酸素種（ROS）が生成されます[4]。 最近、人間と動物の研究からの証拠が増えていることから、神経炎症もPDのニューロン喪失の重要な原因であることが示唆されています[5]。
6-ヒドロキシドーパミン（6- OHDA）は、線条体内齧歯動物モデルおよび一部の細胞のドーパミン作動性ニューロンに特異的です[6–11]。 PC12細胞は、DA作動性ニューロンの多くの特性を備えているため、PD研究で人気のある細胞モデルになっています。 これは、PDの研究、および保護剤と治療剤の効果を決定するためのinvitroモデルとして使用されています。 エキナコシド（図1）は、Cistanche サルサ[12]、中国北西部に自生する寄生植物であり、6-OHDAによって誘発された損傷PC12細胞に対するエキナコシドのメカニズムの根底にある試みとして使用されています。
2。材料と方法
2.1。 材料。 エキナコシドは、National Institutes for Food and Drug Control（北京、中国）から入手しました。 RPMI-1640およびウシ胎児血清はGibcoから入手しました
（米国ニューヨーク州グランドアイランド）。 6- OHDA、MTT、2、7-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ヨウ化プロピジウム（PI）、およびレサズリンは、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 ATP生物発光アッセイキットはPromega（Madison、USA）から入手しました。 5,5,6、6 -テトラクロロ-1、1,3、3 -テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド（JC -1）アッセイキットは、Beyotime InstituteofBiotechnologyから入手しました。 （海門、江蘇省、中国）。 シトクロムCELISAキットおよび蛍光発生基質Ac-DVD-AMCは、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）から入手しました。 IL-1およびIL-6ELISAキットは、Boster Bio-engineer Limited Company（武漢、中国）から入手しました。 Spectramax M5マイクロプレートリーダーは、Molecular Devices社（米国カリフォルニア州サニーベール）から購入しました。
2.2。 細胞培養と治療。 PC12細胞は、10パーセントの馬血清と5パーセントのウシ胎児血清を添加したRPMI-1640で増殖させました。 条件は、5％のCO2を含む加湿雰囲気で37°Cに維持されました[19]。 細胞を2×105細胞/mLの密度で96-ウェルプレートにプレーティングしました。 80％のコンフルエンスの後、無血清RPMI-1640培地で細胞をさまざまな濃度のエキナコシドと1時間プレインキュベートしました。 次に、6-OHDAを最終濃度100Mでウェルに添加し、さらにインキュベートしました。処理後、顕微鏡下で形態変化を観察しました。 細胞生存率はMTTアッセイによって評価されました[19]。 簡単に説明すると、処理後、最終濃度0.5 mg / mLのMTTを各ウェルに添加し、37℃で4時間インキュベートしました。
2.3.PC12細胞の形態学的変化と生存率アッセイ。 処理後、形態学的変化を顕微鏡下で観察した。 細胞生存率はMTTアッセイによって評価されました[19]。 簡単に説明すると、処理後、最終濃度0。5 mg / mLのMTTを各ウェルに添加し、37℃で4時間インキュベートしました。 次に、上澄みを除去し、ホルマザン生成物をマイクロタイタープレートシェーカー上で15分間撹拌しながら100Lのジメチルスルホキシドに溶解し、SpectramaxM5マイクロプレートリーダーを使用して570nmで吸光度を読み取った。 証拠に基づく補完代替医療
2.4。 細胞内ATPレベルアッセイ。 細胞のATPレベルは、製造元の指示に従ってATP生物発光アッセイキットを使用して測定しました。 100 Lのルシフェリンとルシフェラーゼを添加した後、発光モードでマイクロプレートリーダーで発光をモニターしました[20]。
2.5。 レサズリンによるミトコンドリアの酸化還元活性の測定 処理後、最終濃度5 Mのレサズリンをウェルに添加し、530nmの励起と590nmの発光で蛍光強度を調べました[21]。
2.6。 JC-1によるミトコンドリア膜電位の測定。 ミトコンドリア膜電位は、JC-1アッセイキットを製造元の指示に従って使用して測定しました。 処理後、培地を除去し、暗所で37℃で15分間JC-1溶液をロードしました。 赤/緑比の蛍光強度は、490 nmの励起、530 nm（緑の蛍光モノマー）および590 nm（赤の蛍光凝集体）の発光でそれぞれ測定されました[22]。
2.7。 シトクロムC放出の定量化。 細胞質ゾルのシトクロムCレベルは、ELISAキットを製造元の指示に従って使用して測定しました[23]。 簡単に説明すると、処理後、細胞を溶解し、1000 gで15分間遠心分離した後、上清を細胞質画分として収集し、シトクロムC放出測定に使用しました。
2.8。 カスパーゼ-3活性の測定。 カスパーゼ-3活性は、変更を加えた参考文献[24]に従って実行されました。 簡単に説明すると、処理後、溶解バッファーを各ウェルに添加し、続いて12 000gで10分間遠心分離しました。 カスパーゼ-3活性は、励起波長380nmおよび発光波長460nmで蛍光発生基質Ac-DVD-AMCのタンパク質分解切断を測定することにより、得られた上清でテストされました。
2.9。 PC12細胞におけるフローサイトメトリーアッセイ。 処理後、細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄し、1000 r / minで5分間遠心分離し、70％エタノールで4℃で一晩固定しました。 細胞を遠心分離し、PBSで2回洗浄し、PBS（50 g / mL RNaseAを含む）に再懸濁し、最終濃度10 MのPIで暗所、室温で30分間染色し、フローサイトメーターで488で読み取りました。 nm励起[10]。
2.10。 ELISAアッセイによるIL-1およびIL-6レベルの測定。 培養したPC12細胞培地を処理後に収集し、IL-1およびIL-6濃度を、製造元のプロトコルに従って市販のELISAキットで測定しました。
2.11。 細胞内活性酸素種レベルの決定。 6- OHDAとのインキュベーション後、細胞に10M H2DCFH-DAを37°C、暗所で30分間ロードしました。 DCFの蛍光強度は励起で測定されました
マイクロプレートリーダーでの証拠に基づく補完代替医療の波長495nmおよび発光波長530nm[25]。
2.12。 統計分析。 すべてのデータは平均±SDとして表されます。 結果の統計分析は、一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続く-testによって実行されました。 統計的有意性は<>
3.結果
3.1。 6-OHDAによって損傷を受けたPC12細胞におけるエキナコシデオンの形態と細胞生存率の影響。 図2（A）に示すように、PC12細胞の生存率は、0。1〜10Mのエキナコシド処理の濃度で有意差はありませんでした。
24時間。 図2（B）に示すように、6- OHDAのみで処理してから24時間以内に、PC12細胞の大部分は膜のアポトーシスや細胞の収縮などの形態学的変化を起こしました。 エキナコシドとの同時処理は、細胞を6-OHDA損傷から保護しました。 MTTアッセイでは、PC12細胞を6- OHDAのみで処理すると、24時間以内に細胞の生存率が約25％低下するのに対し、{{1 0}}。1M、1 M、 10 Mエキナコシドは、6- OHDAを介した細胞毒性の低下を示しました（すべて<>
3.2。 PC12細胞において6-OHDAによって誘発されるミトコンドリア機能障害に対するエキナコシドの効果。 細胞のATPレベルは、1 0 0M 6- OHDAとの24時間のインキュベーション後に有意に減少しましたが、1マンド10Mのエキナコシドとの同時処理は6-OHDAを介したATPがPC12細胞の同化変化を減少させました。 結果は、1マンド10Mのエキナコシドとの同時治療が6-OHDAによって誘発されるミトコンドリアの酸化還元活性障害を有意に弱めることができることを示しました（<>
図3（c）に示すように、6-OHDAの10 0 Mで24時間処理すると、未処理グループと比較してミトコンドリア膜電位が大幅に低下しました（<{ {11}}。01）。="" ただし、6-="" ohdaによって誘発されるミトコンドリア膜電位の低下は、0.1="" m、1="" m、および10=""><>
3.3。 6-OHDA神経毒性に対するPC12細胞におけるエキナコシドの抗ミトコンドリア媒介アポトーシス。 結果は、6- OHDA曝露により、細胞質ゾルのシトクロムCが未処理群より167％増加したことを示しました（<0。{{1 0}}="" 1）。="" 0。1m、1="" m、および1="" 0="" mの用量のエキナコシドは、6-=""><><><0.01、resp>
カスパーゼ{{0}}活性は、6- OHDA曝露後の未処理グループと比較して約3倍増加しました（<0。0 1="" ）。="" 対照的に、1mおよび10="" mのエキナコシドとの同時処理は、6-=""><0.05および図4（両方） b））。piは膜透過性であり、一般的に生細胞から除外されます。="" そのため、一般的に集団内の死細胞を特定するために使用されます。="" 結果は、アポトーシス率が100="" m="" 6-=""><><>
3.4。 6-OHDAによって誘発されたPC12細胞におけるエキナコシドの抗炎症効果。 結果は、6- OHDA曝露が未処理グループと比較してイナニンクレアセインIL-1レベルをもたらしたことを示しました（<0。0 5;図4（a））。="" ただし、10=""><>
IL {{0}}レベルも、未治療群と比較して有意に増加しました（<0。0 1）。="" ただし、0.1、1、および10=""><>
3.5。 PC12細胞における6-OHDAによって誘発されるROS産生に対するECHの効果。 6- OHDAで処理された細胞は、未処理の細胞（<0。0 1）と比較して細胞内rosの有意な増加（約1。4-倍）を示しました。="" この増加は、0="" .1、1、および1=""><><><0.01、それぞれ;図6）>
4。議論
エキナコシドは、有名な伝統的な報告されているエキナコシドから抽出されたフェニルエタノイド配糖体の主成分の1つであり、神経変性疾患において抗アポトーシスおよび神経保護特性を持っています[18]。 インビボ研究は、エキナコシドが、MPTP誘発性ドーパミン作動性ニューロン損傷のマウスモデルにおいて神経保護効果および行動改善を有することを報告し、一方、さらなる調査は、エキナコシドが、MPPプラスにおけるカスパーゼ-3およびカスパーゼ-8活性化のダウンレギュレーションを誘発することを明らかにした。小脳顆粒ニューロンの誘導アポトーシス[16]。 別のinvivo研究では、6-OHDAによって損傷した線条体ドーパミン作動性ニューロンに対するエキナコシドの神経保護効果が報告されています[17]。 ただし、これらのアクションの根底にある細胞および分子のメカニズムは、特にミトコンドリア機能と炎症反応への影響については完全には理解されていません。 そこで、私たちの現在の研究では、ミトコンドリア機能と炎症反応に対するエキナコシドの効果を調査し、PDに対するそのメカニズムを解明しました。 結果は、エキナコシドがミトコンドリア機能と抗炎症を保護することにより、PC12細胞における6-OHDA誘発性神経毒性を有意に軽減することを最初に示しました。
ミトコンドリア機能障害は、パーキンソン病とその実験モデルにおける黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの死に長い間関係してきました[26]。 ミトコンドリアは、神経変性疾患の呼吸鎖の電子伝達系を介した活性酸素種（ROS）の生成に深く関与しています[27]。 多種多様なROSは、生物学的システムにおける通常の代謝の過程で生成されますが、それらの蓄積は
必要な量は、脂質、タンパク質、および核酸に損傷を与える可能性があります。
6-カテコールアミン類似体であるOHDAは、黒質ニューロンの特定の変性を引き起こします。 6- OHDAによって誘発される神経毒性は、部分的にはROSの生成によるものです[28–32]。
OHDAは、ATP産生の減少、ROS代謝の障害、アポトーシスの誘導など、ミトコンドリア機能に影響を与えることで神経細胞死を引き起こします[10、33、34]。 本研究では、6- OHDAがミトコンドリアの酸化還元機能を損傷し、ミトコンドリア膜電位を低下させ、ミトコンドリアを介したアポトーシスを誘導し、PC12細胞のROS産生を増加させることも示しました。
レサズリンは、分子状酸素とチトクロームオキシダーゼの最終的な還元の中間にある蛍光インジケーターです。 したがって、レサズリンの酸化還元電位により、呼吸鎖がほぼ完成するまで機能することが可能になり、ミトコンドリア機能のより正確で感度の高い指標が提供されます。 JC -1は、ミトコンドリア内膜に局在する膜電位感受性プローブであり、ミトコンドリア膜電位に基づいてモノマー（緑）または凝集体（赤）のいずれかを形成します。 したがって、レサズリンとJC -1は、ミトコンドリア機能を調べるための貴重な分析ツールです[35]。 本研究は、ミトコンドリアの酸化還元活性とミトコンドリア膜電位の低下が、6-OHDA誘発性ドーパミン作動性神経毒性において重要な役割を果たす可能性があることを示した。 我々の結果はまた、ミトコンドリアの酸化還元活性とミトコンドリア膜電位を示した。 これらの結果は、ミトコンドリア機能障害の改善が、PDに一般的に関連する進行性ドーパミン作動性神経変性を遅らせるためのより良い方法である可能性があることを示しています。
6- OHDAによって誘導される細胞アポトーシスは、シトクロムCの放出とカスパーゼ-3の活性化を特徴とするミトコンドリア機能障害によって媒介されることが一般的に認められています[36]。 アポトーシス刺激は、ミトコンドリアからサイトゾルへのシトクロムCの放出を引き起こし、そこでカスパーゼ-3およびその他の下流のカスパーゼを活性化します。 本研究では、結果は、100Mの6-OHDAに曝露されたPC12細胞がシトクロムCの放出を増強し、カスパーゼがシトクロムCの放出とカスパーゼ- 3の活性化を依存的に阻害することを示しました。 これらの結果は、エキナコシドがミトコンドリアからサイトゾルおよびカスパーゼ-3の活性化へのシトクロムCの放出を減少させることにより、ミトコンドリアを介したアポトーシスを阻害する可能性があることを示唆しています。
炎症はパーキンソン症候群の脳の神経病理学的特徴であり、この病気の実験モデルでもあります。 炎症を軽減し、この炎症性因子の産生を阻害することを目的とした治療戦略は、パーキンソン病および関連する状態の治療のための有望な神経保護戦略である可能性があります[37]。 脳脊髄液およびパーキンソン症候群患者の死後分析中にも実施されたいくつかの研究により、インターロイキン-1（IL -1）やインターロイキン-6（IL {{4}）などのサイトカインレベルの上昇が明らかになりました。 }）、炎症誘発性反応の活性化を示唆している[38、39]。 本研究では、結果は、PC12細胞における100Mof6-OHDA誘導IL-1およびIL-6放出への曝露を示しました。 ただし、エキナコシドによる治療は、6-OHDAによって誘発されるIL-1およびIL-6の放出を用量依存的に阻害する可能性があります。 結果は、炎症反応の減少が、6-OHDA誘発性神経毒性に対するエキナコシドのメカニズムにも関与していることを示唆しています。
結論として、この研究の結果は、エキナコシドがPC12細胞における6- OHDA誘発神経毒性をブロックすることができ、そのメカニズムがROS産生の減少を介してミトコンドリア保護と抗炎症に関連している可能性があることを示しました。 この研究によって提供された情報は、抗PDのためのエキナコシドのメカニズムを解明するのに役立ちます。 エキナコシドは、PDの予防と治療のための有望な治療選択肢である可能性があると結論付けられています。
利害の対立
著者は、利益の衝突はないと宣言しました
謝辞
この作品は、中国国家自然科学基金（81473383）および国家科学技術主要プロジェクト（2012ZX 09103101-078; 2013ZX 09103-001-008;および2013ZX09102106）からの助成金によってサポートされていました。
