パート1：ラットにおけるアルツハイマー病と組み合わせた骨粗鬆症の同時実験モデルの確立およびCistancheTubulosaからのエキナコシドとアクテオシドの二重効果
Mar 24, 2022
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp：008618081934791
Yi Chen、Ying-Qi Li、Jia-Yi Fang、Ping Li、Fei Li
概要
民族薬理学的関連性： カンカニクジュヨウ骨粗鬆症の治療に広く使用されている貴重な伝統的な漢方薬であり、アルツハイマー病. エキナコシドとアクテオシドは、研究価値のある薬理活性を持つカンカニクジュヨウの主要な有効成分です。 エキナコシドとアクテオシド学習能力と記憶能力を改善し、骨芽細胞の増殖と分化を促進する可能性があります。 研究の目的：エキナコシドとアクテオシドカンカニクジュヨウ抗骨粗鬆症と抗アルツハイマー病の有意な活性を示していますが、これらの効果はラットモデルで同時に研究されていません。 この研究の目的は、骨粗鬆症のモデルを確立し、検証することでした。アルツハイマー病ラットでそしての二重効果を調査するためにエキナコシドこの並行モデルのアクテオシド。
材料および方法：卵巣摘出術（OVX）、D-ガラクトースとAlCl3による偽手術（D）、D-ガラクトースとAlCl3による卵巣摘出術（OVXとD）の3つのモデルグループを同時に設定しました。 薬物治療群のラットは卵巣切除された。 薬物治療群のラットにD-ガラクトースの腹腔内注射とAlCl3の胃内投与を行いながら、ラットに経口投与した。エキナコシド（90 mg / kg / d）、アクテオシド（9 0 mg / kg / d）、およびエストラジオール吉草酸（0 .6 mg / kg / d）、ドネペジルHCl（0.8 mg / kg / d）の陽性対照薬。 8週間の薬物治療の後、6日間のモリス水迷路（MWM）テストが最初に実行されました。 次に、ラットを犠牲にして、血液、子宮、大腿骨、脛骨、および脳組織を採取した。 血清は生化学的試験に使用された。 子宮は組織形態計測に使用されました。 右の大腿骨はマイクロに使用されました-CTそれぞれ、組織形態計測。 右脛骨は生体力学的試験に使用されました。 アイスボックスに集められた海馬は、生化学的試験に使用されました。 灌流によって収集された脳４１は、組織形態計測に使用された。
結果：シャムグループと比較して、OVXプラスDグループは、酸化的損傷を引き起こし、海馬のニューロンを障害し、アセチルコリンの加水分解と合成に影響を与えることにより、学習能力と記憶能力を大幅に低下させる可能性があります。 一方、OVX plus DグループのBALPとTRAPの活動は大幅に増加しました（P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">エキナコシドとアクテオシド、骨粗鬆症の典型的な病理学的特徴およびアルツハイマー病改善されました。
結論：骨粗鬆症のモデルとアルツハイマー病ラットでは実行可能であり、成功裏に確立されました。エキナコシドアクテオシドもこの並行モデルにいくつかの重要な影響を示し、それらはカンカニクジュヨウさらなる研究のための二重効果を伴う。
キーワード：骨粗鬆症; アルツハイマー病; 二重効果; エキナコシド; アクテオシド; カンカニクジュヨウ
Cistanche失われた帝国のハーブはアルツハイマー病を改善します
1.はじめに
骨粗鬆症は、骨量の進行性の喪失とマイクロアーキテクチャの破壊を特徴とする変性骨疾患であり、脆弱性骨折のリスクを高める可能性があります（Rachner et al。、2011）。アルツハイマー病（AD）は、継続的な精神的退化、認知障害、および臨床における自立生活能力の喪失を特徴とする、高齢者によく見られる神経変性疾患です（Reitz 76 et al。、2011）。 アミロイド沈着によって誘発される老人斑の形成、タウの過剰リン酸化によって引き起こされる神経原線維変化、および脳の神経変性は、ADの典型的な病理学的特徴である（Serrano-Pozo et al。、2011）。 表面的には、OPとADは完全に独立した疾患であり、病理学と臨床的特徴が異なります。 ただし、OPとADは、臨床診療で同時に発生することがよく観察されます（Zhang et al。、2001; Lui et al。、2003; Luckhaus et al。、2009）。 両方の疾患の有病率は、特に閉経後の女性において、年齢とともに増加しました（Li et al。、2017; Stern、2012）。 ますます多くの証拠が、ADと診断された人々はOPのリスクが高いことを示しています（Zhou et al。、2014）。
骨粗鬆症との関係を研究し、明らかにする必要がありますアルツハイマー病invitroおよびinvivo。 研究をinvivoで実施する前に、骨粗鬆症またはアルツハイマー病の適切な動物モデルを選択することが重要です。 骨粗鬆症モデルは、レチノイン酸の胃内投与、卵巣摘出手術、糖質コルチコイドの筋肉内注射など、いくつかの種類の方法で確立できます（Wei et al。、2007; Komori、2015）。 特に、ラットの卵巣摘出術によって誘発された閉経後骨粗鬆症モデルは古典的であり、ほとんどの研究で広く使用されています（Miao et al。、2012; Liu et al。、2017）。散発性アルツハイマー病は、アルツハイマー病の主なタイプです。 動物散発的なモデルアルツハイマー病次のようなさまざまな方法で誘発される可能性がありますD-ガラクトースの注射または -アミロイド、AlClの胃内投与3,等々（Bagheri et al。、2011; Gao et al。、2015; Justin Thenmozhi et al。、2017）。 加えて長期腹腔内注射によって誘発されるアルツハイマー病の結合モデル卵巣摘出術と組み合わせたD-ガラクトースの注射も多く研究されています（Liuet al。、2010; Zhao et al。、2012）。 骨粗鬆症の関連性を明らかにするためにアルツハイマー病、骨粗鬆症を組み合わせたモデルを確立する必要がありますアルツハイマー病と一緒に薬の一般的なメカニズムを研究する骨粗鬆症とアルツハイマー病ase.
カンカニクジュヨウ（シェンク）ワイトは寄生植物で、主に中国北西部の砂漠に分布しています。 の乾燥した多肉植物の茎カンカニクジュヨウ（CT）は、中国薬局方（2015）で、中国名がRoucongrongであるCistanchesHerbaと呼ばれる有名な強壮剤として使用されています。 「砂漠の高麗人参」として名誉を与えられており、伝統的な漢方薬の腰や膝の痛み、女性の不妊、便秘の治療に広く使用されています（Jiang and Tu、2009）。 CTの主な有効成分は、フェニルエタノイド配糖体（PhG）、エキナコシド（ECH）、およびアクテオシド（ACT）はPhGの代表的な化合物です（Morikawa et al。、2014）。 特に、ECHとACTは、その含有量が高く、神経保護、骨保護の効果などのさまざまな薬理学的活性があるため、通常、CTの品質管理のマーカーとして選択されます。
抗酸化物質、アンチエイジング、学習能力と記憶力の向上（Wang et al。、2012; Li et al。、2016）。 ただし、骨粗鬆症に対するECHおよびACTの影響と組み合わせアルツハイマー病ラットモデルでまだ一緒に研究されていませんでした。したがって、この研究の目的は、骨粗鬆症のラットモデルを組み合わせて確立することでした。アルツハイマー病と一緒にエキナコシドとこれに関するアクテオシド同時モデル、さらなる研究のための実験的証拠を提供するために以下の研究におけるエキナコシドまたはアクテオシドの分子メカニズム。
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2。材料と方法
2.1。 動物
体重180〜200 gの80匹の8-週齢の雌ウィスターラット（証明書番号：SCXK 2018-0006）を、中英SIPPR/BKラボから入手しました。 Animal Ltd（上海、中国）であり、中国薬科大学の製薬動物実験センターで育ちました。
2.2。 化学薬品および試薬
抱水クロラール、ペニシリンGナトリウム、D-ガラクトース、塩化アルミニウム六水和物、吉草酸エストラジオール、ドネペジルHClは、Aladdin Industrial Corporation（上海、中国）から購入しました。エキナコシド（HPLC 94％）は、Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co.、Ltd.（Chengdu、China）から入手しました。アクテオシド（HPLC 98％）は、Baoji Herbest Bio-Tech Co.、Ltd.（Baoji、China）から購入しました。 骨特異的アルカリホスファターゼ（BALP）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、マロンアルデヒド（MDA）、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットはShanghai Enzyme-linked Biotechnology Co.、Ltd.（上海、中国）から購入。 ユニバーサル組織固定剤はから得られましたChengdu Wecistanche Bio-Technology Co.、Ltd.（成都、中国）。
エキナコシド
2.3。 動物モデルと治療
すべての動物実験は、中国薬科大学の動物倫理委員会によって承認および監督されました。 ラットは、温度管理された部屋（22±2度）で12時間の明/暗サイクルで維持され、標準的なペレット飼料と水道水が与えられました。
1週間の適応後、卵巣摘出手術を実施することにより骨粗鬆症モデルが達成されました（French et al。、2008）。 手術終了後、感染を防ぐためにペニシリンGナトリウムを創傷縫合糸に1回振りかけた。 その後、ラットに通常の3週間の給餌を行いました。 参考文献（Hua et al。、2007; Alawdi et al。、2017）によると、アルツハイマー病卵巣摘出術またはAlCl3の長期胃内投与と組み合わせたD-ガラクトースの長期腹腔内注射によって誘発される可能性があります。 アルツハイマー病と組み合わせた骨粗鬆症のモデルの実現可能性を研究するために、卵巣切除の3つのモデルグループ（OVXグループ）、150 mg / kg / dD-ガラクトースの腹腔内注射および30mg/ kg /dAlCl3の胃内投与による偽手術（Dグループ）、150mg / kg /dのD-ガラクトースの腹腔内注射および30mg/kg / dのAlCl3の胃内投与による卵巣切除（OVXプラスDグループ）がこの研究で設定された。
したがって、ラットは3週間後にランダムに8つのグループ（各グループでn {{0}}）に分けられ、8週間にわたって薬で経口治療されました。 OVXグループ; Dグループ; OVXプラスDグループ; エストラジオール吉草酸治療群（EV群、OVXプラスDプラス0。6 mg / kg / dエストラジオール吉草酸）; ドネペジルHCl治療群（DPZ群、OVX + D + 0.8 mg / kg / dドネペジルHCl）;エキナコシド治療群（ECH群、OVX + D + 90 mg / kg / dエキナコシド）;アクテオシド治療群（ACT群、OVXプラスDプラス90mg / kg / dアクテオシド）。 ヒト-ラット等価線量変換原理および関連する参考文献からの用量（Li et al。、2013; Gao et al。、2014）に従って、この研究の薬物治療群の用量が採用されました。
各ラットの体重を毎週測定した。 8週間続く薬剤による全治療の後、6日間のモリス水迷路（MWM）テストが最初に実行されました。 その後、各グループから6匹のラットを犠牲にして材料を収穫した。 ラットを3.0mL / kg 10％抱水クロラールの腹腔内注射で麻酔し、大動脈腹部から血液を採取しました。 血液を室温に置いて凝固させ、3500r/minで10分間遠心分離した。 血清を1.5mLの遠心分離管（NEST Biotechnology）に回収し、生化学的試験に使用するまで-80度で保存しました。 次に、子宮、大腿骨、脛骨、および脳組織を収集しました。 子宮は組織形態計測に使用されました。 右の大腿骨は、それぞれマイクロCTと組織形態計測に使用されました。 右脛骨は生体力学的試験に使用されました。 アイスボックスに集められた海馬は、生化学的試験に使用されました。 その後、各グループの他の3匹のラットを生理食塩水とユニバーサル組織固定液で心臓から灌流し、組織形態計測のために脳を採取しました。
2.4。 モリス水迷路（MWM）テスト
ラットは、8週間の介入後、MWMテストで空間参照学習と記憶テストを受けました。 MWMテストは、以前に報告された方法（Morris、1984; Gao et al。、2016）に従って実行されました。 簡単に言えば、1日4回の試行で5日間連続して、ラットはプールの壁にあるさまざまな視覚的手がかりを使用して、円形のプール（直径130 cm、高さ50cm）無毒のカーボンインクで着色された水で満たされています。 プールは想像上4つの象限に分割され、4つの開始位置が象限の交点に配置されました。 プラットフォームは、象限の1つの中央に配置され、試行中、位置は一定でした。 各試験において、ラットはプールの壁に面して、選択された場所にランダムに配置されました。 ラットがプラットフォームに到達したとき、または60秒後に各試行を終了し、経過時間を逃避潜時として記録しました。 プラットフォームに到達できなかったラットは、プラットフォームに誘導されました。 それぞれの隠されたプラットフォームの試行の後、ラットは10秒間プラットフォームに留まりました。 トレーニング結果として、1日4回の試行の平均待ち時間を計算しました。 6日目に、すべてのラットをプローブ試験にかけ、プラットフォームのないプールで60秒間泳いだ。 最終結果として、プラットフォームの位置での交差時間とターゲット象限での移動時間を記録しました。 プールの真上にある天井に取り付けられたカメラでラットを監視し、すべての試験を記録し、北京中石市科学技術開発株式会社（中国、北京）が提供するMORRISMAZEプログラムを使用して分析しました。
2.5。 ELISAによる生化学的試験
ELISAキットの製造元の指示に従って、骨特異的アルカリホスファターゼ（BALP）活性、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性、および血清中のマロンジアルデヒド（MDA）含有量をBioTekSynergyによってテストしました。 2マルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek、USA）。 各グループの海馬組織をPBS（0。01 M、pH 7.4）で洗浄して、組織表面に残っている血液や不純物を除去しました。 片側の海馬組織の重さを量り、次に可能な限り小さく切り刻んだ。 海馬組織を1：9（組織重量：PBS容量）の比率に従ってホモジナイズした。 ホモジネートを4度、3000r/minで15分間遠心分離した。 上清を回収して希釈し、BCA法によりタンパク質濃度を測定しました。 次に、海馬組織のアセチルコリンエステラーゼ（AChE）活性、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）活性、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性、およびマロンジアルデヒド（MDA）含有量をELISA法で試験しました。
2.6。 海馬の組織形態計測
脳組織（n =3 /グループ）は、ユニバーサル組織固定液で固定されました。 次に、脳組織サンプルを洗浄し、勾配エタノールで脱水し、パラフィンワックスで包埋し、5μmの冠状切片にスライスしました。 切片をヘマトキシリンおよびエオシン（HE）で染色した。 その後、脳組織の冠状切片を倒立蛍光顕微鏡（ニコン、日本）で撮影した。 海馬におけるCA1、CA2、CA3、およびDGの形態学的変化が特に観察された。
2.7。 子宮の組織形態計測と形態計測
選択した子宮（n {{0}} /グループ）は、ユニバーサル組織固定液で固定されました。 次に、子宮組織サンプルを洗浄し、勾配エタノールで脱水し、パラフィンワックスで包埋し、5μmの横断面にスライスしました。 切片をヘマトキシリンおよびエオシン（HE）で染色した。 子宮の横断面を観察し、写真を撮った。 5つの視野をランダムに選択し、Image-ProPlus6.0ソフトウェアを使用して子宮横断面の直径と子宮粘膜上皮の厚さを測定しました。 固有層の子宮腺の数も数えた。
2.8。 マイクロCT
選択した右大腿骨（n =3 /グループ）は、SkyScan 1176 micro X-を使用して、物体から光源までの距離が121 mm、カメラから光源までの距離が171mmの位置でスキャンされました。光線コンピュータ断層撮影（マイクロ-CT）スキャナー（ブルカー、ドイツ）。 遠位成長板が参照面として選択された。 基準面から1mmの距離で、1.8 mmの厚さの領域が対象のボリュームとして選択されました（VOI、100層）。 得られたグレースケール画像のピクセルサイズは、骨の再構成から17.76μm（65 kV、385μA）でした。 皮質骨から骨梁を選択するために、半自動輪郭法が採用されました。 直接3D測定法を使用して、骨体積のパーセント（BV / TV）、骨表面密度（BS / TV）、骨梁分離（Tb。Sp）、骨梁数（Tb。N）、骨梁の厚さ（Tb。Th）を評価しました。 、構造モデルインデックス（SMI）、小柱パターン係数（Tb。Pd）、および同じVOIの平均骨ミネラル密度（平均BMD）を使用してCTアナライザープログラム（ドイツ、ブルカー）。 アダプティブレンダリングアルゴリズムを使用したVOIの3D視覚化は、CTvolソフトウェア（Bruker、ドイツ）を使用して行われました。
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2.9。 骨組織形態計測
選択した右大腿骨（n =3 /グループ）をユニバーサル組織固定液で固定し、10％EDTA-2Naの溶液で3週間脱灰しました。 脱灰したサンプルを洗浄し、勾配エタノールで脱水し、パラフィンワックスを包埋し、5μmの縦断面にスライスしました。 切片をヘマトキシリンおよびエオシン（HE）で染色した。 大腿骨の縦断面を撮影した。 各群の骨組織構造、特に骨梁構造が観察された。
2.10。 生体力学的試験
ランダムに選択された右脛骨（n =4 /グループ）は、万能試験機（島津製作所、日本）を使用した3点曲げ試験で評価されました。 これらのサンプルの直径は、ノギスによって2。16-2 .38 mm（d）の範囲で測定されました。 次に、サンプルを2つのレールの間に25 mm（L）の距離を置いて、2つの支持クロスバーに配置し、標本の生理学的曲率を上向きにしました。 荷重のローディングロッドは試験片の中央に配置され、試験片が破損するまで1.5 mm/minの一定速度で落下しました。 力（F）と変位のデータは、試験機に接続されたコンピューターに自動的に記録され、荷重-変形曲線が同時にプロットされました。 最大荷重（N）とエネルギー吸収（mJ）の値は、材料試験ソフトウェアTRAPEZIUMXによって同時に記録されました。 最大応力（MPa）の値は、次の式に従って計算されました。応力（σ）=曲げモーメント（M）/断面係数（Z）=（8×L×F）/（ π×d3）
2.11。 統計分析
モデルグループの結果をShamグループと比較し、薬物治療グループの結果をOVXplusDグループと比較しました。 一元配置分散分析を使用してデータを分析した後、Graph PadPrism5。0ソフトウェアを使用してボンフェローニの多重比較検定を行いました。 データは平均±SDとして表され、0。05未満のP値は統計的に有意であると見なされました。
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