パート1：骨粗鬆症とアルツハイマー病の両方を治療するためのカンカニクジュヨウの二重効果成分を調査するための統合ネットワーク薬理学とゼブラフィッシュモデル
Mar 30, 2022
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Ying-Qi Li 1、Yi Chen 1、Jia-Yi Fang 1、Si-Qi Jiang 1、Ping Li 1、*およびFei Li 1、2、*
概要
民族薬理学的関連性：骨粗鬆症（OP）とアルツハイマー病（AD）は一般的な老人性併発疾患であり、多くの研究がそれらの病因の関連を示しています。 Cistanche tubeulosa（Schenk）Wight（CT）は、広く使用されている伝統的な漢方薬であり、それぞれOPとADの治療に広く適用されています。 ただし、同時に発生する疾患と根本的なメカニズムの両方の有効成分は限られています。
研究の目的：この作業は、ADとOPを同時に保護できるCTの二重効果化合物を見つけるための効果的で信頼性の高いネットワークスクリーニング方法を確立することを目的としています。 そしてそれは分子メカニズムに関するOPとADの間のリンクの新しい視点を提供します。
材料と方法：CTの二重の効果は、複数のデータベースとネットワーク薬理学レベルでの広範な分析を統合することによって体系的に分析されました。 分類された薬物-標的相互作用ネットワークは、異なるタイプの化合物間の効果の違いを明らかにするために構築されました。 このネットワークの有効性を証明するために、トポロジーパラメータに従ってゼブラフィッシュの事前誘導OPモデルおよびAlCl3-誘導ADモデルで検証するためにいくつかの化合物が選択されました。
キーワード：ネットワーク薬理学; 骨粗鬆症;アルツハイマー病; カンカニクジュヨウ; ゼブラフィッシュ。
Cistancheには抗アルツハイマー機能があります。
1.はじめに
人口の高齢化傾向は、長年にわたって骨粗鬆症（OP）およびアルツハイマー病（AD）の有病率の増加をもたらします（Parnetti et al。、2019; Rizzoli、2018）。 今日、OPとADはどちらも、症状なしに進行し、大きな社会的負担をもたらす可能性があるため、公衆衛生に対する主要な脅威として認識されています（Erkkinen et al。、2018; Jonsson et al。、2018）。 加齢性疾患として、それらは臨床診療において高い障害と死亡率で同時発生することがよく見られます（Dengler-Crish and Elefteriou、2019）。 OPは全身性の骨格疾患であり、骨量が少なく、骨組織の微細構造が損なわれ、骨の脆弱性が高まり、骨折のリスクが高くなります（Rizzoli、2018年）。 ADは、記憶および他の認知機能の進行性の喪失を特徴とする最も一般的な脳変性です（Bondi et al。、2017）。 今まで、それらの複雑な病因と病因の2つの病気を予防または治療するための十分に強力なオプションはまだありません。 さらに悪いことに、患者は副作用を起こすことが多いということです（Brown、2017; Huang and Mucke、2012）。
症候群の分化の理論的根拠（Sucher、2013）に基づいて、複数の病態生理学的メカニズムを標的とする複数の成分を含む伝統的な漢方薬（TCM）は、いくつかのよく知られた複雑な疾患の治療において独自の優位性を持っています。 腎臓の強壮剤として、Cistanche tubeulosa（Schenk）Wight（CT）は、伝統的な中国の医師による記憶喪失と骨の萎縮性衰弱に対して広く使用されています（Fu et al。、2018）。 その伝統的な有効性に加えて、かなりの研究により、認知および行動の欠陥の改善（Wu et al。、2014）、抗炎症（Fu et al。、2018）、骨形成の促進、骨の抑制など、さまざまな薬理学的活性があることが示されました吸収（Li et al。、2013; Li et al。、2012）、および抗酸化活性（Zhang et al。、2016）。 しかし、その有効成分と代謝プロセスの複雑さは、ヒト組織内の標的の探索と作用機序の説明の両方で困難を引き起こしました。
とりわけ、OP/ADの治療標的についての信頼できる議論が必要です。 特に、TCMにおける「異なる疾患に対する同じ治療」の考え方、およびネットワーク内薬理学における「多成分治療、生物学的ネットワーク」の方法論に基づいて、両方の疾患間で重要な共通のターゲットを検索する試みは、特に実用的である可能性がありますOPとADの予防と管理のためのガイダンスを提供することを意味します。 ゼブラフィッシュは、哺乳類との骨格生理学およびヒトとの相同性の高い遺伝子に強い類似性を持っています。 これは、OPおよびADの研究に利用できる魅力的な動物モデルです（Bergen et al。、2019; Newman et al。、2014）。 したがって、このネットワーク薬理学研究は、CTの二重効果有効成分をスクリーニングし、OPとADの共通の潜在的標的を調査し、CTを使用して2つの疾患を同時に治療する可能性を明らかにすることを目的としていました。 本研究では、CT有効成分のターゲット情報、ゲノム、OPとADのプロテオミクス情報をそれぞれ異なるデータベースから収集してインタラクティブネットワークを確立し、濃縮分析を構築して、OPとADを治療するためのCTの相乗的メカニズムを発見しました。 。 さらに、OPゼブラフィッシュモデルとADゼブラフィッシュモデルをそれぞれ誘導し、ネットワーク内の主要な化合物をキャプチャして、2つの疾患の有効性とターゲットを検証しました。
Cistancheはスクレロチンの成長を促進します。
2。材料と方法
2.1試薬
ゲニステイン（GE）、ケルセチン（QU）、アビエチン酸（AA）、β-シトステロール（BSS）（純度98％以上）の化学標準は、Chroma Biotechnology Co.、Ltd.（Chengdu、China）から購入しました。 培養プレートは、Wuxi NEST Biotechnology Co.、Ltd.（Wuxi、China）から入手しました。 プレドニゾロン（Pre）、エチドロン酸二ナトリウム（Ed）、ドネペジルHCL（DPZ）、AlCl3・6H2OはAladdin Reagent Inc.から購入しました。ゼブラフィッシュアルカリホスファターゼ（ALP）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットは、Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co.、Ltd.（Shanghai、China）から提供されました。 TrizolはNanjingKeyGenBiotechから入手しました。 Co.、Ltd.（中国、南京）。 Transtar Top GreenqPCRSuperMixはTransGenBiotechから購入しました。 Co.、Ltd.（北京、中国）。
cistanche抽出物
2.2動物
成体のゼブラフィッシュ（AB系統、生後4か月）は、淡水交換を備えた水族館で14/10時間の明暗サイクルの下で28度に維持されました。 それらは、新たに孵化したブラインシュリンプの餌で1日2回飼育されました（Chen et al。、2018）。 通常、受精した胚を選択し、光成長インキュベーターで受精後3日（dpf）まで培養しました。 すべての動物実験は、動物実験に関する機関および政府のガイドラインに従った。
2.3ネットワーク薬理学的プロセス
2.3.1化学空間の計算と候補化合物のスクリーニング
CTのすべての化学成分データは、漢方薬システム薬理学データベースおよび分析プラットフォームから収集されました。 TCMSPは、中国の漢方薬のシステム薬理学プラットフォームであり、薬物、標的、および疾患の間の関係をキャプチャします（Ru et al。、2 0 14）。 一方、TCMSPの4つの重要な薬理学関連パラメーターは、分子量（MW）、オクタノールと水の分配係数（AlogP）、水素ドナー数（Hdon）、水素アクセプター数（Hdon）を含む主成分分析（PCA）のために取得されました。 Hacc）。 CTの化学分布は、SIMCAソフトウェア（バージョン14.1、Umetrics）を使用して上記のパラメーターで作成されました。 そして、DrugBankからAD/OPのために承認された小分子薬は同じコースで処理されました。 CTからの成分は、ドラッグライクネス（DL）によってフィルタリングされました。 DLは、将来の化合物がどの程度「薬物に似ている」かを推定するためにドラッグデザインで使用される定性的概念です。 この重要な特性は、伝統的な漢方薬の「薬物のような」化合物の選択基準として使用され、薬物動態と医薬品特性を最適化するのに役立ちます（Tao et al。、2 0 13）。 文献およびTCMSPの提案に基づいて、フィルター条件として0。18以上のDLを選択しました。 条件に適合する成分は、その後の分析のために輸出されました。 それらの2-次元（2D）および3D構造は、ChemDrawProfessional16.0ソフトウェアによってペイントされました。 また、3D構造は、Chem3D16.0のエネルギーを最小化する機能によって最適化されました。
2.3.2OPおよびAD関連ターゲットコレクション
OPとADのすべての遺伝子関連は、DisGeNETとGeneCardsから個別に収集されました。 DisGeNETデータベースは、人間の病気に関連する遺伝子と変異体の公開されている最大の発見プラットフォームの1つです（Pinero et al。、2017）。 GeneCardsは、ゲノム、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、遺伝、臨床、および機能情報を含むヒト遺伝子の統合データベースです（Safran et al。、2010）。
2.3.3複合ターゲットの収集と逆ドッキング予測
GeneCardsデータベースとSwissTargetPredictionデータベースを組み合わせて、CTの有効成分の関連するターゲットを予測しました。 GeneCardsは、化合物の既知のアクティブなターゲットを示しますが、Swiss TargetPredictionデータベースは、小分子の最も可能性の高い高分子ターゲットを推定できます（Daina et al。、2019）。 予測の前に、候補分子の構造は、Open Babel（バージョン2.4.1）を使用してmol2形式からSMILES形式に変換されました。
2.3.4タンパク質間相互作用分析
STRINGデータベースは、CT-OP-AD共有ターゲットのグループ間の相互作用を発見するために適用されました。 「ホモサピエンス」のパターンで検索した後、タンパク質間相互作用（PPI）ネットワークをCytoscape（バージョン3.7.2）ソフトウェアで視覚化しました。 STRINGは、既知および予測されたPPIのデータベースであり、ゲノムコンテキスト予測、ハイスループットラボ実験、（保存された）共発現、自動テキストマイニング、およびデータベースの以前の知識から導き出されます（Szklarczyk et al。、2017）。
Cistancheはアルツハイマー病に効果があります。
2.3.5GOおよびKEGGパスウェイエンリッチメント分析
遺伝子オントロジー（GO）濃縮分析は、Funrichソフトウェアで実行されました。 FunRich（バージョン3.1.3）は、主に遺伝子とタンパク質の濃縮分析に使用される機能的なソフトウェアです（Pathan et al。、2 0 15）。 ConsensusPathDB-ヒトデータベースを使用して、経路濃縮分析を実施しました。 得られた遺伝子リストは、「p値カットオフ」を0.01に設定してデータベースに提出した。 結果を得た後、OPおよび/またはADに関連するこれらの経路のみが選択され、KEGG機能カテゴリに従ってグループに分けられました。 CPDBは、バイナリおよび複雑なタンパク質-タンパク質、遺伝子、代謝、シグナル伝達、遺伝子調節、および薬物-標的相互作用、ならびにホモサピエンスの生化学的経路を含むシームレスな相互作用ネットワークです（Kamburov et al。、2013）。
2.4OPゼブラフィッシュモデルの実験手順
2.4.1モデルのグループ化
ゼブラフィッシュの幼虫はいくつかのグループに分けられました：コントロールグループ、モデルグループ、モデルとEdグループ、モデルと化合物グループ。それぞれに30の幼虫が含まれていました。 対照群は、0.2パーセントのDMSOを含む培地で維持された。 モデルグループは、3dpfから8dpfまでのPre（25 µM）で処理されました。 モデルとEdグループは、PreとEd（30 µg / mL）で同時処理されました。
2.4.2アリザリンレッド染色
異なる化合物で5日間培養した後、幼虫を麻酔し、固定し、漂白しました。 ゼブラフィッシュの頭の骨を染色するためにアリザリンレッドが使用されました。 1パーセントのKOHとグリセロール（3：1、1：1、1：3の比率）をそれぞれ適用して、余分なものを取り除きました。 最後に、実体顕微鏡（Olympus SZX16）を使用して、腹臥位でゼブラフィッシュの染色画像をキャプチャしました。 染色面積と積分光学密度（IOD）は、Image-ProPlus6。0によって計算されました。
2.4.3ALPおよびTRAPアクティビティの決定
3 dpfのゼブラフィッシュの幼虫を6-ウェルプレートで継代培養し、化合物の存在下または非存在下でPreと5日間インキュベートしました。 次に、ALP活性を測定するためにそれらを収集しました。 ALP活性は、製造元のプロトコルに基づいてゼブラフィッシュALPELISAキットを使用して決定しました。 TRAP活性を評価する方法はALPと同じでした。
2.5ADゼブラフィッシュモデルの実験手順
2.5.1モデルのグループ化
ゼブラフィッシュの幼虫はいくつかのグループに分けられました：コントロールグループ、モデルグループ、モデルとDPZグループ、モデルと化合物のグループ。それぞれに30の幼虫が含まれていました。 対照群は、0.2パーセントのDMSOを含む培地で維持された。 モデルグループは、3dpfから6dpfのAlCl3（150 µM、pH 5.8）で処理されました。 モデルとDPZグループは、AlCl3とDPZ（8 µM）で同時処理されました。
2.5.2行動分析
薬物送達の3日後、幼虫の動きをViewPoint行動アナライザー（Zebralab 2018、ViewPoint Life Sciences Co.、Ltd.）で記録しました。 すべての実験は、28℃で60分で完了し、3サイクルの明/暗相（明と暗でそれぞれ10分）が含まれています。 前回の報告の方法によれば、抗AD薬の効率として、平均速度（AS）、速度変化（∆S）、ジスキネジア回復率（DRR、式a）、および応答効率（RE、式b）が選択されています。このモデルの評価指数（Pan et al。、2019; Wenhai et al。、2016）。
AS（mm /秒）= D / T、DRR（パーセント）= 100×（ASDrug-ASModel）/（ASControl-ASModel）、a
ここで、Dは60分間のゼブラフィッシュの移動距離、Tは実験時間です。
RE（パーセント）= 100×（∆SDrug-∆SModel）/（∆SControl-∆SModel）、b
ここで、ΔSは明/暗サイクルでのゼブラフィッシュの速度変化です。
2.5.3AChEおよびChATアクティビティの測定
3 dpfのゼブラフィッシュの幼虫を6-ウェルプレートで継代培養し、化合物の存在下または非存在下でAlCl3と3日間インキュベートしました。 次に、AChEアクティビティのために収集されました。 AChE活性は、製造元のプロトコルに基づいたゼブラフィッシュAChEELISAキットを使用して検出されました。 ChAT活動を評価する方法はAChEと同じでした。
2.6定量的リアルタイムPCR分析
ゼブラフィッシュの幼虫はOPグループとADグループに分けられました。 OPグループは、コントロールグループ、プレグループ、およびプレプラス化合物グループで構成され、3dpfから8dpfまで培養されました。 ADグループには、コントロールグループ、AlCl3グループ、および3dpfから5dpfまで培養されたAlCl3プラス化合物グループが含まれていました。 各グループには30匹の幼虫が含まれていました。 総RNAは、Trizolによってこれらのゼブラフィッシュの幼生サンプルからそれぞれ抽出されました。 RNAサンプルは、cDNAキットの製造元の指示に従ってcDNAに逆転写されました。 mRNA発現レベルは、リアルタイム蛍光定量PCR（Roche LightCycler96）によって検出されました。 結果は-アクチン発現に対して正規化され、比較（2-ΔΔCt）法によって定量化されました。 使用したフォワードおよびリバースプライマーは、Sangon Biotech（上海、中国）によって合成され、補足表S1にリストされています。
cistancheとTongkatアリパウダー免疫力を向上させるのに役立ちます。
2.7統計分析
GraphPadPrismバージョン8.00は、記述統計分析に使用されました。 データは平均±SDとして表され、ANOVA法によって分析され、Pが0.05以下であると見なして各試行間の変動性がテストされました。
