パート1カンカニクジュヨウのフェニルエタノイド配糖体のマイクロエマルジョンベースの経皮送達の準備と評価

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1 *、HUANHUAN XU 1-3 *、他

概要。

本研究の主な目的は、新しいマイクロエマルジョン（ME）製剤を開発してホンオニクからのフェニルエタノイド配糖体（PG）美白剤や日焼け止めに使用します。 油相は薬物の溶解度に基づいて選択され、界面活性剤と共界面活性剤はそれらの可溶化能力とそれらがMEを形成する効率に基づいてスクリーニングおよび選択されました。 ME領域を評価するために疑似三元状態図を作成し、水中油型MEの5つの配合をビヒクルとして選択しました。 ME製剤を最適化し、生理食塩水と比較してその透過性を評価するために、invitro皮膚透過実験を実施しました。 最適化されたMEの物理化学的性質とPGの浸透能力(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体） このMEによって配信されたものも調査されました。 最適化されたME製剤は、ミリスチン酸イソプロピル（7％、w / w）、Cremorphor EL（21％、w / w）、プロピレングリコール（7％、w / w）、および水（65％、w / w）で構成されていました。 PGの累積量(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体） MEによって運ばれたときに切除されたマウスの皮膚を透過したものは、PGが生理食塩水のみによって運ばれたときの約1.68倍でした。 マイクロエマルジョン中のPGの累積量（4149.65 0±37.3µg・cm -2）は、生理食塩水中のPGの累積量（2288.63±2 0。9µg・）よりも有意に多かった。 cm -2）。 さらに、透過係数は、最適化されたマイクロエマルジョンが、対照溶液よりもPGの経皮送達のためのより効率的な担体であることを示した（8.87±0.49cm /hx10-3対5.41±0.12cm/hx 10-3）。 総合すると、MEを含むPGの透過能力は、生理食塩水と比較して大幅に増加しました。

cistanche

序章

ハーブシスタンチェ、砂漠地帯に一般的に分布する強壮剤ハーブは、伝統的な中国医学で頻繁に使用されてきました。 これまで、記憶力、性的能力、フリーラジカル消去、アンチエイジング活性の改善など、そのバイオ医薬品特性を調査するために複数の研究が行われてきました（1）。 H.cistancheの主成分はフェニルエタノイド配糖体（PG）。 以前の研究では、PGが人体でメラニンを合成するための律速酵素であるチロシナーゼの活性を阻害することが明らかになっています（2）。 また、PG(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体） 2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカル（3）の除去、および紫外線（UV）放射からのケラチノサイトの保護に関与していることが報告されています。 したがって、この成分は皮膚の色素脱失の可能性があります。 局所薬は化粧品の分野で一般的に使用されており、薬は体の表面に直接送達されます（4）。 マイクロエマルジョン（ME）は、従来は油、界面活性剤、共界面活性剤、水相で構成される新しい薬物送達システムであり（5）、親油性薬物の速度と吸収を改善することが報告されています（6）。 さらに、その十分な溶解性、低い皮膚刺激性および高い透過性のために、それは局所薬物送達での使用が期待されている（7,8）。 私たちの知る限りでは、PGがマイクロエマルジョンを使用した局所薬によって送達された研究はほとんど行われていません。 本研究では、経皮投与用の水中油型（O / W）ナノエマルジョンデリバリーシステムを確立し、PGをナノエマルジョンに組み込んだ（9,10）。 一方、PGベースのナノエマルジョンの調製と特性評価は、invitroでの経皮放出を調査することによって実行されました。

材料と方法試薬。

Cremorphor ELとミリスチン酸イソプロピル（IPM）はSigmaAldrichから購入しました。 Merck Millipore（ダルムシュタット、ドイツ）。 エタノール、オレイン酸（OA）、およびTween -80は、Guangcheng Chemical Reagent Co.、Ltd.（Tianjin、China）から購入しました。 オレイン酸エチルは、Shanghai Chemical Reagent Co.、Ltd.（Shanghai、China）から購入しました。 使用したすべての化学薬品と溶媒は分析試薬グレードのものでした。 Cistanchetubulosaフェニルエタノイド配糖体のマイクロエマルジョンベースの経皮送達の調製と評価JIANHUAYANG1*、HUAN HUAN XU 1-3 *、SHANSHAN WU2、BOWIE JU2、DANDAN ZHU2、YAO YAN1、MEI WANG2、JUMPING HU {{9} }薬局、最初の提携病院; 2新疆ウイグル自治区医科大学薬学部自然医学科、ウルムチ、新疆830011; 3中国広東省東莞市康華病院薬局2015年12月2日受領。 2016年11月29日受理、DOI：10.3892 / MMR.2017.6147連絡先：新疆医科大学薬学部自然医学科Dr. Junping Hu、393 Xinyi Road、Urumqi、Xinjiang 830011、PR China E-mail：hujp0551 @ yeah.net *同等に貢献キーワード：フェニルエタノイド配糖体、マイクロエマルジョン、経皮送達、スキンライトナー、日焼け止めヤン他：化粧品用途のMEベースのPG1110PhGの調製。 PhG(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体） 日常的に説明されているように準備されました（11）。

風乾カンカニクジュヨウ80パーセントのEtOHによるパーコレーションによって電力が供給され抽出されました。 浸透物を加圧下で蒸発させ、続いて残留流体を濾過した。 ろ液を濃縮し、SP -825マクロポーラスレジンカラムで、溶離液として水中の0、30、50、70、および90パーセントのEtOHを使用してクロマトグラフィーを行いました。 30-50パーセントのEtOH溶出液を濃縮および乾燥して、PhGに富む画分を得ました。 UV分光光度法はPhGの含有量を示した(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体） 87.6パーセントでした。 MEの油、界面活性剤、および共界面活性剤のスクリーニング。 溶解度試験を実施して、高い薬物負荷容量を備えたME製剤の調製に適切な成分を選択しました。 このプロセスでは、過剰量のPGを、IPM、流動パラフィン、OA、Cremophor EL、Tween‑8 0、無水エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、およびPEG400の各試薬4mlに添加しました。 、 それぞれ。 これに続いて、得られた混合物を37℃で72時間相互に振とうし、続いて12,830xgで10分間遠心分離した。 続いて、ペレットをメタノールに再懸濁し、333nmでのUV分光光度法を使用してPGを測定しました。 メタノール中の油、界面活性剤、および共溶媒の適切な希釈溶液は、ブランクコントロールとして機能しました。 状態図の作成。 既存のマイクロエマルジョン境界の成分の濃度範囲を取得するために、前述のように水滴定法を使用して疑似三元状態図を作成しました（12）。 界面活性剤と共界面活性剤の重量比を1：3、1：1、および3：1にして、3相図を作成しました。 次に、油相と界面活性剤の混合物を、1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2、および9：1の重量比で混合した。 。 油と界面活性剤の混合物を均一に混合し、透明なＭＥが得られるまで、室温で磁気撹拌（３００ｒｐｍ）下で精製水で滴下希釈した。 疑似三元状態図を完成させるために、成分の濃度を記録しました。 これらの図に基づいて、PGベースのMEの調製に適切な濃度の材料が選択されました。 MEおよびPGの水溶液の調製。 界面活性剤：共界面活性剤の重量比が3：1の状態図に従って、合計5つのME（ME 1-5）を選択しました（表I）。 マイクロエマルジョンシステムは、油を界面活性剤と共界面活性剤の混合物と混合することによって調製され、水は、37℃でマグネチックスターラー（300r / min）を用いて油相に正確に添加されました。 システムは、30分間の穏やかな磁気攪拌を使用して平衡化され、続いて超音波処理下で適切な量のPGを溶解しました。 水溶液は、同じPG含有量を精製水に溶解して調製した。 マイクロエマルジョンの特性評価。 MEの平均液滴サイズと多分散度指数は、光子相関分光法（Malvern Instruments、Ltd.、Malvern、UK）によって評価されました。 すべてのサンプルを1：5の比率で水で希釈し、0.22 µmフィルターでろ過しました。 試験は、25℃の恒温槽で3回行った。 PGマイクロエマルジョンの形態は、透過型電子顕微鏡法（JEM -100 CXII; JEOL Ltd.、Tokyo、Japan）を使用して観察されました。 簡単に説明すると、希釈したサンプルを1滴、フィルムでコーティングした銅グリッドに堆積させた後、2％リンタングステン酸水溶液を1滴染色しました。

マイクロエマルジョンの平均液滴直径は、室温で光子相関分光装置（BI {{0}} SM; Brookhaven Instruments Corporation、Holtsville、NY、USA）によって決定された。 ME車両の粘度は、NDJ -8 Sデジタル粘度計（Shanghai Precision and Scientific Instrument Co.、Ltd.、Shanghai、China）を使用して、25℃で測定しました。 1つのローターを60rpmに設定。 pH測定。 MEのpH値は、Phs‑3Cデジタル酸度計（Shanghai REX Instruments Factory、上海、中国）を使用して25℃で測定されました。 屈折率は、サーモスタットアッベ屈折計（光学機器工場、上海、中国）で測定されました。 皮膚組織の準備。 体重20gの雄の昆明マウスは、新疆医科大学（中国、新疆ウイグル自治区）の実験動物センターから購入しました。 10匹のマウス（6週齢）を、室温（24±2℃）、湿度50±15パーセントで、12時間の明期/12時間の暗期のサイクルで1週間適応給餌に供しました。 すべての動物は、標準的な食餌と水を利用できました。 電気クリッパーで髪の毛を取り除いた。 皮下注射による抱水クロラール（10％）による最終麻酔に続いて、皮膚組織を腹部から切除し、皮下脂肪と結合組織を除去しました。 組織を4℃の冷蔵庫に一晩置いた。 研究プロトコルは、新疆医科大学（中国、新疆ウイグル自治区）の倫理委員会によって承認されました。 インビトロ浸透研究。 浸透実験は以前に記載されたように実施された（12）。 切除された皮膚は、有効拡散面積が2.8cm2の垂直拡散セルのドナーとレセプタチャンバーの間に固定された。 受容体チャンバーは、新鮮な通常の生理食塩水で満たされていました。 再循環水浴を使用して拡散セルを37℃に維持し、受容体チャンバー内の溶液を200rpmで連続的に撹拌した。 これに続いて、試験製剤（1.0ml）をドナーチャンバーに静かに置いた。 続いて、受容体チャンバー内の溶液３ｍｌを除去し、所定の間隔（０、２、４、６、８、１０および２４時間）で等量の新鮮な通常の生理食塩水と交換した。 受容体チャンバーから得られたサンプルは、PGを決定するために使用されました(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体）333nmの波長でUV分光法を使用したレベル。 切除されたマウスの皮膚を透過したPGの累積量は、以下の式に従って計算された。

ここで、Qnは特定の時間tでの累積量、Cnは各サンプリング時間でのレシーバー溶液の薬物濃度、Ciはサンプルの薬物濃度、Sは有効拡散面積（S {{0）です。 }}。8cm2）、およびV0とViは、それぞれレシーバーソリューションとサンプルのボリュームです。 PGの累積量（Qn）(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体）浸透は、各製剤の時間（t）の関数としてプロットされました。 マウスの皮膚を通る定常状態（Jss、µg / cm -2 / h -1）でのPGの浸透率は、Qnversus時間のプロットの線形部分の傾きから計算されました。 透磁率係数（Kp、cm / h）は、次の式に従って計算されました。

ここで、Kpは透過係数、Jssは定常状態で計算された流出であり、C0はビヒクル内で一定のままであった薬物濃度を表します。 皮膚保持研究。 次のセクションでは、最適化されたME製剤（PG含有量、2％、w / w）と水溶液の間の、ex vivo透過挙動、累積量、透過率、透過係数、および皮膚保持特性の比較について詳しく説明します。 浸透実験の終わりに、皮膚中の残留薬物レベルをホモジナイゼーション法を使用して決定した。 通常の生理食塩水で洗浄した後、皮膚を小さな切片に切り、氷浴中の3mlのメタノールを含むガラス管に入れた。 サンプルを12000 r/minの速度でホモジナイズしました。 rpmで2分間、次に25℃で30分間水平に12,830xgで遠心分離します。 上澄みをミクロポーラスフィルター（0.45 µm）に通し、PG(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体）上澄みのレベルは、333nmの波長でUV分光法によって決定されました。 安定性研究。 PGをロードしたMEの物理的安定性は、透明度、粒子サイズ分析、および相分離によって調査されました。これらは、2〜8℃および室温で3か月間観察されました。 MEの物理的安定性を評価するために、25℃で30分間、12,830xgで遠心分離を行いました。 最適な保管温度を判断するために、PGの相分離と濃度を毎月調査しました。 化学的安定性は、2〜8℃および室温で保存された薬物負荷製剤で評価され、PG含有量は333nmでのUV分光光度法によって決定されました。 皮膚感度テスト。 以前に記載されたように（13）、開発された製剤の局所適用の刺激性の可能性を評価するために、ウサギ（体重2.02.5kg）で皮膚感受性試験を実施した。 新疆医科大学の実験動物センターから、9匹のオランダウサギ（1​​6週齢、体重2。0-2。5 kg、オス5匹、メス4匹）を入手しました。 動物は、室温（24±2℃）、湿度50±15パーセントで、12時間の明期/12時間の暗期のサイクルで1週間適応給餌を受けた。 すべての動物は、標準的な食餌と水を利用できました。 犠牲には空気塞栓症が使われた。 本研究で使用されたプロトコルは、新疆医科大学（新疆、中国）の倫理委員会によって承認されました。 ME製剤の投与の約24時間前に背中の毛を取り除いた。 動物は次のグループに分けられました。最適化されたMEグループ（n =3）、2％（w / w）のPGを含む最適化されたMEの局所投与。 PG生理食塩水グループ（n =3）、2％（w / w）PGを含む生理食塩水を局所投与。 通常の生理食塩水の局所投与の対象となる対照生理食塩水群（n =3）。 投与は1日2回5日間行った。 動物は、紅斑、丘疹、薄片化および乾燥を含む、皮膚のかゆみまたは変化の兆候について観察された（14）。 薬物離脱後、単回または複数回投与の観察を3日間続けた。 試験領域の刺激スコアは、以下の基準に従って紅斑および浮腫の程度を判断することによって評価された。 2、わずかな反応; 3、中程度の反応、4、重度の反応（15,16）。 最後に、各条件の総刺激スコアは、次の式を使用して計算されました。

統計分析。 データは平均±標準偏差として表されます。 データ分析は、一元配置分散分析とそれに続く最小有意差検定を使用して実行されました。 データは、SPSSソフトウェアバージョン19を使用して分析されました。0（IBM SPSS、米国ニューヨーク州アーモンク）。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

結果と考察

MEの油、界面活性剤、および共界面活性剤のスクリーニング。 PG(cistancheからのフェニルエタノイド配糖体）流動パラフィンとオレイン酸にはほとんど溶けませんでしたが、IPMでは中程度の溶解度が観察されました（表II）。 IPMは皮膚の拡散係数を増加させ、浸透係数を増加させます（17,18）。 さらに、IPMは、そのよく知られた浸透促進特性と生体適合性のために、MEの調製に一般的に選択されています。 界面活性剤の選択は、油と水の界面に膜を形成することによって界面張力の低下に寄与するため、MEの配合を成功させるために重要です（19）。 本研究では、PGはTween -80（28.051 mg / ml;表II）と比較してCremophor-EL（40.193 mg / ml;表II）でより高い溶解度を示しました。 したがって、CremophorELは、その溶解度プロファイルと非イオン性界面活性剤としての毒性レベルが低いため、今後の研究で使用するために選択されました。 さらに、その水溶液は、PGの良好な溶解性を示した。 共界面活性剤の中でPGの最も高い溶解度は、プロピレングリコール（48.714 mg / ml;表II）で観察されました。 さらに、プロピレングリコールはIPMおよびCremophorELとMEを形成する能力があります。 まとめると、IPM、CremophorEL、およびプロピレングリコールは、PGをロードしたMEの配合のために、それぞれ油相、界面活性剤、および共界面活性剤として使用されました。 疑似三元状態図の作成。 本研究では、マイクロエマルションの成分の濃度範囲を選択するために状態図を作成し、マークされた領域は明確なO / WME領域を示しています（図1）。 角質層の水和効果と皮膚浸透との密接な関係は以前に報告されており（20）、MEにおける薬物の熱力学的活性は、皮膚への薬物の放出と浸透の背後にある重要な推進力でした（20,21 ）。 界面活性剤混合物の含有量が少ないMEにおける薬物の熱力学的活性は、薬物の放出と皮膚への浸透の重要な推進力であることが実証されました（22,23）。

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2：8は濁っていて不安定でした（図2）。

ME1‑5の最終的な組成を表Iに示します。MEの準備と特性評価。 ME1-5の物理的特性を表IIIに示します。 分散系は巨視的に同一で、均質で、透明であり、沈殿物はありませんでした。 これらのMEの平均液滴サイズは30。56〜79.21 nmの範囲であり（図3;表III）、多分散度指数値は0。187〜0。321の範囲でした。 （表III）。 これは、サイズ分布が狭い均一なMEを示しています。 さらに、液滴サイズは油含有量に比例して増加したが、界面活性剤混合物含有量とともに減少した。 この現象は、MEオイルコアの膨張と、界面活性剤の濃度が高いために、油と水の界面張力が強制的に低下して液滴のサイズが小さくなることが原因である可能性があります。 さらに、界面活性剤レベルの増加と水分の減少の結果として、ME粘度が上昇しました。 すべてのMEのpH値は5。0-7。5（表III）の適切な範囲内にあり、皮膚組織のpH値と互換性がありました。 物理的安定性に関しては、試験したMEのいずれにおいても相分離、破壊、または薬物沈殿は観察されませんでした。これは、MEが遠心分離に対して十分な熱力学的安定性を備えていることを示しています。 染料溶解性試験により、水溶性染料（メチルオレンジ）がMEシステム全体に均一に分布していることが明らかになりました。これは、形成されたMEがO / Wタイプであることを意味します（データは示していません）。 顕微鏡写真は、球形の輪郭を持つ別々の単一のME5液滴を明らかにしました（図4）。 Exvivo皮膚浸透研究。 試験したすべてのビヒクルの透過プロファイルはゼロ次放出動態に従い（26,27）、ME5はPGの最高の経皮フラックスを提供しました（86。795±0。23µg / cm {{28 }} / h -1;図5;表III）。 本研究では、PGの皮膚浸透に対する油分と界面活性剤混合物の影響を測定しました。 結果は、界面活性剤が、膜流動性、薬物可溶化、および角質層からの脂質の抽出を増加させることによって皮膚浸透を増強することを示した。 ME5の透過率（86。795±0。23µg / cm -2 / h -1）は、ME1の透過率（69.57±{ {48}}。78、P=0。00 94）、ME2（44.326±0。84、P {{5 0}} 。00 52）、ME3（79.859±0.12、P =0。039）およびME4（58.332±0.39µg / cm -2 / h -1 、P =0。0063、図5;表III）これは、ME薬物カーゴの熱力学的活性が界面活性剤レベルの増加とともに減少する可能性があるという以前の研究の結果と一致していました（12,28 ）。 ME5の粘度（30.43±0.12mPa.s）は、他のME1（80.51±0.87mPa.s、P =0。0076）、ME2（47.52±0.54mPa.s、P {{88）と比較して低かった。 }}。0089）、ME3（60.49±1.34mPa.s、P =0。0094）およびME4（43.27±0.21mPa.s、P =0。0059）。