パート1ラットのウシ血清アルブミン誘発性肝線維症に対するCistancheTubulosaからのフェニルエタノールグリコシドの予防効果

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

概要

バックグラウンド：カンカニクジュヨウ 免疫を調節するために広く使用されている伝統的な中国の漢方薬です。ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体この植物からの（CPhGs）は主に有効な材料です。 この研究の目的は、ラットのBSA誘発性肝線維症および肝星細胞が関与する関連分子メカニズムに対するCPhGの予防および治療効果を評価することでした。 別の伝統的な漢方薬であるBiejiarangan（BJRG）を陽性対照として使用しました。 方法：in vivo実験では、75匹のSDラットをランダムに6つのグループに分けました：正常（蒸留水処理）、モデル（BSA処理）、陽性薬物（BSA処理とBJRG 6 0 {{29}） } mg / kg / day）、およびBSA処理とCPhG（125、25 0、および5 0 0 mg / kg / day）グループ。 肝臓および脾臓の指標、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、ヘキサデセン酸（HA）、ラミニン（LN）、III型プロコラーゲン（PCIII）、IV型コラーゲン（IV-C）、ヒドロキシプロリン（ Hyp）、およびトランスフォーミング成長因子1（TGF - 1）がラット肝臓で測定されました。 肝硬変の組織病理学的グレードは、H＆Eおよびマッソンのトリクローム染色を使用して各グループについて評価されました。 TGF - 1、コラーゲンI（Col-I）、およびコラーゲンIII（Col-III）の発現は、免疫組織化学的染色法によって決定されました。 これらの効果は、定量的リアルタイムPCR分析によってNF-κBp65およびCol-Iの発現レベルを決定することにより、invitroでさらに評価されました。 Col-Iタンパク質の発現もウエスタンブロッティングで調べました。 結果：CPhGのすべての用量群（125、25 0、および500 mg / kg /日）は、肝臓および脾臓指数を有意に低下させ、ALT、AST、HA、LN、PCIII、IV-C血清レベルを低下させました。 TGF - 1コンテンツ（P <0.01、p><0.01、およびp><0.01）、およびhypコンテンツ。 cphgはまた、肝細胞の腫れを著しく軽減し、肝細胞の壊死と炎症性細胞の浸潤を効果的に防止しました。="" 免疫組織化学的結果は、cphgがtgf="" -="" 1（p=""><0.01、p><0.01、およびp><0.01）、col-i、およびcol-iiiの発現を有意に減少させたことを示しました。 hsc-t6に対するcphg（100、75、50、および25="" ug="" ml）のin="" vitro効果は、cphgがnf-κbp65およびcol-iのmrna発現を有意に低下させ、cphgもcol-iタンパク質発現をダウンレギュレートすることを示しました。="">

キーワード：肝線維症、カンカニクジュヨウ、フェニルエタノール配糖体、ケモカインBSA、予防と治療。

バックグラウンド

肝線維症は、さまざまな要因によって引き起こされる慢性肝炎の病因で発生する重度の肝損傷に対する創傷治癒反応です。 これらの要因は、ウイルス感染、アルコール乱用、胆汁うっ滞、代謝性疾患および自己免疫疾患です[1–3]。 細胞外マトリックス（ECM）の進行性の蓄積とリモデリングの減少は、肝臓の正常な構造を破壊し、肝線維症を引き起こします[4]。 肝線維症は慢性肝疾患において重要であり、しばしば不可逆的な肝硬変および発癌に発展します。 現在、肝線維症の治療のための方法や効果的な薬はありません。 したがって、線維症および癌への肝損傷の進行を弱める抗肝線維症薬を見つけることが急務である。カンカニクジュヨウW（ハマウツボ科）は、中国の新疆ウイグル自治区南部で広く栽培されている寄生植物です[5]。 人々は通常、腎臓を活性化し、血液に栄養を与え、腸をリラックスさせ、老化を遅らせるためにそれを使用します。 中国薬局方[6]に正式に記載されています。 C.tubulosaにはさまざまな有効成分が含まれています。 これらには以下が含まれますホンオニクからのフェニルエタノール配糖体（CPhGs）、イリドイド、および多糖類。 の多くのアクティブコンポーネントの1つとしてカンカニクジュヨウ、CPhGは、invivoおよびinvitro研究の両方で、説得力のある抗酸化作用、抗疲労作用、神経保護作用、および抗炎症作用を示しています[7]。 近年、CPhGs（ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体）肝保護効果があります。 これらの影響の根底にある潜在的なメカニズムは、フリーラジカルの除去、肝膜の保護、免疫調節、アポトーシスの阻害、HBsAgおよびHBeAgの発現の阻害、およびHBV DNA複製の阻害などです[8–11]。 ただし、文献のいくつかの研究は、グラフィックスの抗肝線維症効果を扱っています。 したがって、この研究は、ラットにおけるウシ血清アルブミン（BSA）誘発性肝線維症のモデルを使用することにより、GPhCの抗肝線維症効果を調査することを目的とした。 関連する分子メカニズムは、HSC-T6細胞で調査されました。

メソッド

化学薬品および試薬

ヒドロキシプロリンキット（アルカリ加水分解）（ロット：20140616）は、南京江城生物工学研究所（中国）から購入しました。 ラットTGF- 1サンドイッチELISAキット（ロット：238240615）は、Lianke Biotech Co.、Ltd.（中国）から購入しました。 ウサギ抗コラーゲンI抗体（ロット：140619）、ウサギ抗コラーゲンIII抗体（ロット：980788 W）、およびウサギ抗TGF - 1抗体（ロット：140619）は、北京生合成バイオテクノロジー株式会社から提供されました。 LTD（中国）。 通常の羊血清（作動油）（ロット：WP141214）、PV -6000（ロット：WK141225）、およびDABキット（ロット：K136621D）は、中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー株式会社（中国）から購入しました。 。 一次抗体の検出は、2。抗体溶液（Alk-Phos。Conjugated、Anti-rabbit）および2. Invitrogen Company（USAから購入した抗体溶液（Alk-Phos。Conjugated、Anti-mouse））（ロット：272387）を使用して行いました。 ）。 ウシ血清アルブミン（BSA）（ロット：SLBG8239V）はSigma（USA）から購入しました。 使用前に、BSAを通常の生理食塩水中で18 g / Lで調製し、細菌をろ過により除去し、BSAを4度で保存しました。 羊毛からの脂質1gを含むフロイントの不完全アジュバント（ロット：AF0220LA14、Shanghai yuan ye Bio-Technology Co.、Ltd.（中国））を2gの液体パラフィン（ロット：20130815、Tianjin Fuyu Fine Chemical Co.、株式会社（中国）、蒸気オートクレーブで滅菌し、4度で保存。陽性薬剤BJRGは、インナーモンゴルフルイメディカルサイエンス株式会社（中国）からBiejiarangan錠剤として入手しました。BJRG薬剤ストックは、溶解して調製しました。 600mg/kgの濃度の蒸留水中のBJRG錠剤。

植物材料

カンカニクジュヨウ（ハマウツボ科）は、中国の新疆ウイグル自治区のミンフェン地域から購入しました。 この資料は、新疆ウイグル自治区のマテリアメディカ研究所のウイグル医学の主要研究所である研究者のJunZhaoによって認証されました。 バウチャーの標本は、新疆ウイグル自治区のマテリアメディカ研究所に寄託されました。

CPhGの準備(ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体)

の乾燥およびスライスされた根茎カンカニクジュヨウ（6. 0 kg）を7 0パーセントのエタノールで3回還流下で連続的に抽出し、溶媒を除去してエタノール抽出物を得た。 AB -8樹脂を使用してエタノール抽出物を精製し、フェニルエタノール配糖体（CPhG）を得ました。 動物実験でさまざまな用量群に使用されたCPhGのストック溶液（それぞれ500 mg / kg、250 mg / kg、および125 mg / kg）を、0.5％（5 g / L）のカルボキシメチルセルロース（ナトリウム塩）に溶解しました。

CPhGの定量化(ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体)

CPhGの2つの成分（エキナコシドとアクテオシド）の含有量は、以前に報告された方法（Zhangetal。2004）を使用したHPLCによって決定されました[12]。 ＨＰＬＣは、ＵＶ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ {{2}＞ Ａ ＨＰＬＣを使用することによって実施された。 HPLCカラムはPhenomenexGeminiODSカラム（250×4.6 mm、5μm）でした。 アイソクラティック移動相は、メタノール-アセトニトリル-1パーセントの酢酸（15：10：75、v / v / v）で構成されていました。 溶出は40分間で、流速は0.6 mL/minに維持しました。 カラム温度は30度で一定に保たれました。 UV検出は334nmでした。

動物およびHSC-T6細胞株

[グレードSPF]健康な成体のオスのSprague–Dawley（SD）ラット（180–220 g）は、新疆医科大学動物センター、ライセンス番号：SCXK（新規）2011–0004から購入しました。 ラットには特定病原体除去（SPF）飼料を与えました。 動物実験に関連するすべての手順は、新疆医科大学第一付属病院の動物倫理委員会によって承認されました。 ラットは、制御された環境条件（25度および12時間の明/暗サイクル）の下でケージに収容され、標準的なラットペレット餌および水道水を自由に摂取できた。 ラットは治療前に順応させた。 不死化ラット肝星細胞株、HSC-T6は、武漢プロセル遺伝子バイオテクノロジー株式会社から入手した。 （武漢、中国）。 HSC-T6細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco、南アメリカ）、100 IU / mlペニシリン、および100 ug / mlストレプトマイシン（北京）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（DMEM、北京、中国）で培養しました。 、中国）5％CO2の37度の加湿インキュベーター内。

BSAによる肝障害と治療

75匹のSDラットをランダムに6つのグループに分けました：正常（蒸留水処理）、モデル（BSA処理）、陽性薬物（BSA処理+ BJRG 600 mg / kg /日）、およびBSA処理+ CPhG(ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体)（125、25 0、5 {{2 0}} 0 mg / kg /日）グループ。 BSA処理とCPhG（125、250、5 00 mg / kg / day）のグループには、各グループに13匹のラットがあり、他のグループには、各グループに12匹のラットがいました。 BSA誘発性肝障害モデルは、一次感作とそれに続く免疫学的攻撃に分けられます）[13]。 正常群を除いて、他の群は一次感作のために1日目、15日目、22日目、29日目、および36日目に0.5ml（9mg / ml）のBSAフロイントの不完全アジュバントを複数回皮下注射した。 5回目の注射から7日後、ラット網膜静脈叢から血液を採取し、血清アルブミン抗体を検査しました。 ラット血清中のBSA抗体は二重寒天拡散法により検出された。 攻撃注射は、通常の生理食塩水中の0.4mlのBSAをBSA抗体陽性ラットの尾静脈を通して週に2回10回投与することによって実施された。 注射の濃度と時間は5。00、5.50、6。00、6.50、7。00、7.50、8.50、9。00、9.50、10.00でした。それぞれ、46日目、50日目、53日目、57日目、60日目、64日目、67日目、71日目、74日目、78日目のg/L。 正常群では、BSAの代わりに免疫学的一次（感作）および二次（攻撃）注射に通常の生理食塩水を使用し、他の条件はモデル群と同じでした。 正常群には10ml/kg/日の蒸留水を経口投与した。 モデルグループには、10ml /kg/日の0.5パーセントCMC-Na溶液を経口投与しました。 陽性薬物群は600mg/kg/日BJRGを経口投与された。 BSA処理とCPhG（125、

250、および500 mg / kg / day）グループに125、250、および500 mg / kg /dayCPhGを経口投与した(ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体)、 それぞれ。 毎日の投薬ラットは、最後の注射後2週間続けられた。 実験期間後、ラットを10％抱水クロラールの前に12時間絶食させ、すぐに安楽死させた。 各ラットから血清サンプルを収集し、すぐに使用した。 肝臓は2つの目的で採取されました：（1）Hypキット用の液体窒素での保存と（2）組織学的および免疫組織化学的検査用の10％ホルムアルデヒドでの固定。 動物実験の全期間は93日でした。

肝臓と脾臓の指数

肝臓と脾臓を開腹術で解剖し、4度の通常の生理食塩水で洗浄した。 ろ紙で余分な水分を吸収した後、肝臓と脾臓の重さを量り、対応する指標を計算しました：相対臓器重量=臓器重量（g）/個人体重（g）×100パーセント[14]。

細胞実験

HSC-T6細胞を96-ウェルプレートにプレーティングしました。 最初に、細胞を10パーセントのFBSを含むDMEMで48時間培養しました。 次に、培地をFBSを含まないDMEMに交換して、細胞を12時間飢餓状態にしました。 次に、細胞を5.0 ng / mL TGF - 1（FBSなし）を含むDMEMで24時間培養しました。 最後に、さまざまな濃度のCPhG(ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体)（100ug / ml、50ug / ml、および25ug / ml）、アクテオシド（6 ug / ml、3 ug / ml、および1.5 ug / ml）、およびエキナコシド（500ug / ml、250ug / ml、および125ug / ml）プレート内の4つのウェルで実施し、48時間インキュベートしました。

リアルタイムPCR分析

NF-κB、p65、およびコラーゲンIのmRNA発現レベルは、リアルタイムPCRによって決定されました。 HSC-T6細胞でのmRNA発現を測定するために、細胞（4×105細胞）を10％FBSを含む3 mL DMEMを含む6ウェルプレートに播種し、37度および5％CO2で一晩インキュベートした後、細胞培養培地無血清DMEMに変更されました。 次に、CPhG(ホンオニクからのフェニルエタノール配糖体)（1 0 0 ug / ml、50 ug / ml、および25 ug / ml）、アクテオシド（6 ug / ml、3 ug / ml、および1.5 ug / ml）、およびエキナコシド（500 ug / ml 、250 ug / ml、および125 ug / ml）をウェルに添加しました。 CPhGまたはモノマー組成物との48時間のインキュベーション後、TRIzol試薬（Invitrogen、USA）を使用して全RNAを抽出し、クロロホルムで15秒間激しく攪拌しました。 室温で3分間静置した後、ライセートを12、000×gで15分間、4度で遠心分離しました。 水相中のRNAをイソプロパノールで沈殿させ、上部の水相を新しいマイクロ遠心チューブに移しました。 0.75％エタノールを加えてRNAを沈殿させた後、マイクロ遠心チューブを使用し、12、000×g、4度で5分以内で遠心分離しました。 上清を除去し、RNAを室温で5〜10分間乾燥させました。 ラット-アクチン[GenBank：NM _031144。3]、コラーゲンI [GenBank：NM _ 053304。1]、およびNFの増幅に使用されたプライマーの特定のセット（Sangon、Shanghai、China） -κBp65[GenBank：NM_199267。2]遺伝子はBatchPrimer3を使用して設計されました。フォワード（fw）およびリバース（rv）プライマーは次のとおりです。コラーゲンI（fw：GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG 、rv：GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA）、NF-κBp65（fw：CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG、rv：TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA）、-アクチン（fw：TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G、rv：AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A）。 結果は、内部対照としてのハウスキーピング遺伝子-アクチンのmRNAに対して正規化され、相対的なmRNAレベルとして表されます。 反応は、8μLのiQ SYBR Green Supermix、1μLの10 pMプライマーペア、8.5μLの蒸留水、および2.5μLのcDNAを使用して行いました。 各ポリメラーゼ連鎖反応は、以下の条件下で実施された：95度で3分間、次に95度で10秒、55度で30秒、および55度で10秒の40サイクル-伸長のために-95度、続いて単一蛍光測定。 最終結果は、相対値（2-ΔΔCt）で記述されました。 計算と分析は、iQ5リアルタイムPCR検出システムによって実行されました。

ウエスタンブロット分析

コラーゲンI（Abcam、Cambridge、UK、Art No：ab3471 0）タンパク質発現レベルは、ハウスキーピングコントロールとして-アクチン（ロット：60008-1- lg; Proteintech、中国）を使用したウエスタンブロッティングによって決定されました。 全細胞抽出物は、1％Haltプロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific、USA）および1％Haltホスファターゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific、USA）を含むRadioimmunoprecipitation Assay（RIPA）（Thermo Scientific、USA）バッファーを使用して調製しました。 タンパク質濃度は、ブラッドフォード法[18]によって測定および定量化されました。 タンパク質（10〜50 ug）を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDFメンブレン（Millipore、USA）に転写しました。 膜を5％BSAで室温で1時間ブロックし、一次抗体（Anti-Colla gen I抗体、1：200希釈またはマウスmAbの-アクチン、1：5000希釈）を4度で一晩インキュベートしました。 対応するAlk-Phos。 コンジュゲートした二次抗体を室温でインキュベートした。 最後に、メンブレンを0.1％Tween 20を含む1×Tris–HCl生理食塩水で3回洗浄し、シグナルをスキャンしてGEL DOC XR Imaging System（Bio-Rad）で可視化しました。 デンシトメトリー分析は、目的のタンパク質で実行され、GEL DOC Image Studioソフトウェア（Bio-Rad）によって-アクチンに正規化されました。 -アクチンは内部対照として使用されました。

統計分析

Shapiro-Wilk正規性検定とLeveneの分散均一性検定を適用して、正規性を検証しました。 DARU Journal of Pharmaceutical Sciences（2 0 15）23:524/13ページ分散の均一性。 分散分析（ANOVA）とそれに続くテューキーの事後検定を使用して、不均一な正規分布データの統計的差異を特定しました。 Kruskal-Wallisノンパラメトリック検定を使用して、正規分布または均一ではないデータを分析しました。 結果は平均±SDとして表された。 有意性はP<0。05に設定されました。 すべてのデータは、spss="">

結果

CPhGの定量的決定

カンカニクジュヨウのCPhGには、2つのフェニルエチルアルコール配糖体であるエキナコシドとアクテオシドが含まれており、CPhGの含有量はHPLC分析（図1）によって42.71±0.42パーセントおよび14.27±{{7 }}。18パーセント、それぞれ。

肝臓と脾臓の指数

表1に示すように、モデルグループの肝臓と脾臓の指数は有意に上昇しました[P<><0.05]。 異なる用量群での陽性薬物bjrgおよびcphgの肝臓および脾臓指数は、モデル群[pliver="0。004、PLiver=0。003、PLiver=" 0と比較して有意に減少しました。="" 004、pliver="0。005;" pspleen="0" .017、pspleen="0。027、PSpleen=0。024、PSpleen=" 0。070]。="">

ALT、AST活性、および肝硬変マーカーに対するCPhGの影響

本研究では、肝酵素ASTおよびALTの血清レベルは、BSA誘発肝線維症ラットの肝細胞損傷を反映して、モデルグループで有意に増加しました。 しかし、実験。

BJRG（6 0 0 mg / kg）およびCPhG（125、25 0、および5 {{1 0}}0による治療がmg / kg）ASTを大幅に削減[PAST<0。0{{6 0}}="" 1、past=""><0。001、past><0.001、past><0.001 、それぞれ]およびalt="" [palt="0。117、PALT=0。139、PALT=0。189、PALT=" 0。255]肝線維症ラットのレベル。="" （表2）。="" モデルラットのha、ln、pcおよびiv-cのレベルは有意に増加しました[それぞれpha=""><0.001、pln><><0.001]。 モデルグループと比較して、haのレベル[pha="0。009、PHA=0。007、PHA=0。009、PHA=0。023]、" ln="" [pln="0。011、P" ln="0。004、P" ln="0。026、P" ln="0。069]、PC" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}。006、p="" pciii="0。067、P" pciii="0。136、P" pciii="0。296]、およびIV-C" [p="" iv-c=""><ラットの0.001、p iv-c=""><0.001、p iv-c=""><0.001、p iv-c=""><0.001]は、異なる用量群（125、250、および500 mg="" kg）（表3）。hyp含有量とtgf="" -="" 1コラーゲン含有量は、肝臓組織のhypレベルを測定することによっても検出されました。="">モデル群のレベルは正常群よりも有意に高かったが、BJRG群と異なるCPhG投与群では著しく低下した。 ラットのモデルグループのTGF{{0}}の肝臓濃度は有意に増加しました[P<0。001]。 モデルグループと比較して、陽性薬物のtgf-="" 1レベルと異なるcphgs用量グループは著しく減少しました[ptgf="" -="" 1=""><0。001、p tgf="" -="" 1=""><0.001、p tgf="" -="" 1=""><0.001、ptgf-><0.001]。>

組織病理学的検査

H＆Eおよびマッソントリクロームで染色された正常な肝組織切片の観察は、明確な肝小葉および肝類洞を示しています。 モデルラットの肝臓組織構造は無秩序であり、肝臓組織と肝類洞は大量の結合組織に置き換えられた。 しかし、モデル群よりも治療群の方が、より正常な細胞構築と結合組織が検出されました。

H＆E染色

正常群では、異常な門脈領域および肝類洞を伴わない肝小葉の構造的完全性が観察された。 肝索は整然と配置され、芯は丸く透明でした。 核は細胞の中心にあり、細胞質が豊富です。 門脈領域のみに少量の線維組織があります（図2a）。 モデル群では、小葉構造がひどく損傷していた。 肝細胞は軽度の水様変性、主にバルーニング変性および/または脂肪変性を示した。 炎症性細胞浸潤の形成、広範な線維性組織過形成、多数の線維性中隔の形成、分裂した小葉、および有意な肝細胞増殖も観察された。 これらの観察は、肝線維症のラット免疫損傷動物モデルの確立の成功を確認した（図2b）。 モデルグループと比較して、異なるCPhGで炎症性細胞浸潤の減少がありました。 また、肝細胞の壊死および脂肪変性の減少、ならびに線維症の緩和も観察された。 CPhGは、ラットにおけるBSA誘発性肝線維症の病状を有意に軽減し、肝細胞の腫れを軽減し、肝細胞壊死および炎症性細胞浸潤を効果的に防止し、CPhGがBSA誘発性ラット肝線維症に対して保護効果を発揮することを示唆しています。 （図2c–f）。 マッソントリクローム染色正常群では、肝臓組織は正常でした。 肝門脈領域は少数の青いコラーゲン線維を示し、肝臓組織は正常に構造化されていました（図3a）。 正常群の肝組織と比較して、線維性組織は中央の小葉によって増殖し、肝実質に拡大した。 コラーゲン繊維が伸びてリンクし、

小葉全体を包み込み、中心静脈を取り囲んだ。 これらの効果は、肝細胞線維症、小葉構造損傷、門脈周囲線維症、および偽小葉形成（図3b）とともに、モデルが確立されたという証拠を提供しました。 モデル群と比較して、陽性薬物対照群のコラーゲン線維は、末梢門脈領域から外側に穏やかに伸びていた（図3c）。 モデルグループと比較して、異なるCPhGs用量グループのコラーゲン線維は有意に減少し、線維増殖は阻害され、肝実質内の線維組織の増殖は有意に減少しました。 これらの結果は、CPhGがラットをBSA誘発性肝線維症から保護したことを示唆しています（図3d–f）。

免疫組織化学的染色

重要なことに、I型コラーゲンとIII型コラーゲンの発現は肝線維症の発症に重要な役割を果たしており、それらの生成と肝組織への沈着は、抗肝線維症の有効性の重要な決定要因として役立つ可能性があります。 結果は表5にまとめられています。

コラーゲンタイプI

正常群は主に血管と門脈部にI型コラーゲンを発現していた。 モデルグループは、門脈領域でI型コラーゲン血管線維症を高度に発現しました。 Disseの空間では、I型コラーゲンの染色が縞模様または斑状の分布として観察されました。 コラーゲンは繊維状の隔壁を包み、偽小葉を形成しました。 これらの実験では、BJRJ（600 mg / kg）およびCPhGの異なる用量グループ（125、250、および500 mg / kg）で形成された線維性中隔が少なくなりました[PCol I=0。002、PCol I {{ 6}}。001、PCol I=0。023、およびP ColI= 0。044]。 半定量的な結果は、それらのI型コラーゲンの発現がモデルグループと比較して有意に低いことを明らかにしました（図4）。

コラーゲンタイプIII

コラーゲンタイプIIIは正常群で弱く発現し、門脈と肝静脈を取り巻く周辺領域は、連続した線維の代わりに少量の細かい黄色を示しました（図5a）。 モデルグループでは、コラーゲン線維は幅が広く太い索を示し、主に門脈および線維組織領域に位置する強い発現を示しています（図5b）。 BJRJのコラーゲン線維（600 mg / kg）およびCPhGの異なる用量群（125、250、および500 mg / kg）は糸状であり、中心静脈および門脈領域の周​​りに分布していた。 モデルグループと比較して、コラーゲン線維は有意に減少し、染色は薄く薄く、免疫組織化学的染色は弱く陽性でした（図5c–f）。 これらの半定量的結果は、陽性および異なる用量群で陽性に発現された細胞[PCol III=0。015、PCol III=0。001、PCol III=0。010、およびP Col III=0。037]は、モデルグループのものとは異なりました。

TGF - 1

正常なラット肝細胞ではTGIF{{0}}の発現はほとんどありませんでした。 発現は少数の間質細胞に限定されていました（図6a）。 モデルグループでは、TGF - 1の発現は、門脈領域、線維性空間、肝星細胞、炎症細胞、正弦波壁、細胞質に広く分布していました。 特定の門脈領域は、茶色がかった黄色の染色で強い陽性発現を示しました（図6b）。 BJRJの門脈領域と線維性中隔（600 mg / kg）およびCPhGの異なる用量群（125、250、および500 mg / kg）で少量の発現がありました。 これらのグループの陽性染色の程度は、モデルグループのそれと比較して有意に減少した。 線維性中隔の間質細胞および炎症細胞の細胞質の染色は減少しました（図6c–f）。 半定量的結果は、BJRJおよびCPhGの異なる用量群[P TGF - 1=0。001、P TGF - 1 <0.001、p tgf="" -="" 1="0。009、PTGF" -="" 1="0それぞれ.004]は、モデルグループと比較して有意でした。" 記事の前半で述べたように、tgf-="">

線維症、細胞外マトリックスの産生を刺激する[19]。 TGF - 1のレベルが、肝硬変の重症度と一致する方法でモデルグループで増加することを示しました。 肝臓におけるTGF- 1の発現レベルは、血清TGF- 1レベルと一致していました。 これは、CPhGがECMの合成と分解に関与することにより、TGF- 1の発現による肝硬変を大幅に軽減できることを示しています。 I型コラーゲン、III型コラーゲン、TGF - 1の発現により、肝線維症の病理学的過程を検出することができます。 治療群におけるそれらの発現レベルは有意に減少し、CPhGがコラゲナーゼ活性を改善し、肝臓のECM合成および分解の動的平衡を維持し、したがって肝硬変の形成を遅延および防止できることを示した。