その1：iPSC技術による腎疾患の再生医療
Mar 28, 2023
概要
再生医療は、腎疾患の治療法が不足していることから、新しい治療法として注目を集めています。 ヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) を使用した腎再生の最近の進歩は注目に値します。 腎臓発生の知識に基づいて、hiPSC は 2 種類の胚性腎臓前駆細胞、ネフロン代謝前駆細胞 (NPC) と尿管芽 (UB) に方向的に分化し、ネフロンを生成し、管のような器官を集めることができます。 さらに、これらの hiPSC 由来の前駆細胞から、NPC 由来の糸球体と尿細管、および UB 由来の集合管が相互接続されたヒト腎臓組織を生成できます。 誘導された腎臓組織は、免疫不全マウスへの移植後にさらに血管新生されます。 移植のための腎再建に加えて、hiPSC 由来の NPC による細胞療法は、マウスの急性腎障害 (AKI) を改善することが示されています。 疾患特異的 hiPSC を使用した疾患モデリングおよび創薬研究は、常染色体優性多発性嚢胞腎 (ADPKD) などの難治性腎疾患でも強く使用されています。 腎疾患に関連する合併症に対処するために、hiPSC 由来のエリスロポエチン (EPO) 産生細胞の生成に成功し、腎性貧血に対する創薬および細胞療法の開発に成功しています。 この記事では、iPSC 技術に基づく腎発生生物学と腎疾患の再生医療の現在と将来の展望を概説します。
キーワード
iPSC;腎臓再生;ネフロン前駆細胞;尿管芽;細胞療法; 疾患モデリング;カンカ・ツブロサ
序章
腎疾患は世界中で大きな医療問題と経済的負担を引き起こしていますが、ドナー臓器の深刻な不足により、腎移植以外の治療選択肢はほとんどありません。 解決策の 1 つは、胚性幹細胞 (hESC) や人工多能性幹細胞 (hiPSC) などのヒト多能性幹細胞 (hPSC) を使用した再生医療戦略を開発することです。 hPSCは無限に増殖し、腎細胞を含むあらゆる種類の細胞に分化する可能性があるため、腎再建や細胞治療などの再生医療の細胞源として期待されています。 さらに、特定の疾患を引き起こす遺伝的感受性を持つ疾患特異的 hPSC を使用して、病理学的分析や、hPSC から分化した損傷細胞タイプが in vitro で疾患表現型を複製する創薬モデルを開発できます。 この記事では、発生生物学に基づく腎臓再生研究の最近の進歩を要約し、腎臓病における再生医療と疾患モデリングの将来の展望について説明します。
腎臓の発達
腎臓は、初期胚盤葉、中間中胚葉 (IM) に由来します (図 1a)。 脊椎動物では、IM により、一次、中間、および後部の腎臓の 3 つの腎臓が順番に生じます (図 1b)。 中央の腎臓は魚類と両生類の成体の腎臓であり、後部の腎臓は爬虫類、鳥類、哺乳類の成体の腎臓です。 これらの 3 つの腎臓は、腎臓の機能単位であるネフロンで構成されているため似ていますが、ネフロンの数が異なります。 ネフロン後の成体哺乳類の腎臓は、2 つの胚組織、ネフリック後間充織 (MM) と尿管芽 (UB; 図 1 c) で構成されます。 MM は成人の腎臓のネフロンと間充織を形成し、UB は分化して集合管から膀胱の一部までの下部尿路を形成します。
図 1: 腎臓系統細胞の指示された分化。 ac 中胚葉の仕様 (a)、3 つの腎臓の形成 (b) 後腎の発達 (c) を示す概略図。 IM: 中間中胚葉。 MM: 後腎間充織。 UB: 尿管芽。
新しいクローン原性アッセイを生成することにより、糸球体足細胞や尿細管上皮細胞など、ネフロンを構成する複数の上皮細胞タイプに分化できる多能性前駆細胞が MM に含まれることを初めて実証しました。 その後、家系追跡実験により、これらの前駆細胞が転写因子Six2によって標識されていることが明らかになりました。 これらの前駆細胞は現在、腎代謝前駆細胞 (NPC) と呼ばれています。 田口ら。 は、IM が前部ドメインと後部ドメインに分割され、それぞれ UB と MM を生じさせることを実証しました。 腎臓の発生におけるこれらの発見に基づいて、hPSC から腎系譜細胞を再生する取り組みが開始されました。
腎臓系統への hPSC の指向性分化
腎臓の発生を模倣することにより、hiPSC を腎臓系統に直接分化させるための予備的手段として、我々のグループは IM 細胞の生成に焦点を当て、遺伝子編集によって IM の特異的マーカーである OSR1 遺伝子を持つレポーター hiPSC 株を生成しました。 定量的評価システムとレポーター hiPSC ラインを使用して、osr1 を発現する IM 細胞に hiPSC を誘導する効率的な分化スキームを開発しました。 これらの誘導された IM 細胞は、糸球体ポドサイトや尿細管細胞などの成体腎細胞タイプへのさらなる分化の発生の可能性を示し、マウス後部腎細胞との共培養により 3 次元 (3D) 管状構造を形成しました。
カンカ抽出物の利点
田口ら。 マウスESC（mESC）とhiPSCを後部IMを介して選択的に分化させてNPCを誘導し、in vitroで誘導されたNPCから糸球体と尿細管を含む腎単位様器官を生成する最初の方法を開発しました。 高里ら。 糸球体、尿細管、集合管、間質細胞、血管細胞など、複数の腎細胞タイプを含む腎臓様器官の生成を報告しました。 2D培養システムを開発することにより、森実ら。 hiPSC から NPC を効率的に生成し、NPC から腎代謝オルガノイドを生成しました。 最近、私たちのグループは、腎単位様器官を形成する分化能を持つ NPC に hiPSC を効率的に誘導する段階的分化法を開発しました (図 2 d、e)。 私たちの鑑別法は 6 つのステップで構成され、高里らによって報告された方法よりも NPC の自然発生過程をよりよく要約しています。 と森実ら。 そして、田口らによる 3D 培養を使用する方法よりも効率的に 2D 分化形式で NPC を生成します。
UB 系統の指向性分化に関して、田口と西中村は、mESC と hiPSC を前部 IM と腎尿細管 (ND) を介して UB 様構造に分化させました。 しかし、ND 上皮細胞は低効率で誘導され、その後の分析にはフローサイトメトリーによる ND 細胞の精製が必要でした。 pre-IM によって hiPSC から ND 上皮細胞を生成し、その後の精製なしの分化ステップを含む、より効率的な 2D 分化方法を開発しました (図 2 f、g)。 3D 培養では、誘導された ND 細胞は、RET(plus) チップと CK8(plus) ステム構造ドメインを持つ UB 様構造を形成しました。 ただし、両方のグループから生成されたUBのような構造は、限られた分岐の可能性を示しました。
図 2: d: OSR1、SIX2、および HOXD11 の hiPSC 由来のネフロン前駆細胞 (NPC) の免疫染色。e: 10 日間の気液界面培養後に hiPSC 由来の NPC から形成されたネフロン オルガノイドの免疫染色。 PODXL: ポドカリキシン (有足細胞マーカー; 白); LTL: Lotus tetragonolobus レクチン (近位尿細管マーカー; 赤); CDH1: CADHERIN 1 (遠位尿細管マーカー; 緑)。f, g: OSR1 (緑) および GATA3 (赤; f) の前部 IM 細胞、および E-CADHERIN (緑)、GATA3 (赤) および核 (青; g) の腎管細胞凝集体の免疫染色。h: 分岐 iUB オルガノイドの 7 日間の再構築中の形態変化。
最近、UB 分化方法を変更することにより、上皮極性、尿細管内腔、反復分岐形態形成を備えた誘導 UB (iUB) 様器官の生成に成功しました (図 2,3 hj)。 さらに、妊娠7週目にヒト胚の管様器官を収集することにより、これらのiUB様器官のin vivo対応器官への分化を誘導することに成功しました（図3k）。
図 3:i: RET (緑)、CK8 (赤)、および PAX2 (青) の iUB オルガノイドの免疫染色。j 管腔を示すiUBオルガノイドのトルイジンブルー染色。k: FOXA1 (白)、AQP2 (赤)、および GATA3 (緑) の iUB オルガノイドに由来するダクト様管状構造を収集する明視野 (左) および免疫染色画像 (中央および右)。 スケールバー、100 μm。 (d) と (e) は、辻本らから適応されます。 [12]、(f) および (g) ～ (k) は、Mae et al. から改作されています。 それぞれ
腎前駆細胞の拡大
基礎研究および臨床研究用に多数の腎細胞を提供するために、培養中の胚性腎前駆細胞の in vitro 増殖法が調査されました。 ブラウン等。 と谷川ら。 マウス胚におけるNPCの in vitro 拡大を報告しました。 マウスおよびヒト胚からの NPC は、Li et al. による 3D 細胞凝集培養を使用して、それぞれ 17 か月および 7 か月間 in vitro で拡大および維持されました。 このグループは、同じ方法を使用して、in vitro で hiPSC から分化した NPC を 2 か月間拡大しました。 3 つの方法はすべて骨形成タンパク質 (BMP) を使用しますが、NPC の拡大における BMP7 の役割は不明のままです。 化合物スクリーニングを通じて、Li らによって開発された bb0 拡大培養における BMP7 の代替として、JAK3 阻害剤、TCS21311 を特定しました。 そして、JAK3- stat3 シグナル伝達経路における鼻咽頭癌の拡大に対する BMP7 の阻害効果を明らかにしました。 さらに、拡大培養への TCS21311 の添加は、マウス胚および hiPSC 由来 NPC の増殖率を改善しました。
最近、iUB 様器官から分離された単一細胞が増殖して UB 先端マーカーを発現するコロニーを形成する hiPSC 由来の UB 細胞の拡大培養を開発しました。 これらの先端コロニーは、反復分岐の可能性で iUB のような器官を再構成でき、この再構成プロセスは少なくとも 3 回繰り返すことができます。
標準化されたカンザシ
腎臓の再建
腎構造の再構築に関する初期の研究では、多能性細胞塊であるアニマル キャップと呼ばれる両生類の受精卵の外胚葉領域が使用されました (図 4 a)。 守谷ら。 は、アクチビン A とレチノイン酸 (RA) 処理の組み合わせが、in vitro でアニマル キャップの前腎尿細管への分化を誘導したことを報告しました。 ブレナン等。 また、エキソソームで前腎被子植物を誘導しました。 我々は、誘導されたエキソソームが腎前細管を含み、インビトロで両生類多能性細胞から腎前組織を再生できることを実証した（図4 bd）。 前腎の in vitro 再生システムは、臨床研究に直接翻訳することはできませんが、腎臓の発達を研究するためのシンプルで有用なシステムとして役立ちます。
図 4: 腎臓構造の再構築。 a:アフリカツメガエル胚のアニマルキャップからの前腎構造の生成を示す模式図。 b – d：前腎尿細管特異的抗体（3G8、赤）を使用した、ステージ42相当のアフリカツメガエル外植片（b、c）およびステージ40幼虫（d）の全体マウント（b）および切片二重免疫染色画像（c、d）。 ）および前腎管特異的抗体（4A6、青）。
mESC および hPSC 由来の NPC から腎単位様器官を生成し、hPSC 由来の UB 細胞から管様器官を収集するのとは対照的に、Taguchi et al. 上記のように、mESC由来のNPCおよびUBと、糸球体、尿細管、および集合管を含むマウス胚から除去された間葉系前駆細胞を組み合わせることにより、マウス腎臓様器官を生成しました。 それぞれhiPSCによって誘導されたNPCおよびUB細胞の共培養により、in vitroでヒト腎臓様器官を生成しました。NPC由来の糸球体と尿細管、およびUB由来の集合管が相互接続されていました（図5 e、f）。 免疫不全マウスの上皮下腔に移植すると、これらの hiPSC 由来の腎臓様器官は宿主マウスの血管系と統合されました (図 5 gi)。
図 5:e: hiPSC からの腎臓構造の in vitro 再構成を示す概略図。 f: 足細胞 (PODXL)、近位尿細管 (LTL)、遠位尿細管および集合管 (CDH1; 左) のマーカー、ならびに PODXL および遠位尿細管および集合管 (AVPR2) のマーカーおよび収集のための 20 日目の腎臓オルガノイドの三重免疫染色ダクトのみ (CALB1; 右)。 左パネルのLTLと近位尿細管の一部にも弱いCDH1シグナルが見られたことに注意してください。 g: hiPSC からの腎臓構造の in vivo 再構成を示す概略図。 h: 宿主マウスの尾静脈からローダミン B 結合デキストランを投与した後の宿主腎臓全体と hiPSC 由来の腎臓移植片 (緑) を示す低倍率の画像。 i: ローダミン B 結合デキストランの尾静脈注射後の生体内多光子顕微鏡画像。ホスト マウスの血管内腔が hiPSC 由来の糸球体様構造に浸透していることを示しています (緑)。 スケールバー、（b）–（d）および（f）で100μm、（h）で500μm、（i）で40μm。 (b)–(d) および (e)–(i) は、Osafune et al. から改作されています。 および辻本ら、それぞれ
尿路を有する腎臓器の移植については、種間胚盤胞補完法や臓器エコトーン法など実験動物体を用いた方法が検討された。 後藤ら。 貧血 Sall1(-/-) ラットの胚盤胞に野生型 mESC を注入し、宿主ラットでマウスの腎臓を正常に生成しました。 藤本ら。 hiPSC 由来の NPC をマウス子宮胚の発達中の腎臓領域 (すなわち、器官のエコトーン) に移植し、移植された NPC がホストマウス UB に付着したホスト NPC とキメラキャップ間葉を共形成する細胞移植法を開発しました。 ただし、mm 由来の糸球体と尿細管は注入された PSC または NPC に由来しますが、残りの腎構成細胞タイプ (UB 由来の集合管や下部尿道および血管細胞など) は、両方の戦略で宿主動物に由来します。
ハーブのカンゾウ
参考文献
1. GBD 慢性腎臓病のコラボレーション。 1990 ～ 2017 年の慢性腎臓病の世界的、地域的、および国家的負担：2017 年の世界的疾病負担研究の体系的分析。Lancet。 2020;395(10225):709–33.
2. Karagiannis P, Takahashi K, Saito M, Yoshida Y, Okita K, Watanabe A, Inoue H, Yamashita JK, Todani M, Nakagawa M, Osawa M, Yashiro Y, Yamanaka S, Osafune K. 人工多能性幹細胞とその疾患および発生のヒトモデルでの使用。 生理改訂. 2019;99(1):79–114.
3. サクセン L. 腎臓の器官形成。 ケンブリッジ: ケンブリッジ大学出版局; 1987年。
4. Osafune K、Takahata M、Kispert A、Asashima M、Nishinakamura R. 新規コロニー形成アッセイによるマウス胚腎臓における多能性前駆細胞の同定。 発達。 2006;133(1):151–61.
5. 小林 A、ヴァレリウス MT、マグフォード JW、キャロル TJ、セルフ M、オリバー G、マクマホン AP。 Six2 は、哺乳動物の腎臓の発達を通じて多能性自己再生ネフロン前駆細胞集団を定義し、調節します。 細胞幹細胞。 2008;3(2):169–81.
6. Taguchi A、Kaku Y、Ohmori T、Sharmin S、Ogawa M、Sasaki H、Nishinakamura R. 後腎ネフロン前駆細胞の in vivo 起源の再定義により、多能性幹細胞からの複雑な腎臓構造の生成が可能になります。 細胞幹細胞。 2014;14(1):53–67.
7. マグフォード JW、シピラ P、マクマホン JA、マクマホン AP。 Osr1 の発現は、哺乳類の腎臓内の Osr1- 依存性ネフロン前駆コンパートメントへの漸進的な制限を受ける中間中胚葉の多能性集団の境界を定めます。 Dev Biol。 2008;324(1):88–98.
8. 前 S、庄野 A、塩田 F、安野 T、梶原 M、後藤田西村 N、新井 S、佐藤大坪 A、豊田 T、高橋 K、中山 N、Cowan CA、葵 T、小川 S、McMahon AP、 Yamanaka S, Osafune K. ヒト多能性幹細胞からの腎形成中間中胚葉のモニタリングとロバストな誘導。 ナット・コミュ。 2013;4:1367。
9. Araoka T、Mae S、Kurose Y、Uesugi M、Ohta A、Yamanaka S、Osafune K. 低分子ベースの分化法を使用した、ヒト iPSC/ESC の腎形成中間中胚葉への効率的かつ迅速な誘導。 PLoS ONE。 2014;9(1):e84881。
10. 高里 M、エル PX、チウ HS、マイヤー B、ベイリー GJ、ファーガソン C、パートン RG、ウォルベタン EJ、ルースト MS、デ スーザ C、ロペス SM、リトル MH。 ヒト iPS 細胞由来の腎臓オルガノイドには、複数の系統が含まれており、ヒトの腎形成をモデル化しています。 自然。 2015;526(7574):564–8.
11. モリザネ R、ラム AQ、フリードマン BS、岸 S、ヴァレイウス MT、ボンベントル JV. ヒト多能性幹細胞に由来するネフロンオルガノイドは、腎臓の発達と損傷をモデル化します。 ナット・バイオテクノロジー． 2015;33(11):1193–200。
12. 辻本 浩、笠原 貴、末田 成、荒岡 貴、坂本 成、岡田 成、前 志 、中島 貴、岡本 成、田浦 貴、那須 貴、清水 貴、良坂 貴、李 Z、曽根 真、池谷 真、 Watanabe A, Osafune K. モジュール分化システムは、多能性幹細胞から複数のヒト腎臓系統をマッピングします。 Cell Rep. 2020;31(1):107476.
13.田口A、西中村R.多能性幹細胞からの高次腎臓器官形成。 細胞幹細胞。 2017;21(6):730-46. e6。
14. Mae SI、Ryosaka M、Toyoda T、Matsuse K、Oshima Y、Tsujimoto H、Okumura S、Shibasaki A、Osafune K. ヒト多能性幹細胞からの分岐尿管芽組織の生成。 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． 2018;495(1):954–61.
15. Mae SI、Ryosaka M、Sakamoto S、Matsuse K、Nozaki A、Igami M、Kabai R、Watanabe A、Osafune K. 繰り返し分岐の可能性を持つヒト iPSC 由来の尿管芽オルガノイドの拡大。 セル担当者 2020;32(4):107963。
16. Brown AC、Muthukrishnan SD、Oxburgh L. ネフロン前駆細胞の合成ニッチ。 デブセル。 2015;34(2):229–41.
17. Tanigawa S、Taguchi A、Sharma N、Perantoni AO、Nishinakamura R. 胚および多能性幹細胞に由来するネフロン前駆細胞の選択的 in vitro 増殖。 セル担当者. 2016;15(4):801–13.
18. Li Z, Araoka T, Wu J, Liao H, Li M, Lazo M, Zhou B, Sui Y, Wu MZ, Tamura I, Xia Y, Beyret E, Matsusaka T, Pastan I, Rodriguez Esteban C, Guillen I 、ギレン P、カンピストル JM、イズピスア ベルモンテ JC。 3D 培養は、マウスおよびヒトの腎原性前駆細胞の長期的な増殖をサポートします。 細胞幹細胞。 2016;19(4):516–29.
19. Tsujimoto H、Araoka T、Nishi Y、Ohta A、Nakahata T、Osafune K. 小分子 TCS21311 は BMP7 を置換し、ネフロン前駆細胞の in vitro 拡大培養での細胞増殖を促進します。 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． 2020年。
20. 森谷 N、内山 H、浅島 M. アフリカツメガエルの推定外胚葉におけるアクチビンとレチノイン酸による前腎尿細管の誘導。 開発者の成長が異なります。 1993;35:123–8.
21. ブレナン HC、ニジャー S、ジョーンズ EA。 アフリカツメガエルにおける前腎グロムスの仕様と成長因子誘導性。 発達。 1999;126(24):5847–56.
22. Osafune K、Nishinakamura R、Komazaki S、Asashima M. Xenopus 外植片における前腎管の in vitro 誘導。 開発者の成長が異なります。 2002;44(2):161–7.
23. Goto T、Hara H、Sanbo M、Masaki H、Sato H、Yamaguchi T、Hochi S、Kobayashi T、Nakauchi H、Hirabayashi M. Sall1- を標的とした無腎細胞における多能性幹細胞由来マウス腎臓の生成ネズミ。 ナット・コミュ。 2019;10(1):451.
24. Fujimoto T, Yamanaka S, Tajiri S, Takamura T, Saito Y, Matsumoto N, Matsumoto K, Tachibana T, Okano HJ, Yokoo T. ネフロン前駆細胞置換システムを用いたマウス臓器ニッチにおけるヒト腎小胞の生成. セル担当者. 2020;32(11):108130.
