パート2：カルパスタチンはオートファジーの維持を通じてアンギオテンシンIlを介した有足細胞の損傷を防ぐ

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エンジェルプラスHSDは、オートファジー遮断に寄与する有足細胞のカルパイン活性を活性化します

カルパイン活性は、（i）いくつかの細胞型でAngelによって活性化され、（ii）いくつかのオートファジー関連タンパク質を切断することがわかったため、AngIIとHSDを介したオートファジー遮断がAngl誘導カルパイン活性の増加に起因するのではないかと考えました。 最初に、初代有足細胞が3つの遍在する形態のカルパインを発現していることを発見しました（図3a）。 次に、AngIIが初代有足細胞のカルパイン活性を刺激することを示しました。 カルパイン活性のこの上昇は、選択的カルパイン阻害剤によってブロックされました（図3b）。 AngIIとHSDを介したカルパインの役割を評価するために、追加のカルパスタチン導入遺伝子発現（カルパイン活性の低下につながる）を備えたノックインマウスを使用しました肝臓けがオートファジー封鎖。 CST'gマウスの初代有足細胞は、対照マウスの有足細胞と比較した場合、AngIIに応答してカルパイン活性の低下を示しました（図3c）。 したがって、有足細胞におけるカルパスタチンの過剰発現は、AngIIを介したカルパインの活性化を減少させた。

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次に、CSTTgマウスの有足細胞のオートファジーレベルを評価しました。 GFP-LC3導入遺伝子を用いてCSTマウスを作製しました。 LC 3- GFPレポーターは、オートファゴソームをGFPプラス/P62プラスドットとしてカウントすることを可能にしました。 オートファジーフラックスが遮断されると、P62は細胞内に凝集体として蓄積します。 基底状態では、CST1g GFP-LC3マウスの有足細胞では、正常な有足細胞よりもGFP + P62 +ドット（図4a、b、およびe）とP62蓄積（図4c、d、およびf）が少なくなっています。

図4|カルパスタチントランスジェニック（CST9）マウスの有足細胞におけるオートファジーフラックスの評価。 （a、b）12-週齢のGFP-LC3およびCST'GFP-LC3マウスの糸球体における緑色蛍光タンパク質（GFP）（緑）およびP62（赤）の発現の代表的な免疫蛍光画像。 矢印は、GFPとP62とオートファゴソームを示しています。 （c、d）12-週齢のGFP-LC3およびCST'9 GFP-LC3マウスの糸球体におけるP62（緑）およびポドカリキシン（PODXL;赤）の発現の代表的な免疫蛍光画像。 プライムのある図のサブパートは、倍率が高いことを示しています。 核はヘキスト（青）で染色された。バー= 50μm。 （e）有足細胞あたりのLC3プラスP62プラスドットの数の定量化。 マンホイットニー検定：**P=0。0065。 （f）糸球体セクションあたりのP62プラス面積の定量化。 マンホイットニー検定：* P=0。0420.In（e、f）、n=5GFP-LC3マウスおよびn=8CST'9GFP-LC3マウス。値が表示されます。個々のプロットおよび平均±SEMとして。 この画像の表示を最適化するには、GFP-LC3マウスでこの記事のオンライン版を参照してください。これは、カルパスタチンが豊富なマウスの有足細胞におけるオートファジーフラックスの増加を示唆しています。

オートファジーフラックスは、LC3の細胞質型であるLC 3- Iから、オートファゴソームで切断されホスファチジルエタノールアミン結合型のLC3であるLC 3- IIへの変換をウエスタンブロットで測定することにより、モニターできます。 。 CSTマウスの有足細胞は、バフィロマイシンAの存在下と非存在下の両方で、LC3-IからLC3-IIへの変換の増加とP62発現の減少を示し（図5aおよびb）、オートファジーフラックスの増加を示しています。カルパスタチン過剰発現を伴う有足細胞において。 最後に、クロロキン投与後の足細胞におけるGFP + P62 +ドットの蓄積は、GFP-LC3マウスよりもCST'g GFP-LC3マウスの方が重要であり、カルパスタチンの過剰発現がinvivoでの足細胞のオートファジーフラックスを誘導することを確認しました（図5c -e）。 要するに、我々のデータは、AngIIが有足細胞のカルパイン活性を刺激し、オートファジーが有足細胞のカルパインによって阻害され、カルパスタチン過剰発現による内因性カルパイン活性の阻害が有足細胞の自食作用フラックスを刺激するのに十分であることを示唆している。

CSTT9マウスは、AngelplusHSD誘発性の有足細胞傷害から保護されています

CSTT：マウスは何も示さなかった肝臓生後12ヶ月以上までの変化（補足図S5）。 AngIIとHSDの治療中のCST'号マウスの有足細胞傷害を分析しました。 ポドカリキシンとネフリンの異常な発現によって示されるように、WTマウスは4週間の高血圧後に軽度の糸球体硬化症と有足細胞傷害を発症しましたが、CSTTgマウスはより少ない硬化性糸球体病変を示しました（図6a

図5|オートファゴソーム分解の遮断により、カルパスタチントランスジェニック（CSTT）マウスにおける有足細胞のオートファジーフラックスの増加が確認されました。（a）LC3の発現のウエスタンブロット分析。 野生型（WまたはCST'9マウスからの初代有足細胞におけるセクエストソーム1（SOSTM1）/ P62、およびATG5。チューブリン発現は正常化として機能します。有足細胞は培養前に4時間バフィロマイシンA1（BafA1; 100 nM）で処理または未処理でした。 （b）LC 3- ll/'チューブリンおよびP62/チューブリン比の定量化。n= 10WTマウスおよびn=8CST'9マウス。値は個別のプロットとして表示されます。および平均±SEM。治療のためにペアにされた分散の双方向分析：LC 3- ll /チューブリンの場合：遺伝子型、P=0。0008;治療、P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">肝臓-international.org。

図6| カルパスタチンの過剰発現は、アンジオテンシンIl（Angel）と高塩分食（HSD）を介した有足細胞の損傷を防ぎます。 （a、b）

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AngllとHSDの6週間後の野生型（WTおよびカルパスタチントランスジェニック（CST'9）マウスからの糸球体のマッソントリクローム染色切片の代表的な画像。Bars=50 um。（c、d、f、g）エンジェルプラスHSDの6週間後のWTおよびCST'9マウスにおける（c、d）ポドカリキシン（PODXL）および（f、g）ネフリン（NPHS1）の発現の代表的な免疫蛍光画像および（e、h）関連する定量化。 {8}}ええと（ii）

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エンジェルプラスHSDの6週間後のWTおよびCSTマウスの糸球体におけるウィルムス腫瘍1（WT1;緑）およびPODXL（赤）の発現の代表的な免疫蛍光画像および（k）糸球体あたりのWT1プラス細胞数の関連する定量化セクション。 核はヘキスト（青）で染色されました。バー=50ええと。 （e、h、k）では、値は個々のプロットとして表され、平均±SEM、n =9 WTマウス、およびn =7 CSTTgマウスです。SDが等しい対応のないt検定：** P =0。0095in（e）、* P=0。0249in（h）、P=0。7891in（k）。

およびb）保存されたポドカリキシンおよびネフリンの発現（図6c-h）。 有足細胞の表現型のこのような違いは、有足細胞の核の密度がWTマウスと高血圧のCST'gマウスの間で異ならなかった段階で観察されました（図6i-k）。

同様に、高血圧の6週間後、GFP-LC3およびCST'1 GFP-LC3マウスは有足細胞傷害を示しましたが、病変はGFP-LC3マウスでより顕著でした（図7）。 尿中アルブミン対クレアチニン比は、AnglIとHSDの4週間後のGFP-LC3マウスで高かった（図7a）。 有足細胞数は2つの遺伝子型間で差はありませんでしたが、ネフリン発現はGFP-LC3（コントロール）マウスで有意に減少しました（図7b-e）。 カルパスタチンを介した保護と相関して、超微細構造分析は、AnglとHSDで処理されたGFP-LC3マウスの軽度で限局性の有足細胞の足突起の消失を示し、CST'gマウスの足突起の消失の全体的な定量化は糸球体基底膜（GBM）の長さあたりの足突起は統計的に異ならなかった。これはおそらく、足細胞の損傷が焦点であり、モデルでは分節であるためである（図7f-h）。 注目すべきは、マクロファージとTリンパ球の浸潤腎臓グループ間で差はありませんでした（補足図S6）。 まとめると、これらの結果は、カルパスタチンがAngIIとHSDによって誘発される有足細胞の損傷を防止したことを示しています。

カルパスタチンの過剰発現は、エンジェルプラスHSD治療後のマウスからの有足細胞のオートファジーフラックスを回復します

最後に、AngII plus HSDモデルでのカルパスタチンを介した糸球体保護が、有足細胞でのオートファジーの維持に関係しているかどうか疑問に思いました。 興味深いことに、足細胞におけるAnglIとHSDによって誘発されるP62の蓄積は、CSTTgおよびGFP-LC3 CST'gマウスで防止され（図8a-d）、カルパスタチンが有足細胞のオートファジーの遮断を防止したことを示しています。 注目すべきことに、オートファゴソームのGFP + P62 +ドット標識の数は、高血圧GFP-LC3およびGFP-LC3 CSTマウスの有足細胞で類似しており、AnglI+HSDが完全な停止ではなく有足細胞の自食作用の流れの減速を誘発したことを示唆しています（図8e-g）。

有足細胞タンパク質のカルパイン切断部位のinsilico予測

いくつかのインシリコツールを使用して、有足細胞の潜在的なカルパインターゲットを予測しました（補足表S1およびS2）。 3つのオンラインデータベースを比較しました：GPS-CCD、4CaMPDB、5、およびDeepCalpain。 インシリコ分析により、カルパインによって切断される可能性のあるいくつかの有足細胞タンパク質、その中のネフリンおよびポドシンが特定されました。 したがって、カルパスタチンを介した糸球体保護は、カルパインの酵素活性の低下に関連している可能性があり、一部の有足細胞タンパク質の分解の低下につながります。

さらに、少なくとも3つのオートファジー関連タンパク質がカルパインの直接の標的です。 ATG5はカルパインによって切断され、ATG 12- ATG5複合体形成の障害を引き起こします。57invivoでのカルパイン阻害剤の投与は、オートファジータンパク質Beclin-1の切断も防止しました。オートファジー関連タンパク質の推定切断部位は、カルパインがオートファジータンパク質の酵素的切断を介してオートファジーを調節できるという仮説を支持しています。

AngllとHSDで処理されたマウスの糸球体における小胞体（ER）と酸化ストレスマーカーのmRNA発現

小胞体（ER）ストレスと酸化ストレスをAngIIとHSD治療中の糸球体の定量的PCRによって評価しました（表1）。 ベースラインでは、glomeruli5loxloxマウスで分析された遺伝子のmRNA発現に変化は見られませんでした（WTおよびNphs2.cre Atg5図S7の補足）。 高血圧の6週間後、Nphs2からの糸球体。 cre Atg5loxloxマウスは、WT糸球体と比較してSod1、Prdxl、Atf4、Gpxl、およびHsp90b1の発現が増加し、ERストレスおよび酸化ストレス経路の遺伝子の異なるmRNAプロファイルを示しました。 ERストレスと酸化ストレス。 逆に、CSTマウスの糸球体は、ERストレスおよび酸化ストレス経路のいくつかの遺伝子のダウンレギュレーションと、いくつかのアポトーシス促進遺伝子の発現低下を示しました（図9）。

まとめると、これらの結果は、カルパスタチンの過剰発現が、AngIIに加えてHSDによって誘発されるERおよび酸化ストレスを減少させることによって糸球体損傷を防ぐことができることを示しています。

討論

本研究では、AngIIとHSD誘発性高血圧症において、有足細胞のオートファジーが著しくダウンレギュレーションされることを示しました。 さらに、Atg5のポドサイト特異的欠失を有するマウスは、AngIとHSDによって誘発される糸球体硬化症およびポドサイト喪失を起こしやすく、したがって、ポドサイトにおけるオートファジーが高血圧性腎症の発症を予防することを示し、AnglとHSDによって誘発されるポドサイトにおけるオートファジーの重要な役割を強調しています。けが。 細胞のオートファジーを調節する細胞外刺激についてはほとんど知られておらず、これらの結果は、AngIIによる有足細胞のオートファジーの病態生理学的調節に光を当てています。

ほとんどのヒト糸球体障害では、有足細胞の足突起の消失は、タンパク尿につながる糸球体損傷の特徴です。 これらの最終分化細胞はストレスがない場合でも高率のオートファジーを示すため、オートファジーは有足細胞の機能を維持する上で重要な役割を果たす可能性があります。 以前の研究では、Angiは条件付きで不死化したマウスポドサイト細胞株で活性酸素種の生成を通じてオートファジーを促進することが示されました5。調査結果は不明です。 この後者の研究とは異なり、我々は、ネズミ細胞株ではなく、ポドシンおよびネフリンの発現およびインビボアプローチを保持するネズミ初代培養有足細胞を使用した。 有足細胞が異常に高いレベルの構成的オートファジーを示すという以前の報告を確認します。 リソソーム阻害剤の存在下または非存在下でのAngII刺激後のLC3-IIの増加量の測定は、決定するために必要です。

オートファジーフラックスが増加するかブロックされるか。 以前の研究はこの現象を無視していました。

ここでは、AnglI灌流とHSDに基づく高血圧モデルを使用しました。 有足細胞はATI受容体を示し、AngII1,6,26などの遊離濾過ペプチドに曝露されます61-6 RAAS阻害の観察された腎保護効果は、この有足細胞の遮断が原因である可能性があります。 -特定のRAAS。 同様に、invivo研究

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