パート2:エキナコシドは、ROS / ATF3 / CHOP経路調節を介してMPP +誘発ニューロンアポトーシスから保護します
Mar 04, 2022
エキナコシドROS/ATF3/CHOP経路調節によるMPP+誘発性ニューロンアポトーシスに対する保護
清趙1 • シャオヤンヤン2 • ディンファン・カイ3,4 • リン・イェ5,6 • ユーチン・ハウ1 •
Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1
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免疫蛍光染色
1ミリモル/L MPP?, 40 LG/mL ECH, またはMPPの組み合わせ?とECH。次いで、細胞をブロッキングバッファー(PBS中の3%BSA)中で室温(RT)で30分間インキュベートした。次いで、抗ATF3、抗CHOP、または抗切断カスパーゼ3抗体をブロッキング緩衝液(PBS中の1%BSAおよび0.3%Triton X-100)中で1:100に希釈し、4Cで一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、細胞をRTでAlexa 488-ヤギ抗ウサギIgG(ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア州)と共にインキュベートした。
1時間。核はヘキスト33342で染色した。画像は共焦点顕微鏡(ライカSP8、ヴェッツラー、ドイツ)で撮影した。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイ
我々は、ブレグマ-2.92nmから-3.64mmまでのSNcを通して、10番目のコロナ切片(合計14〜15個)ごとに染色した。
各グループの同じレベルのSNcを通る4つの典型的なセクションがTHおよびTUNELカウントに使用された[10]。TUNELアッセイは、製造者の指示に従って、in situ細胞死検出キット(Roche、Rotkreuz、スイス)を用いて組織切片におけるアポトーシスを分析するために実施した。DNA標識後、切片を抗TH抗体による免疫蛍光染色に用い、共焦点顕微鏡(ライカSP8、ヴェッツラー、ドイツ)で画像を撮影した。マウス脳アトラス[20]に従って低倍率(109対数)でSNcを描写した後、TH-陽性細胞およびTH/TUNEL二重陽性細胞を、治療に盲目の2人の観察者によってより高い倍率(209対数)で計数した。TH/TUNEL二重陽性細胞とTH陽性細胞の比率を計算した。
チスタンチェエキナコシドは持っています抗炎症プロパティ
統計分析
すべてのデータは平均±SDとして提示され、続いてテューキーのHSDによる事後分析とスチューデント-ニューマン-キュールズ多重比較検定が統計目的で実施されました。P \ 0.05の値は統計的に有意であると考えられた。
業績
ECHはROS製品を減少させ、減衰させる
MPP1誘発性アポトーシス
ECHは、動物モデルにおけるアポトーシスからニューロンを保護し、神経芽細胞腫細胞における炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させることが示されている[12]。ECHがMPPによって誘導されるニューロンアポトーシスを直接調節するかどうかは不明のままです。我々のデータは、ECHがSH-SY5Y細胞の増殖または死に影響を与えず(図1B)、その形態は変化しなかったことを示した(図1C)。興味深いことに、SH-SY5Y細胞をMPPに曝露した後、ECH治療後(10〜40lg/mL)の生存率は用量依存的に増加した(図1B、C)。
以前の研究は、MPPが示している?ミトコンドリアの電子輸送鎖を特異的に阻害し、ROS生成にも関連している[6, 21]。DCFH-DAを蛍光プローブとして用いてROSレベルの変化を評価すると、ECHがMPP誘導性ROS生成を顕著に抑制することを見出した(図2A)。共焦点顕微鏡観察により、ROS産物の減少がECHレベルと関連していることが明らかになった(図2C)。ECHはまた、ROSから細胞膜を保護し、脂質過酸化の最終産物であるMDAレベルを低下させることも示された(図2B)。まとめると、
ECHは、ニューロンにおけるMPP誘導ROS産物を減少させることによって細胞生存を促進する。
ECHはROSストレス関連/MPP1誘導遺伝子発現を抑制し、GDNFを増加させる
MPP1処理細胞における発現
ROS産物は、折り畳まれていないタンパク質応答を刺激し、ATF3、ATF4、およびCHOPを含むストレス関連遺伝子の発現を誘導することが示されている[22]。ATF3とCHOPは、ストレス誘発性ニューロンアポトーシスにおいて特に重要な役割を果たしている[9, 23]。異常なa-シヌクレイン発現もまた、PD病理における重要なマーカーの1つである[2]。qRT-PCRを用いて、MPPにおけるATF3、CHOP、SNCA、およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の発現を解析した。細胞モデルとMPPを発見した?PBS対照群と比較してATF3、CHOP、およびSNCAの発現を有意に増強した。ECHは、MPPで処理されなかったSH-SY5Y細胞におけるこれらの遺伝子の発現に影響を及ぼさなかった。しかし、ECHはMPP誘導性発現を消失させた(図3)。さらに、MPPは?SH-SY5Y細胞におけるGDNFの発現を有意に抑制したが、ECHはこの現象を部分的に逆転させた(図3B)。
ECHはSH-SY5Y細胞におけるMPP1誘導カスパーゼ-3活性化を阻害する
高レベルのATF3およびCHOPは、ニューロンアポトーシスを直接促進する[9, 23]。我々のデータは、ECHがATF3およびCHOP発現を用量依存的に阻害することを示した(図4A)。ECHはまた、MPPを遮断?誘導カスパーゼ-3を遮断した
活性(図4A、B)。カスパーゼ-3の切断形態の免疫蛍光分析はさらに、ECHがMPP?処理細胞における切断されたカスパーゼ-3タンパク質発現を著しく減少させることを示した(図4C)。
ECHがSH-SY5Y細胞におけるMPP1誘導ATF3およびCHOP蓄積を逆転させる
環境毒素への曝露後、ATF3およびCHOPタンパク質は細胞質および核に局在し[24, 25]、これはアポトーシスをもたらす。私たちの結果は、MPPが示唆?治療は核内のATF3およびCHOP発現を増加させ、ECHはこのプロセスを効果的に減弱させた(図5A、B)。ウェスタンブロッティング分析は、MPPが?細胞質および核における両方のタンパク質のレベルが著しく増加した。興味深いことに、ECHはMPPを廃止しましたか?効果および核内のATF3およびCHOP蓄積を抑制した(図5C−E)。
ATF3はSH-SY5Y細胞におけるMPP1誘導性アポトーシスにおいて重要な役割を果たしている
ATF3はSH-SY5Y細胞においてアポトーシスを誘導することが示されており[23]、本研究の結果は、ECHがMPPによって誘導されるATF3 mRNAおよびタンパク質発現を有意に抑制することを示している。これらのセルで。しかしながら、細胞生存のアポトーシスおよびECH保護におけるATF3の役割は不明のままであった。そこで、ATF3に特異的な低ヘアピンRNA(shRNA)を用いて調べたところ、正常条件下でのATF3ノックダウン群と対照群の生存率に差は認められませんでした(図6A)。しかし、ATF3抑制やECH治療はMPPによって誘発される形態変化を有意に救出した?(図6B)。ATF3ノックダウン細胞は、MPPへの曝露後の対照群よりも高い生存率を有していた?(図6C)。CHOPおよび活性化カスパーゼ-3のタンパク質レベルは、ATF3ノックダウン細胞においてより低かった。
非特異的shRNAを有する対照細胞において(図6C、D)。これらのデータは、ATF3が神経芽細胞腫細胞のMPP誘導性アポトーシスにおいて重要な役割を果たしていることを示した。したがって、これらの結果は、ECHがROS/ATF3/CHOP経路のダウンレギュレーションを介してMPP誘発効果からSH-SY5Y細胞を保護するという仮説を支持している。興味深いことに、我々のデータは、ECHがSH-SY5Y細胞におけるp53およびPUMA(アポトーシスのp53アップレギュレートモジュレーター)レベルのMPP?誘導性増加も阻害することを示した(図7)。
チスタンチェエキナコシド強化する効果があります免疫
ECHは、アポトーシスからDAニューロンを保護します
インビトロでMPP1によって、またはインビボでMPTPによって誘導
PDにおけるECHの作用を確認するために、初代DAニューロンをMPPで処理した?またはMPPですか?とECH。インビトロ実験により、MPPが明らかになったのは?DAニューロンの生存率を有意に低下させ、これはECHによって防止された
(図8)。我々はさらに、MPTP-誘導PDおよび対照を有するマウスにおける異なる処置後のSNcにおけるDAニューロンにおけるアポトーシスを評価した。コントロールではMPTP群よりも多くのTH陽性ニューロンがこの領域で見出された(図9A)。TUNELアッセイは、NSおよびECHがSNcのDAニューロンにおいてアポトーシスを誘導しないことを示したが、MPTPおよびECHはニューロンをそれに対して保護した(図9B、S2)。興味深いことに、PDのマウスモデルからのSNcの溶解物のウェスタンブロッティングは、ATF3およびCHOPタンパク質レベルもECHによって減少したことを示した(図10)。
チスタンチェエキナコシド持っている抗アポトーシス効果
