パートⅠ：低輝度の青色光誘発性変性網膜症に対するカンカニクジュヨウ抽出物の新しい保護効果
Mar 04, 2022
連絡先：オードリー・フーaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao、Yu-Wen Cheng
薬学部、薬学部、台北医科大学、台北、眼科、台北医科大学、台北、薬理学部、医学部、医学部、台北医科大学、台北、医学研究科、大学医学、台北医科大学、台北、Ph.D。 台湾台北医科大学薬学部バイオテクノロジー研究開発プログラム
概要
背景/目的：青色発光ダイオード光（BLL）によって誘発される光毒性は、眼疾患において重要な役割を果たし、ヒト網膜色素上皮（RPE）細胞の網膜変性とアポトーシスを引き起こします。カンカニクジュヨウエキス（CTE）多くの有益な保護特性を持つ伝統的な漢方薬です。 ただし、CTEの眼の保護の役割を調べた研究はほとんどありません。 この研究では、invitroおよびinvivoでのBLL誘導アポトーシスに対するCTEの影響の根底にあるメカニズムを調査しました。 方法：RPE細胞は現在のin vitro研究に適用され、細胞生存率は3-（4、5-ジメチルチアゾール- 2-イル）-2、{{6}によって決定されました。 }ジフェニルテトラゾリウムブロミドアッセイ。 アポトーシス関連タンパク質の発現は、ウエスタンブロット分析と免疫蛍光染色によって決定されました。 ドブネズミを使用して、invivoで市販のBLLへの曝露を調べました。 ヘマトキシリンおよびエオシン染色、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）、およびウエスタンブロットアッセイを使用して、網膜の形態学的変形を調べた。 結果：CTEは、過酸化水素、tert-ブチルヒドロペルオキシド、アジ化ナトリウム、およびBLLによるRPE損傷を有意に抑制しました。 さらに、CTEは、免疫蛍光染色で示されるように、アポトーシス経路を不活性化することにより、BLL曝露後の切断されたカスパーゼ-3やTUNEL染色などのアポトーシスマーカーの発現を減少させました。 さらに、CTEは、RPE細胞におけるc-Jun N末端キナーゼ、余分なシグナル関連キナーゼ1/2、およびp38のBLL誘導性リン酸化を阻害しました。 インビボで、CTEの経口投与は、60-日の周期的なBLL曝露によって誘発される網膜の厚さの減少を救い、ドブネズミモデルのTUNEL陽性細胞の数を減らしました。 結論：CTEはBLL誘発性光毒性に対する潜在的な予防薬です
序章
加齢性黄斑変性症（AMD）の研究では、世界の人口の8.7％がこの病気に苦しんでいると報告されています[1]。 AMDは、光受容体の変形、網膜色素上皮（RPE）の萎縮、神経節細胞のアポトーシス、および高齢者の中心視力喪失を引き起こす神経変性疾患であり、世界的な社会的負担になりつつあります。 AMDはドライフォームまたはウェットフォームのいずれかに分類されます[2、3]。 技術の進歩により、人々は最新のデジタルデバイスの使用により多くの時間を費やすようになり、その結果、人々は長期間にわたって青色光（BL）の放出にさらされています。 ただし、網膜のBL誘発光毒性の問題は十分に調査されていません。 短波長BL（450〜495 nm）に過度にさらされると、スーパーオキシドやヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種（ROS）が生成され、酸素消費量が増加し、ミトコンドリアDNA損傷が誘発されます。 ROSの蓄積は、酸化ストレスとレチノイド付加物の広範な蓄積をもたらし、網膜をさらに損傷します[4]。 研究によると、酸化ストレスは乾性黄斑変性症の病因の主要な要因であることが示されています[5]。 さらに、BL照射は、Bax / Bcl -2タンパク質相互作用を媒介し、内因性ROS産生を促進することにより、スーパーオキシドジスムターゼやカタラーゼなどの網膜抗酸化酵素の発現を減少させます。 このように、RPE細胞と光受容体の外節ミトコンドリアはBL照射によって誘発される損傷に苦しんでいます[6、7]。 ROSの生成に加えて、BL照射はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）を活性化します。これは、細胞の生存とアポトーシスに重要な役割を果たします。 Baxやカスパーゼ-3などのミトコンドリア依存性アポトーシス関連アポトーシス促進タンパク質は、c-Jun N末端キナーゼ（JNK）およびp38経路を介したBL発光ダイオード光（BLL）照射によって活性化されます。 RPEおよび網膜神経節細胞[8]。 さらに、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）/ Aktおよび核因子赤血球2-関連因子2（Nrf2）依存性抗酸化経路は、RPE細胞の防御システムの構成要素です[{{34} }]。
カンカニクジュヨウエキス（CTE）フェニルエタノイド配糖体誘導体を含み、何十年もの間伝統的な漢方薬として使用されてきました。 エキナコシド、アクテオシド、およびイソアクテオシドは、神経保護、記憶増強、免疫調節、および抗肝硬変の特性を有することを特徴とするCTEの3つの主要な活性化合物です[13、14]。 エキナコシドはROSスカベンジャーであり、パーキンソン病の動物モデルで1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン（MPP plus）が誘導するアポトーシスから保護します[15、16]。 アクテオシドは、アミロイド- -によって誘発される神経毒性から保護し、細胞質から核へのNrf2の移行と抗酸化応答エレメントへの結合に起因する、リポ多糖刺激による炎症を軽減します。 ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプトなど、現在利用可能なウェットAMDの治療法は、過剰な血管新生を抑制するために使用されています[17、18]。 しかし、この病気の複数の病理学的合併症のために、乾性AMDの効果的な治療法は存在しません。
この研究では、RPE細胞とブラウンノルウェー（BN）ラットにおけるCTEの保護効果を示しています。 さらに、CTEの保護効果を評価するために、invitroモデルとinvivoモデルの両方に長期の低輝度BLL曝露を適用しました。 我々は、CTEがBLLへの曝露後にアポトーシス関連タンパク質の発現を減少させることを発見しました。 さらに、CTEは、低輝度BLLに長期間曝露した後、BNラットの網膜における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）陽性細胞の数を減少させました。 この研究は、CTEの新しい抗アポトーシス効果へのさらなる洞察と網膜変性の治療のための新しい戦略に関する情報を提供します。
Cistanche tubeulosa抽出物（CTE）：フェニルエタノイド配糖体
材料および方法
化学薬品および製品
CTEは、Sinphar Pharmaceutical Company（Yilan、Taiwan）から惜しみなく提供されました。 In situ細胞死検出キット（カタログ番号11-684-817-910）は、Roche（Mannheim、Germany）から購入しました。
RPE細胞培養
RPE細胞（ARPE{{0}}およびATCC®CRL-2302™）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州マナッサス）から購入し、ダルベッコの改良イーグル培地（ギブコ、グランドアイランド、 NY）37度で5％CO2の加湿雰囲気で10％ウシ胎児血清を補充。 19〜3継代のARPE -19細胞0は、10- cm細胞培養皿（Orange Scientific、Braine-l'Alleud、ベルギー）で維持されました。 0.05パーセントのトリプシン-エチレンジアミン四酢酸（Gibco）で継代すると、細胞を1：4の比率で再播種しました。 テストの前に、ARPE -19細胞を48-ウェルプレート（Orange Scientific）に播種し、細胞生存率分析のために1.0×105細胞/mLの密度で6-cmディッシュ（Orange Scientific）に播種しました。 ）2.0×105細胞/mLの密度で24時間のウエスタンブロッティング分析用。 ARPE -19細胞が80％のコンフルエンシーに達した後、以下の実験を行いました。
薬物治療および細胞生存率アッセイ
19〜30継代のRPE細胞を48-ウェルプレートに播種し、さまざまな濃度のCTE、過酸化水素（H2O2）、tert-ブチルヒドロペルオキシド（t-BHP）、アジ化ナトリウム（t-BHP）で24時間共処理しました。 NaN3）。 次に、細胞を3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）とともに最終濃度1mgで培養しました。 /mLおよび30分間インキュベートします。 次に、ジメチルスルホキシド（200 µL）を各ウェルに加えて細胞を溶解しました。 Sunrise™分光光度計酵素結合免疫吸着アッセイリーダー（MRX-TC; Dynex Technologies、バージニア州シャンティリー）を使用して、570nmで吸光度を測定しました。 適切なブランクを差し引くことにより、バックグラウンド吸光度の値を補正しました。 データは5つの独立したアッセイからのものです。
InvitroBL曝露プロトコル
以前の研究[19]で説明されているように、光源とセルプレートは25cm離して配置されました。 輝度は露出計（LM -81 LX; Lutron Electronic Enterprise、台北、台湾）で測定しました。 BLLは、実験計画に応じて、示された時間（0〜48時間）で46 0 nm（60ルクス）でピークに達しました。
ウエスタンブロッティング
0 – 48- hのCTEおよびBLL曝露による同時処理後、細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、放射性免疫沈降アッセイ溶解バッファー（1％ノニデット）に再懸濁しました。 P -40、50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM Na3VO4、1 mMエチレングリコール-ビス（-アミノエチルエーテル）-N、N、N'、N'-四酢酸、1 mM NaF 、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル）。 細胞溶解物は、12、000×gで35分間の遠心分離によって得られ、上清を収集して、Bradford試薬（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を介してタンパク質濃度を決定しました。 等量のタンパク質サンプルを10〜12パーセントのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデンメンブレンに転写しました。 膜を5％の無脂肪乳でブロックし、Tween 20（TBST）を含むトリス緩衝生理食塩水で1時間インキュベートした後、切断されたカスパーゼ-3、ホスホ-JNK、JNKに特異的な一次抗体を用いてイムノブロッティングを行いました。 、ホスホ-p38、p38、ホスホ細胞外シグナル関連キナーゼ（ERK）、ERK、Bcl -2、Bax、デスドメインを持つFas関連タンパク質（FADD）、カスパーゼ-8（GeneTex、Irvine 、CA）、Fas-ligand（Abcam、ケンブリッジ、英国）、およびb-actin（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO）。 次に、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（TBSTで1：6000; Cayman Chemical、ミシガン州アナーバー）と室温で1時間インキュベートしました。 強化された化学発光キット（Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して、b-アクチンに正規化した後、各ブロットのバンドの強度をImageJソフトウェアで分析しました。
免疫蛍光
RPE細胞をPBS中の4％パラホルムアルデヒドで15分間固定しました。 次に、PBS中のTriton X -100（0 .2パーセント）を15分間細胞に添加し、続いてPBS中の5パーセントウシ胎児血清を30分間添加しました。 次に、細胞を抗切断型カスパーゼ-3抗体と1：250の比率で24時間インキュベートしました（Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ダンバーズ）。 ヤギ抗ウサギIgG二次抗体（Dylight 594）を1：200の比率で使用しました（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）。 細胞核を4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI; AAT Bioquest、カリフォルニア州サニーベール）で染色しました。 蛍光の変化は、レーザーCS SP5共焦点スペクトル顕微鏡イメージングシステム（ライカ、テバンガーデン、シンガポール）で観察されました。
TUNEL染色
TUNELアッセイで検出できるDNAフラグメントは、アポトーシスの重要な特徴です。 In Situ細胞死検出キット（カタログ番号11-684-817-910; Roche）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってアポトーシスプログラムされたRPE細胞死を測定しました。 簡単に説明すると、RPE細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、酵素反応でDNA鎖切断を標識して、緑色蛍光染色を示したTUNEL陽性細胞を検出しました。 次に、染色された細胞をスキャンし、Tissue FAXS-plus Imaging System（TissueGnostics、ウィーン、オーストリア）で分析しました。 ゲートRPE領域で1万件のイベントをカウントし、TissueQuest / HistoQuestソフトウェア（TissueGnostics）を使用してTUNEL陽性細胞の数について画像を分析しました。
動物実験
雄のBNラット（体重300〜350 g）は、国立研究所動物センター（台湾、台北）から購入し、2〜3か月間飼育しました。 ラットは、12- h / 12- hの明暗サイクルで、26±1度、相対湿度比35〜47％、水と餌を自由に摂取できる状態で維持されました。 未処理のラットは、対照として機能するように暗所で維持された。 研究プロトコルは、台北医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました（承認番号：LAC -2016-0442）。 動物の使用を含むすべての実験手順は、眼科および視覚実験研究における動物の使用に関する視覚および眼科学研究協会の声明に準拠していました。
網膜変性のBLL誘発ラットモデル
以前の研究[19]で説明されているように、網膜変性の周期的な低輝度の長期BLL曝露誘発モデルを使用しました。 簡単に言えば、BNラットは3つのグループに分けられました。 瞳孔散瞳（460 nm、150ルクス）なしで1日3時間、60日間、暗所で定期的なBLLに曝露されたBLL曝露群。 CTE治療とBLL曝露群は、CTE（100 mg / kg体重）で14日間前処理され、その後、定期的なBLL曝露で1日3時間60日間同時治療されました。 すべてのラットを動物のコロニーに戻し、実験期間の終わりに通常の明/暗サイクル（250ルクス、12時間/ 12時間）を再開した。
統計分析
一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定および多重比較検定を使用して、有意差を計算しました。 統計的有意性は、のp値によって決定されました。<>
カンカニクジュヨウ製品
結果
CTEはRPE細胞を酸化ストレスによる損傷から保護します
MTTアッセイを介してCTEの細胞毒性を評価するために、いくつかの濃度のCTE（{{{{2 0}}}} – 5 0 0 ug / mL）をRPE細胞に適用しました。 CTE処理は、テストしたどの濃度でもRPE細胞の生存率に明らかな毒性作用はありませんでした（図1A）。 したがって、その後の実験では50および100 ug /mLCTEを使用しました。 CTEの抗アポトーシス効果を調査するために、さまざまな酸化誘導剤（H2O2、t-BHP、およびNaN3）をCTEとRPE細胞に24時間同時投与しました。 H2O2、NaN3、およびt-BHPは、細胞生存率を低下させ、RPE細胞を用量依存的に損傷させました（破線のバー、図1B、1C、および1D）。 細胞生存率は、0.03 mM H2O2、0.3 mM NaN3、および0.3mMt-BHPで処理した細胞の方が対照群よりも有意に低かった。
ただし、50および100 ug / mL CTEとの同時処理は、H2O 2-、NaN 3-、およびt-BHPによって誘発されるRPE細胞損傷を軽減し、細胞生存率の低下を逆転させました（黒いバー、図。1B、1C、および1D）。 上記のデータは、CTEがRPE細胞を酸化ストレスによる損傷から救うことを示唆しています。
CTEはBLL誘発性RPE細胞死を阻害します
以前の研究では、BLLがRPE細胞に対して細胞毒性を示すことを発見しました。これは、Bcl-2とBaxの発現の変化に起因するものです。 本研究では、BLL誘発性RPE細胞損傷に対するCTEの保護効果をさらに調べた。 細胞培養インキュベーターに2枚の青いエレクトリックLEDプレートを置きました。 光源とセルプレートの間の距離は25cmで、露出計で測定した場合、BLL強度は60ルクスでした（図2A）。 MTTアッセイは、さまざまな期間（6〜48時間）のBLL曝露が、時間依存的にRPE細胞死を引き起こしたことを示しました（図2B）。 細胞をCTE（100 ug / mL）で同時処理した場合、24時間後および48時間後のBLLによる細胞生存率の低下は大幅に減衰しました（図2C）。 これらのデータは、CTEがRPE細胞をBLL誘発性の光毒性から保護することを示唆しています。
CTEは、Bcl -2/BaxおよびFas/FasL経路を調節することにより、RPE細胞におけるBLL誘導アポトーシスを阻害します
RPE細胞におけるCTEの潜在的な保護効果に基づいて、このプロセスにおけるCTEの関与の可能性をさらに調査しました。 2つのアポトーシスシグナル伝達経路、すなわちBax /Bcl{{0}}およびFas/Fasリガンド（FasL）経路、および関連タンパク質（例えば、プロカスパーゼ-8およびプロカスパーゼ）を調べた。 -3;図3Aおよび3B）。 BILL曝露（6〜48時間）は、Bax / Bcl -2、FasL、およびFADDのタンパク質発現を時間依存的にアップレギュレーションすることがわかりました（図3A）。 さらに、BLLはプロカスパーゼ-3とプロカスパーゼ-8のタンパク質発現をダウンレギュレーションし、BLL曝露後のカスパーゼ-3とカスパーゼ-8のより多くの切断型をもたらしました。以前の研究[19]。 CTEの保護効果をさらに評価するために、さまざまな濃度のCTEをBLLに曝露されたRPE細胞に適用しました（図3B）。 48- hのBLL曝露後、CTE（5 0 µg / mL）はBax /Bcl-2比を減少させました。 さらに、CTE（1 0 0 µg / mL）は、FasLおよびFADDのタンパク質発現を減少させましたが、プロカスパーゼ-8およびプロカスパーゼ-3のレベルを大幅に増加させました（図。 3Cおよび3D）。 研究によると、カスパーゼ-3の活性化はRPE細胞のアポトーシスのマーカーであることが示されています[20]。 CTEの保護効果をさらに確認するために、切断されたカスパーゼの免疫蛍光染色を行いました-3。 48時間のBILL曝露は、カスパーゼ-3の切断と核への移行を誘導し、RPE細胞のアポトーシスを引き起こすことがわかりました（黄色の矢印、図4A）。 ただし、BLLに曝露された細胞をCTE（100 µg / mL）で同時処理すると、BLLが誘導する切断型カスパーゼ-3の発現が阻害されました。 CTEの抗アポトーシス効果をよりよく理解するために、TUNEL染色を使用してRPE細胞のDNAフラグメントを検出しました。 48-時間のBLL曝露後、TUNEL陽性細胞は1.78±0.36パーセントから23.82±0.33パーセントに増加しました。 この効果は、CTEとの同時治療によって弱められました（23.82±0.33パーセントから2.22±0.11パーセント;図4B、4C、および4D）。 これらの結果は、CTE治療がBax /Bcl-2およびFasL/FADD経路を媒介することにより、RPE細胞をBLL誘導アポトーシスから強力に保護することを示しています。
CTEは、RPE細胞におけるストレス応答タンパク質のBLL誘発性リン酸化を阻害します
以前の研究では、ERK、JNK、p38 MAPなどのMAPK経路が、紫外線またはBLへの曝露後にRPE細胞および網膜で活性化されることが示されています[21、22]。 したがって、BLL曝露後のMAPKストレス応答経路に対するCTEの調節効果を調査するために、100 µg / mLのCTEをさまざまなBLL曝露時間でRPE細胞に適用しました（図5A）。 ウエスタンブロット分析は、リン酸化されたERK、JNK、およびp38がBLL曝露で活性化されたが、RPE細胞でのCTEとの同時処理では有意に阻害されたことを示しました（図5B）。 上記の結果は、CTEがBLLによって誘発されるRPE細胞の損傷を阻害することを示しています。これは、RPE細胞におけるMAPKの阻害に関連している可能性があります。
CTEは、ラットモデルでの長期の定期的な曝露後のBLL誘発性網膜損傷を救済します
CTEの保護効果を評価するために、BNラットを6 0日間の長期BLL曝露に曝露し、CTEの効果を評価しました。 図6Aに示す概略図に示すように、BNラットは、対照群、BLL曝露群、およびCTEとBLL群の3つの群に分けられました（図6A）。 CTEとBLLのグループでは、BNラットにBLL曝露前の14日間、1日1回強制経口投与によりCTE（100 mg / kg体重）を継続的に補給しました。 0日目に、BNラットをCTE（100 mg / kg体重）で同時処理し、BLLに1日3時間60日間暴露した。 BLL曝露の60日後、ウエスタンブロット分析および免疫組織化学染色のために動物を犠牲にした。 CTEとBLLのグループでは、ラットの眼のホモジネートにおけるプロカスパーゼ-3タンパク質の発現は、BLLグループよりもCTE治療後の方が高かった（図6Bおよび6C）。 これらのデータは、CTEが切断されたカスパーゼの活性化を阻害することにより、長期的な低輝度のBLL誘発性網膜光毒性とアポトーシスを防止することを示しています-3。 免疫組織化学染色は、網膜の構造と生理学的経路に対するCTEの保護効果に関するより多くの証拠を提供しました（図7）。 さらに、BLL曝露後、内側ニューロン層が減少し、外側網膜層（ONL）で形態学的変形が観察されました。これには、中央網膜と末梢網膜の両方の内側セグメント/外側セグメントが含まれます。これは、以前の研究と一致しています（図7B）。 重要なことに、CTEは、CTEとBLLのグループで、RPE細胞の変形、神経細胞の損傷、および網膜の全体的な菲薄化を防ぎました（図7C）。 さらに、正常ラットの中枢および末梢網膜ではTUNEL陽性細胞は観察されませんでした（図8Abおよび8Bb）。 逆に、60日間のBLL曝露後、TUNEL陽性細胞が中枢および末梢網膜のONLで頻繁に検出されました（図8Aeおよび8Be）。 網膜中心部のONLのDAPI染色は、BLLグループで著しく減少しました（図8Ad）。 しかし、CTEとBLLのグループでは、TUNEL陽性細胞の存在が弱まり、中枢および末梢網膜ONLのDAPI染色が増加しました（図8Aiおよび8Bi）。
カンカニクジュヨウ製品
