高速剪断ホモジナイズ抽出によるシスタンチェ・チューブローザからのフェニルエタノイド配糖体の抽出

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ウェンジン・ペイとルイリ・グオ

バックグラウンド：

チスタンチェ・チューブローザ新疆ウイグル自治区発祥の有名な漢方薬です。北アフリカ、インドなどに広く分布しています。目的:の主要な生理活性成分C. チューブローザフェニルエタノイド配糖体(PhGs)である。エキナコシドおよびアクテオシドは、PhGsの決定のための指標成分であり、主に肝臓保護、免疫保護などに使用される。したがって、C. tubulosaからPhGsを抽出することは非常に重要です。方法:本研究では、超音波支援抽出(UAE)、マイクロ波支援抽出(MAE)、および高速剪断均質化抽出(HSHE)法を比較した。さらに、HSHE法の抽出条件を最適化した。結果:その結果,HHE法はUAE法,MAE法のいずれよりも優れており,HHEの最適な抽出パラメータは,エタノール濃度50%,抽出温度70°C,回転数16000rpm,抽出時間2分,固液比1:9,抽出サイクル1回であった.エキナコシドおよびアクテオシドの収率はそれぞれ1.366%および0.519%であり、エキナコシドおよびアクテオシドの移動率はそれぞれ87%および94%に達した。結論:HSHE法は,C. tubulosaからPhGを抽出するための単純,迅速,効率的な手法であると結論づけることができる.ハイライト:C. tubulosaからのPhGの抽出のために、効率的で環境に優しいHSHE法が研究されています。C. 尿細管からPhGsを抽出するためのHSHE法の最適条件が得られた。この研究は、PhGsの工業的抽出のための新しい方法を提供しますC. チューブローザ.

チスタンチェ・チューブローザ

チスタンチェ・チューブローザ新疆ウイグル自治区に起源を持つ一般的な漢方薬です。北アフリカ、アラビア半島、パキスタン、インドに広く分布しており、2010年に中国薬局方に正式に記録されました。の主な生理活性成分C. チューブローザはフェニルエタノイド配糖体(PhGs)であり、エキナコシド、アクテオシド、イソアクテオシド、および2-アセチルアクテオシドを含む水溶性天然物のクラスである(1,2)。PhGsの構造は桂皮酸部分とヒドロキシフェニルエチル部分からなり、どちらもそれぞれエステル結合とグリコシド結合を介してβ-グルコピラノースに結合している(3)。薬理学的研究は、C. tubulosaのPhGが抗疲労(4)、神経保護(5-7)、肝臓保護(8-10)、および免疫保護効果(11)のような多くの薬効機能を有することを示している。したがって、C. tubulosaからのPhGの効果的な抽出は、天然物の開発および利用にとって大きな意義を有する。

PhGの現在の伝統的な抽出方法は、熱逆流抽出、超音波支援抽出(UAE)、およびマイクロ波支援抽出(MAE; 12-16)である。これらの方法には、低効率、長い抽出時間、および高いコストなどのさまざまな欠点があります。従来の方法と比較して、高速剪断均質化抽出(HSHE)法は、新興の新規抽出方法であり、より速い抽出時間、より少ない溶媒廃棄物、より高い収率、より簡単な装置、およびより容易な操作の利点を有する(17)。HSHE法の動作原理は、高速モータによって駆動される回転インナーカッターに基づいています。強力なせん断力は、サンプルを破壊して混合するために、内側と外側のカッターによって生成されます。一方、高速回転のカッターは、カッターの内側と外側の空洞の間に圧力差を引き起こし、サンプルと溶媒との間の物質移動をもたらす。高いせん断力、衝突力、圧力、およびその他の力の組み合わせにより、固体サンプルと溶媒との間の可溶性バランスを迅速に達成することができる(18)。したがって、HSHEの抽出プロセスは数分で、さらには数十秒(19-22)で完了することができます。

最近、HSHEは様々な天然物からの生理活性成分の抽出において探求されている(23-25)。ChengらはHSHEを使って五味子チネンシスの果実から5つのリグナンを抽出した(26)。その結果、最適条件はエタノール濃度75%、抽出時間1分、固液比1:19、抽出電圧180V、サンプル粒径120メッシュであった。5つのリグナンの総収量は、最適化された条件下で13.89 ±0.014 mg/gであった。TangらはHSHEを使ってシソの種子から生理活性油を得た(27)。最適条件は、抽出時間2分、固液比1:10、引出し電圧150V、および2回の抽出サイクルであった。シソ種子油の収量は59.3%に達しました。上記の結果は、HSHEが短い抽出時間、低コスト、および高収率の利点を有することを示している。しかしながら、HSHEによるPhGsの抽出に関する研究は不十分である。

本研究では、HSHEは、PhGの抽出におけるその潜在的な応用を探るために使用された。C. チューブローザ.PhGsの収率はHPLCにより測定した。HSHE、UAE、およびMAEの3つの抽出方法を同じ条件下で比較した。エタノール濃度、抽出温度、回転数、抽出時間、固液比、及び抽出サイクル数の収率の影響を調べた。この作業と参考文献の長所と短所を比較し、議論します。

材料と方法

材料・化学試薬

C. チューブローザ新疆Congrongtang生物技術有限公司(新疆ウイグル自治区、中国)から購入しました。エキナコシド(純度≥98%)およびアクテオシド(純度≥98%)の規格は、上海標準生物技術有限公司(中国、上海)から購入した。アセトニトリル、メタノール、および酢酸はHPLCグレードのものであった(フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州)。分析グレードのエタノールは、天津永盛ファインケミカル株式会社(天津、中国)から購入しました。脱イオン水は実験を通して使用された。

HPLC分析

HPLC分析は、2489 UV/可視検出器と対称C18カラム(Waters)、250 × 4.6 mm、5 μm粒径を備えたWaters e2695液体クロマトグラフィー(ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州)で実施しました。エキナコシドおよびアクテオシドの濃度をHPLC法により分析した。移動相は、(1)アセトニトリルおよび(2)2%氷酢酸水溶液からなる。グラジエント溶出プログラムを表1に示します。

検出された波長は330nm、流量は1mL/min、注入量は10μL、オーブン温度は30°Cとした。 分析物のクロマトグラフィーピークは、その保持時間を標準物質の保持時間と比較することによって確認された。定量は、外部標準法を用いてピークを積分することにより行った。

精度試験は、同じ抽出試料を5回注入して行った。安定性試験のために、同じサンプルを0、1、2、4、12、24、および48時間刻みで分析した。エキナコシドおよびアクテオシドの回収試験は、抽出サンプルに標準物質を添加することによって実施した。エキナコシドおよびアクテオシドの全てのピーク面積および保持時間が記録された。エキナコシドおよびアクテオシドについての検量線の結果を表2に記載した。

利回りの計算

エキナコシドおよびアクテオシドは、PhGsの決定のための指標成分として使用された。エキナコシドまたはアクテオシドの収率は、以下の式を用いて計算した:

Y=CV/W×100% (1)

ここで、Y = エキナコシドまたはアクテオシドの収率(%);C = エキナコシドまたはアクテオシドの濃度(mg / mL);V = 抽出溶液の体積(mL);W=C.チューブローザ粉末の重量(mg)とする。

PhGsの抽出方法

C. tubulosaの茎は、最初に電気粉砕機(JC-500g;永康海原工業貿易有限公司、永康、中国)をフィルターふるい(約380μm)により濾別した。その後、C. tubulosa粉末を70°Cのオーブンで重量が一定になるまで乾燥させた。5グラムのC.チューブローザ粉末を抽出溶媒と混合し、抽出ボトルに入れた。その後、液体混合物を恒温水浴中で5分間予熱(30〜80°C)した(DF-101S;金丹分析機器有限公司、金丹、中国)。

(a) HSHE法 - HSHEは、回転カッター、高速モーター、およびコントローラで構成されるFA25システム(FLUKO Co., Ltd.、上海、中国)によって実施されました。インナーカッターの回転速度は10000〜28000rpmの範囲で調整され、抽出時間は2〜15分の範囲で調整されました。

(b) UAE法 - 5グラムの乾燥サンプルと300mLのメタノールを精秤し、抽出ボトルに加えた。抽出ボトルを超音波浴に浸漬し、300Wの超音波パワーで10分間行った。抽出温度は30°Cに設定した。

(c) MAE法—5グラムの乾燥サンプルと300mLのメタノールを精秤し、抽出ボトルに添加した。抽出ボトルをマイクロ波反応器に投入し、180Wで10分間行った。抽出温度は30°Cに設定した。

HHE法を、同じ抽出溶媒、抽出時間、抽出温度、固液比、および抽出サイクル数でUAE法およびMAE法と比較した。抽出溶液を0.22μmの膜で濾過し、HPLCを介して分析して、エキナコシドおよびアクテオシドの濃度を決定した。すべての抽出プロセスを3回繰り返した

転送レートの決定

2015年中国薬局方における標準的な方法に基づいて、C. tubulosa粉末中のエキナコシドおよびアクテオシド含有量が決定された(28)。1グラムのC.チューブローザ粉末および50mLの50%メタノールを精秤し、50mLの褐色メスフラスコに加えた。この液体混合物を秤量し、30分間浸漬した。次いで、褐色のメスフラスコを超音波浴に浸漬し、250Wの超音波パワーおよび35kHzの周波数で40分間行った。液体混合物を再秤量し、そして溶媒損失のために供給するために50%メタノールを加えた。抽出溶液を0.22μmの膜で濾過し、HPLCを用いて分析し、エキナコシドおよびアクテオシドの濃度を決定した。抽出工程を3回繰り返した。

エキナコシドまたはアクテオシドの転写速度を、以下の式を用いて計算した:

X= M1/M2 ×100% (2)

ここで、X = エキナコシドまたはアクテオシドの移動速度(%);M1 =抽出物中のエキナコシドまたはアクテオシドの品質(mg);M2=C.尿細管腫粉末中のエキナコシドまたはアクテオシドの品質(mg)。

結果と考察

HPLC法の検証

HSHEを用いたC.チューブローザ由来のエキナコシドおよびアクテオシドのHPLCプロファイルを図1に示す。エキナコシドおよびアクテオシドのピーク面積のRSDは、それぞれ1.89%および1.40%であった。結果は、HPLC法がエキナコシドおよびアクテオシドの定量分析において良好な精度を有することを示した。様々な時間(0〜48時間)において、エキナコシドおよびアクテオシドのピーク面積のRSDはそれぞれ1.71%および1.70%であり、サンプルが48時間において安定であったことを示している。エキナコシドとアクテオシドの回収率はそれぞれ99.3%と99.1%で、RSDはそれぞれ0.70%と0.67%であり、HPLC法の信頼性を確認した。

異なる抽出方法の比較

エキナコシドおよびアクテオシドの収率に関するMAE法およびUAE法とのHSHE法の比較を行い、その結果を図2に示す。HHEによって得られたエキナコシドおよびアクテオシドの収率は、MAEおよびUAEの両方によって得られたものよりも高いことが観察された。MAEと比較して、HHEによって得られたエキナコシドおよびアクテオシドの収率は、それぞれ20.5%および20.8%大きかった。また、UAEと比較して、HHEによって得られたエキナコシドおよびアクテオシドの収率は、それぞれ6.6%および7.4%大きかった。これらの結果は、HSHEがPhGの収量を有意に増加させることができることを示している。

HSHE法の最適化

HHEによるPhGsの抽出パラメータには、エタノール濃度、抽出温度、回転速度、抽出時間、固液比、および抽出サイクル数が含まれる(26,29)。

PhGsの抽出に及ぼすエタノール濃度の影響

エタノール濃度は、PhGsの収率に影響を与える重要な要素である。図3に示すように、異なるエタノール濃度下でのC. tubolosaからのエキナコシドおよびアクテオシドの収率を調査した。エキナコシドの収率は0から30%に増加し、次いでエタノール濃度の増加とともに30%から90%に減少したことが明らかになった。アクテオシドの収率は0から70%に増加し、次いでエタノール濃度の増加とともに70%から90%に減少した。エタノール濃度が50%であったとき、エキナコシドおよびアクテオシドの収率の合計は最大であった。異なるエタノール濃度は異なる極性を有し、これはエキナコシドおよびアクテオシドの異なる溶解性をもたらす。従って、最適エタノール濃度は50%であった。

回転速度がPhGの抽出に及ぼす影響

図5は、PhGの収率に対する異なる回転速度の影響を示しています。エキナコシドおよびアクテオシドの収量は、回転速度の増加とともに増加した。回転速度の増加は、内側および外側のカッターのせん断力を増加させることができ、したがってPhGsの収率を増加させることができる。最適な回転速度は16000rpmであった。

PhGsの抽出に及ぼす抽出時間の影響

異なる抽出時間におけるエキナコシドおよびアクテオシドの収率を図6に示す。エキナコシドおよびアクテオシドの収率は、抽出時間の増加とともに安定していた。したがって、PhGsは2分でC. tubulosaから完全に抽出することができ、最適な抽出時間は2分であったと結論付けることができる。

PhGsの抽出に及ぼす固液比の影響

図7に示すように、異なる固液比下でのエキナコシドおよびアクテオシドの収率が議論された。エキナコシドとアクテオシドの収量は1:3から1:9に増加し、1:9から1:24に安定しました。少量の抽出溶媒ではエキナコシドおよびアクテオシドを完全に溶解することができないため、物質移動速度が低下した。溶媒の過剰な抽出は、不必要な廃棄物を引き起こした。したがって、最適な固液比は1:9であった。

PhGsの抽出に及ぼす抽出サイクル数の影響

図8は、PhGsの収率に対する多数の抽出サイクルの影響を示す。エキナコシドおよびアクテオシドの収率は、抽出サイクル数の増加とともに増加した。しかし、抽出サイクルの増加に伴い抽出時間が著しく増加し、より多くのエネルギーが消費されました。最適な抽出サイクル数は1回であった。

PhGsを抽出するためのHHE法と他の抽出法との比較

C. tubulosaからPhGsを抽出するための他の抽出方法と比較したHSHE法の結果を表3に列挙する。HSHEは、超音波支援水性二相抽出および超音波マイクロ波抽出技術法などのカップリング方法よりも簡単で容易である。また、HSHEの抽出圧力は加圧液体抽出法よりも低く、前者の運転条件はより安全である。さらに重要なことに、表3から、HSHEはすべての抽出方法の中で最も短い抽出時間と最小の溶媒消費量を示すことがわかります。HSHE法は、高効率、穏やかな動作条件、低消費レベル、簡単な装置、天然物の抽出のための簡単な操作など、多くの利点を有すると結論付けることができる。

結論

この研究では、C. tubulosaからのPhGの抽出のために、効率的で環境に優しいHSHE法が研究されている。UAEおよびMAE法と比較して、新規のHSHE法は、同じ条件下でより高いPhG収率を生成する。MAE法と比較して、エキナコシドおよびアクテオシドの収率はそれぞれ20.5%および20.8%増加した。UAEと比較して、エキナコシドとアクテオシドの収量はそれぞれ6.6%と7.4%増加しました。C. tubolosaからのPhGsのHSHEの抽出パラメータを最適化した。最適化されたパラメータの下で、エキナコシドおよびアクテオシドの収率はそれぞれ1.366%および0.519%に達し、エキナコシドおよびアクテオシドの移動率はそれぞれ87%および94%に達した。HSHE法は、高効率、穏やかな動作条件、低消費レベル、簡単な装置、簡単な操作、および低コストの利点を有する。この研究は、C. tubulosaからPhGを工業的に抽出するための新しい方法を提供する。