パート 1 MnSOD の遺伝子多型は、カルシウム尿石症患者の酸化ストレスと早期腎障害に対する環境メラミンの影響を修正する
Jun 19, 2023
概要
環境中のメラミンへの曝露は、酸化ストレスと早期腎損傷のリスクを高めます。 マンガン スーパーオキシド ジスムターゼ (MnSOD)、グルタチオン ペルオキシダーゼ、およびカタラーゼは、酸化ストレスから腎臓を保護し、正常な機能を維持します。 私たちは、それらの一塩基多型 (SNP) がメラミンの効果を変更できるかどうかを評価しました。 カルシウム尿石症と診断された合計 302 人の患者が登録されました。 すべての患者には、メラミンレベル、酸化ストレスの尿中バイオマーカー、および腎尿細管損傷を測定するために、一晩のワンスポット尿サンプルが提供されました。 中央値は、レベルを高と低に二分するために使用されました。 rs4880のT対立遺伝子を持ち、メラミンレベルが高い被験者は、調整後、rs4880のC対立遺伝子を持ち、メラミンレベルが低い被験者に比べて、マロンジアルデヒドレベルが高くなるリスクが3.60倍高かった。 rs5746136のG対立遺伝子を持ち、メラミンレベルが高い被験者は、rs5746136のA対立遺伝子を持ち、メラミンレベルが低い被験者に比べ、N-アセチル- -D-グルコサミニダーゼレベルが高いリスクが1.73倍高かった。 結論として、MnSOD の SNP、rs4880、および rs5746136 は、カルシウム尿石症患者における酸化ストレスと尿細管損傷のリスクにそれぞれ影響します。 尿中メラミン濃度が高い状況では、酸化ストレスや尿細管損傷に対するメラミンの影響がさらに増大しました。
キーワード
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ。 遺伝的多型。 メラミン; 腎臓損傷。 酸化ストレス; カルシウム尿石症。
序章
メラミンは、家庭用品、カウンタートップ、布地、接着剤、難燃剤など、さまざまな商業用日用品の製造に使用される合成化学物質です [1、2]。 窒素含有量が高いため、タンパク質含有量を欺瞞的に高めるために動物の飼料や牛乳に悪用されてきました[1、2]。 メラミン曝露の悪影響は、動物飼料へのメラミン曝露の悪影響が世界中の注目を集め、2007年に米国で数千頭のペット動物の死につながり、また乳児用ミルクにも曝露されて50頭以上が尿路結石症を引き起こした。{{6 }} 2008 年の中国では子供が 6 名死亡しました [1,2]。 現在に至るまで、メラミンは私たちの環境中に遍在的に存在しています。 いくつかの研究では、水、土壌、作物、日用品、動物組織からメラミンが検出されており[3-5]、また、さまざまな国のいくつかの一般集団のほとんどの尿サンプルからメラミンが検出されている研究もある[6-9]。
メラミンを摂取すると、元の形態の 90 パーセントが 24 時間以内に尿中に排泄されるため、腎臓はメラミンに対してより感受性が高くなる可能性があります [1]。 2008 年に小児の急性腎毒性に対する高用量のメラミンの影響に加えて、成人における低用量のメラミンへの長期曝露は、結石の形成や腎機能の低下などの腎臓合併症のリスクと関連している[10- 12]。 慢性的な低用量メラミン曝露が早期の腎損傷と結石形成を引き起こす可能性がある考えられるメカニズムの 1 つは、メラミン製食器類労働者 [13] とカルシウム尿石症の成人患者を対象とした 2 件の人体研究で判明したように、尿細管に対するメラミンの悪影響です。 14]。 また、ヒト腎近位尿細管 HK-2 細胞を使用した in vitro 研究を実施し、メラミンが酸化ストレスを増加させることによって腎尿細管損傷を誘発する可能性があることを発見しました [15]。 最近の2件の人体研究では、メラミンへの曝露により、酸化ストレスの尿中バイオマーカーであるマロンジアルデヒド(MDA)と8-オキソ-20 -デオキシグアノシン(8-OHdG)が増加することもわかりました。腎尿細管損傷のバイオマーカーである N-アセチル- -D-グルコサミニダーゼ (NAG) に対するメラミンの全効果の 36 ～ 53 パーセントを媒介します [16]。 これらの発見は、低用量の環境メラミンへの曝露が酸化ストレスを増加させ、ヒトの早期腎障害のリスクをさらに高める可能性を示唆しています。
酸化ストレスは、酸化促進物質または活性酸素種 (ROS) の生成が内因性の抗酸化能力を超えると発生します。 私たちの腎臓は酸化ストレスに特に敏感で、酸化ストレスはほとんどの腎臓病の発症、発症、進行における重要な要素であると考えられています[17,18]。 腎臓における酸化ストレスの原因は、医学的疾患とメラミンなどの化学物質への環境曝露との相互作用に関連している可能性があります[16]。 マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPX1）、カタラーゼ（CAT）などの内因性抗酸化システムは、腎臓を酸化ストレスから保護し、その後正常な機能の維持に役立つことがわかっています[18]。 MnSOD は有毒な ROS とスーパーオキシドアニオンを過酸化水素に分解し、その後ミトコンドリア内の GPX1 と CAT によって無毒な水と酸素に変換されます [18]。 これらの抗酸化酵素遺伝子のいくつかの一塩基多型 (SNP) は、腎臓病 [20-22] を含むさまざまな疾患 [19] に関連しています。
環境毒物に関連した腎臓損傷は遺伝的要因の影響を受ける可能性があるため[23]、抗酸化酵素遺伝子（例：MnSOD、GPX1、CAT）のSNPが酸化ストレスのリスクに対する環境メラミン曝露の影響を変化させる可能性がある。ヒトの腎尿細管損傷。 これを調べるために、抗酸化酵素遺伝子の 5 つの候補 SNP (MnSOD: rs4880 および rs5746136、GPX1: rs1800668、CAT: rs1001179 および rs769217) を選択しました。これらのほとんどは腎疾患に関連しています [20-22]。尿中の酸化ストレスの2つのバイオマーカーである8-OHdGとMDA、および腎尿細管損傷のバイオマーカーであるNAGに対する環境メラミン曝露と組み合わせた場合の影響。
カンカ チューブロサとカンカ錠剤
材料および方法
1. 対象者
2010年11月から2015年1月までに、上部尿路カルシウム尿路結石症と診断された合計309人の患者が登録された。彼らを含めるための詳細な研究デザインとプロトコールは以前に記載されている[14、16]。 簡単に言うと、患者は全員、台湾南西部にある高雄医科大学付属病院の出身者だった。 対象となる患者は、X線検査または超音波検査によって上部尿路の尿路結石症と診断され、赤外分光分析（スペクトルRX Iフーリエ変換）によってカルシウム成分を含むことが確認された結石標本を提供した20歳以上の個人でした。 -赤外線システム、PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。 参加者の中には、X 線検査で X 線透過性結石があることが判明した人も、臨床評価で尿酸結石やシスチン結石があることが判明した人もいませんでした。
慢性尿路感染症、慢性下痢、痛風、副甲状腺機能亢進症、腎尿細管アシドーシス、腎不全、または癌の病歴がある患者対象は除外された。 尿路結石症の診断または面接前の6か月以内に、ビタミンD、カルシウムサプリメント、利尿薬、またはクエン酸カリウムを週に1回以上定期的に摂取していた被験者も除外されました。 研究プロトコールはKMUHの治験審査委員会によって承認され、すべての適格な患者は署名されたインフォームド・コンセントフォームを提出した。 この研究は、STREGA [24] のガイドラインに従いました (補足資料表 S1 を参照)。
2. 臨床データと生体サンプルの収集
入院の際、すべての参加者には、生化学的および遺伝的分析のために、一晩絶食した後、尿路結石症の治療前に、血液および朝の最初の排尿尿サンプルが提供されました。 彼らはまた、人口統計データ、病歴、薬物使用（タバコ、アルコール、キンマ）を収集するための構造化されたアンケートにも回答した[14,16]。 参加者は、週に10本以上定期的にタバコを吸っていたり、週に1回以上アルコール飲料を摂取していたり、またはそれ以上噛んでいたりした場合に、タバコ喫煙者、アルコール飲酒者、またはキンマ咀嚼者と定義されました。少なくとも 6 か月間、それぞれ 1 週間あたり 7 キンマに相当します。 現在のユーザーは、尿石症の診断または面接前の 1 年以内に上記の習慣を依然として実践しているユーザーでした [11,25]。
結石の位置、結石の数、結石の直径、結石のエピソードなどの臨床情報もアンケートによって収集され、対象となる曝露に気づかなかった 1 人の泌尿器科医 (C.-CL) が患者のカルテを使用してさらに検討しました。メラミン、尿中の酸化ストレス (8-OHdG および MDA) および尿細管損傷 (NAG) のバイオマーカー、および抗酸化酵素遺伝子の遺伝子型解析。
キスタンシュカプセル
3. 尿中のメラミン、酸化ストレスのバイオマーカー (MDA および 8-OHdG)、および尿細管損傷 (NAG) の分析
尿中メラミンは、同位体液体クロマトグラフィータンデム質量分析法 (LC-MS/MS) (API40{{20}}0Q、Applied Biosystems/MDS SCIEX) を使用して測定されました。 、カナダ、オンタリオ州ボーン、コンコード）[13]。 尿中 MDA は、逆相カラム (Luna C18、250 × 4.6 nm) で蛍光 (HPLC-FL) 検出を備えた高速液体クロマトグラフィーを使用して測定されました [26]。 尿中 8-OHdG は、オンライン固相抽出 (SPE) LC-MS/MS の検証済みの方法を使用して測定されました [27]。 詳細な方法は以前に説明されています[14、16]。 尿中メラミンおよび酸化ストレスのバイオマーカーの検出限界 (LOD) は、メラミンが 0.4 ng/ml、MDA が 0.02 μmol/L、8-OHdG が 0.01 ng/mL でした。 MDA および 8- OHdG の尿測定値はすべて検出可能でした。 対照的に、309 件の尿中メラミン測定値のうち 31 件 (10.0 パーセント) は LOD を下回っており、LOD/√ 2 として置き換えられました。
尿中 NAG は、NAG アッセイキット (Diazyme Laboratory、米国カリフォルニア州ポーウェイ) を使用して測定しました [13、14]。 尿中 NAG 測定値はすべて検出可能でした。 尿中クレアチニンは、クレアチニン - ピクリン酸反応を測定するために 520 nm の波長に設定された分光測光法 (U-2000; 日立、東京、日本) によって分析されました [14]。 上記のすべての生化学的パラメーターの測定は、お互いの所見、研究デザイン、および参加者の情報を知らされていない 2 人の異なる検査技師によって実行されました。
4. 5 つの SNP のジェノタイピング
Puregene DNA Isolation Kit (Gentra Systems Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を使用して末梢全血から DNA を抽出しました。 5 つの SNP (MnSOD-rs4880、MnSODrs5746136、GPX1-rs1800668、CAT-rs1001179、および CAT-rs769217) は、TaqMan 5' 対立遺伝子識別アッセイ用のアッセイオンデマンド SNP ジェノタイピング キット (Applied Biosystems) を使用して分析されました。 、米国カリフォルニア州フォスターシティ）。 簡単に説明すると、25 μL の反応溶液中に 10 ng のサンプル DNA を含む SNP 増幅アッセイには、12.5 μL の 2× TaqMan® Universal PCR Mix (Applied Biosystems) が含まれ、一方、SNP ジェノタイピング製品 (Applied Biosystems) からの事前に開発されたアッセイ試薬 1.25 μL が含まれていました。 Biosystems) には 2 つのプライマーが含まれていました。 2 つの MCB-Taqman プローブは、製造元の指示に従って実行されました。 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems) を使用して実行されました [28、29]。 これらの遺伝子型は、本格的な遺伝子型解析後の直接配列決定によって確認されました。 研究サンプルの約 10 パーセント (30 ケース) が品質管理のためにランダムに繰り返され、結果は 100 パーセントの精度を示しました。
シスタンシュの利点
5. 統計分析
定量的データは平均値 ± 標準偏差 (SD) または四分位範囲の中央値 (IQR) として表され、カテゴリデータは数値 (n) とパーセンテージとして表示されました。 遺伝子型の分布に関するハーディ・ワインバーグ平衡は、カイ二乗検定を使用してチェックされました。
尿中メラミンレベルと尿中バイオマーカー（MDA、8-OHdG、NAG）は、さらなる分析の前に尿中クレアチニン値によって補正されました。 補正後、酸化ストレス（MDAおよび8-OHdG）および腎尿細管損傷（NAG）の尿バイオマーカーは、中央値を使用して高または低に二分化されました[14、16]。 単純なロジスティック回帰モデルを最初に使用して、抗酸化酵素遺伝子の遺伝子型と、酸化ストレスおよび尿細管損傷の尿中バイオマーカーとの関連を評価しました。 最初の分析で有意な関係が認められた場合、抗酸化酵素遺伝子の遺伝子型と中央値で二分した尿中メラミン濃度との複合効果を、年齢、性別、BMI、学歴などの共変量を調整した後、多重ロジスティック回帰分析によってさらにテストしました。レベル、個人の習慣、結石の数、結石のサイズ、結石の位置、併存疾患。 すべての統計分析は、SAS 統計パッケージを使用して実行されました。 すべての p 値は両側であり、次の場合に有意であると見なされます。<0.05.
6. 感度分析
私たちの発見の確実性を調べるために、尿中メラミンレベルを三分位に分割したときの結果を比較するために感度分析を実行しました。 さらに、尿濃度と複雑な交絡構造を補正するために、共変量調整された標準化とクレアチニン調整の新しい方法を使用して結果を比較します [14,30]。
参考文献
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Chia-Chu Liu 1,2,3,4 、 Chia-Fang Wu 1,5 、Yung-Chin Lee 2,3,6 、Tsung-Yi Huang 2 、Shih-Ting Huang 1,7 、Hsun-Shuan Wang 6 、ジェンハオ・ジャン 6 、シューピン・ファン 2,3、チンチア・リー 2,3、ユンシュン・ジュアン 2,3 、タスティ・ジウアン・シェイ 1,7 、イーチュン・ツァイ 1,8,9、チュー- Chih Chen 1,10 および Ming-Tsang Wu 1,11,12,13、
1 高雄医科大学環境医学研究センター、高雄市 807、台湾; ccliu0204@gmail.com (C.-CL); cfwu27@nuu.edu.tw (C.-FW); u107800006@kmu.edu.tw (S.-TH); hsiehjun@kmu.edu.tw (T.-JH); 920254@kmuh.org.tw (Y.-CT); ccchen@nhri.edu.tw (C.-CC)
2 高雄医科大学病院泌尿器科、高雄医科大学、高雄市 807、台湾; 890197@kmuh.org.tw (Y.-CL); 970417@kmuh.org.tw (T.-YH); shpihu@kmu.edu.tw (S.-PH); 850144@kmuh.org.tw (C.-CL); 840066@kmuh.org.tw (Y.-SJ)
3 高雄医科大学医学部泌尿器科、高雄市807、台湾
4 台湾、屏東市 900、保健福祉部屏東病院泌尿器科
5 台湾、苗栗360の国立統一大学、トランスレーショナル医学国際修士プログラム
6 高雄市立小港病院泌尿器科、高雄市812、台湾。 940199@kmuh.org.tw (H.-SW); 1030398@kmuh.org.tw (J.-HJ)
7 高雄医科大学医学院医学大学院医学院、高雄市、807、台湾
8 高雄医科大学病院内科、腎臓内科および一般内科、高雄医科大学、高雄市、807、台湾
9 高雄医科大学医学部内科内科、高雄市807、台湾
10 国立衛生研究所人口健康科学研究所生物統計・生物情報学部門、苗栗350、台湾
11 高雄医科大学環境産業医学および臨床医学大学院研究所、高雄市、807、台湾
12 高雄医科大学病院家庭医学科、高雄医科大学、高雄市、807、台湾
13 高雄医科大学保健科学部公衆衛生学科、高雄市、807、台湾
