パート 3 DsbA-L はミトコンドリア媒介尿細管細胞アポトーシスにおいて VDAC1 と相互作用し、急性腎臓病の進行に寄与する

7. PT-VDAC1-KO マウスの生成

AKIにおけるVDAC1の役割を調査するために、我々は腎臓の近位尿細管におけるVDAC1のノックアウトを特徴とするマウスモデルを確立した。 図7aは、PT-VDAC1-KOを生成するために使用された育種プロトコルを示しています。 RT-PCR を使用して PT-VDAC1- KO マウスの遺伝子型を決定しました。 これは、416- bp DNA フラグメント floxed アレルと Cre 遺伝子の 370- bp DNA フラグメントを増幅することによって行われました (図 7、b; レーン 4 および 6)。 野生型マウス (PT-VDAC1-WT) には Cre 遺伝子が欠如していました (図 7、b、レーン 2 および 3)。 イムノブロット分析により、虚血または偽治療後のPTVDAC1- KOマウスの腎臓皮質におけるVDAC1の発現レベルがPTVDAC1- WTマウスの発現レベルよりも低いことが示されました（図7cおよびd）。 これは、VDAC1 の免疫組織化学的染色によってさらに検証されました (図 7e)。 これらのデータは、PT-VDAC1-KO マウス モデルの確立に成功したことを証明しました。

図 7. PT-VDAC1-KO マウス モデルの作成と特性。 （a、b）PTVDAC1-KOマウスの生成のための繁殖プロトコル、およびVDAC1およびPEPCK-Cre対立遺伝子の野生型およびフロックス化対立遺伝子の遺伝子型のPCR検出。 （c）IR損傷後のPT-VDAC1-KOおよびPT-VDAC1-WT同腹子マウスの腎臓皮質組織を使用したVDAC1およびb-チューブリンの免疫ブロット分析。 (d) それらの間のグレースケール画像の分析。 （ e ）IR損傷後の野生型およびVDAC1マウスの腎臓皮質組織におけるVDAC1の免疫組織化学的染色。 元の倍率 x 400。スカーバー: 100μM。 各実験 (c および e) を独立して 6 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 複数グループの比較には一元配置分散分析を使用しました (d)。 #p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

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8. I/R誘発性腎損傷、尿細管細胞アポトーシス、ミトコンドリア損傷はPTVDAC1-KOマウスで改善された

PT-VDAC1-WT マウスと PT-VDAC1- KO マウスの同腹子を虚血 (28 分) に続いて再灌流傷害 (48 時間) で治療しました。 その後、さらなる検査のために血液サンプルと腎臓組織を採取しました。 我々は、PT-VDAC1-KOがI/R誘発性のBUNおよびクレアチニンレベルの上昇を顕著に抑制することを発見した（図8aおよびb）。 第二に、組織学的分析とTUNEL分析により、PT-VDAC1-KOがI / R誘発性の組織損傷と腎細胞のアポトーシスを著しく軽減することがさらに実証されました（図8c、d、f、およびg）。 第三に、EM分析により、PT-VDAC1-KOがI/R誘発性のミトコンドリア損傷を大幅に軽減することがわかりました（図8eおよびh）。 最後に、イムノブロッティングにより、PT-VDAC1-KO マウスでは切断型カスパーゼ-3のレベルが低下し、ミトコンドリア内の Bax の蓄積が低下し、サイトゾルへの Cyt-c 放出速度が低下したことが確認されました (図8 I-o)。 これらのデータは、VDAC1 が I/R 誘導性 AKI も媒介することを示しました。

図 8. PT-VDAC1- KO マウスにおける、IR 誘発性腎損傷、尿細管細胞アポトーシス、ミトコンドリア損傷、および Bax、Cyt-c、および切断型カスパーゼ 3 の発現の軽減。 PT-VDAC1-KO および PT-VDAC1-WT 同腹子マウスの両側腎動脈を 28 分間クランプし、その後 48 時間解放して IR モデルを確立しました。 （バン。 (b) 血清クレアチニン。 (c) ヘマトキシリンおよびエオシン染色。 (d) TUNEL 陽性細胞の代表的な切片。 (e) ミトコンドリア形態の電子顕微鏡検出。 (f) 管の損傷スコア。 (g) TUNEL 陽性細胞の数。 (h) ミトコンドリア損傷スコア。 (i) イムノブロットは、ミトコンドリアおよびサイトゾル画分における切断されたカスパーゼ 3、VDAC1、および DsbA-L の発現、ならびに BAX および Cyt-c の発現を分析します。 b-チューブリンとGAPDHは、それぞれ全溶解物またはサイトゾル負荷対照として使用されました。 COX IV をミトコンドリア負荷コントロールとして使用しました。 (j-p) それらの間のグレースケール画像の分析。 元の倍率 x 400。 スカーバー: c および d で 100μM、e で 20μM。 各実験(c-e&i)を独立して6回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 一元配置分散分析を複数グループの比較 (a、b、f-h&j-p) に使用しました。 #p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

カンクイ

9. DsbA-L の過剰発現により I/R 誘発性腎障害が悪化したが、PT-VDAC1- KO マウスでは軽減された

虚血性損傷中の DsbA-L の影響。 IRのマウスモデルを確立する1週間前に、各マウスの尾静脈にDsbA-Lプラスミドを注射しました（注射は今週中に2回行われました）。 DsbA-L の過剰発現は、IR による BUN およびクレアチニン発現の上昇、腎障害、および腎アポトーシスを悪化させました。 これらの効果は、PTVDAC1- KO マウスでは減弱されました (図 9a-d、e、および f)。 免疫ブロットの結果は、DsbA-L の過剰発現が、IR による切断型カスパーゼ -3 の増加、ミトコンドリアにおける Bax の蓄積、およびサイトゾルへの Cyt-c の放出を促進することをさらに示しました。 これらの効果は、PT-VDAC1-KOマウスでは減少した(図9gおよびh〜l)。 まとめると、これらの結果は、虚血性損傷中に VDAC1 が DsbA-L の効果を媒介することをさらに実証しました。

図 9. DsbA-L の過剰発現により I/R 誘発性腎障害が悪化したが、PT-VDAC1- KO マウスでは軽減された。 PT-VDAC1-KO マウスと PT-DsbA-L-WT マウスを DsbA-L プラスミドの有無にかかわらず処理し、IR モデルを確立しました。 （バン。 (b) 血清クレアチニン。 (c) ヘマトキシリンおよびエオシン染色。 (d) TUNEL 陽性細胞の代表的な切片。 (e) 管状損傷スコア。 (f) TUNEL 陽性細胞の数。 （g）イムノブロットでは、ミトコンドリア画分およびサイトゾル画分における切断されたカスパーゼ3、VDAC1、およびDsbA-Lの発現、ならびにBAXおよびCyt-cの発現を分析しました。 b-チューブリンとGAPDHは、それぞれ全溶解物またはサイトゾル負荷対照として使用されました。 COX IV をミトコンドリア負荷コントロールとして使用しました。 (h-n) それらの間のグレースケール画像の分析。 原倍率×400。 スカーバー：100mM。 各実験(c〜e)を独立して6回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 一元配置分散分析を複数グループの比較 (a、b、および f-n) に使用しました。 #p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

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10. PTDsbA-L-KO マウスにおける I/R 誘発性腎障害の軽減は、VDAC1 の過剰発現によって減少しました。

DsbA-L 媒介尿細管損傷が VDAC1 に依存しているかどうかをさらに確認するために、PTDsbA-L -WT マウスと PT-DsbA-L -KO マウスの同腹子マウスをまず I/R 治療に曝露し、次に尾静脈を介して注射しました。 VDAC1 過剰発現プラスミドを使用します。 I/R 誘発による BUN およびクレアチニンレベルの増加は、PT-DsbA-L -KO マウスでは改善されました。 しかし、この効果はVDAC1の過剰発現によって妨げられました（図10aおよびb）。 HEおよびTUNEL染色は、PT-DsbAL-KOマウスにおいて、IR誘発性腎組織損傷および腎細胞アポトーシスの相対的範囲が減少し、これらの影響がVDAC1の過剰発現によって遮断されることを示した(図10c〜f)。 イムノブロッティングにより、PT-DsbA-L -KO マウスでは切断型カスパーゼ-3のレベルが低く、ミトコンドリア内のBax蓄積レベルが低く、サイトゾルへのCyt-c放出速度が低いことが示されました。 しかしながら、これらの効果は、VDAC1の過剰発現によって除去された(図10g〜m)。 これらのデータは、DsbA-L が VDAC1 に依存して虚血性損傷を促進するという事実を裏付けています。

【図１０】ＰＴ－ＤｓｂＡ－Ｌ－ＫＯは、ＶＤＡＣ１の過剰発現により、ＩＲ誘発性マウス腎損傷を改善した。 PT-DsbA-L-KO および PT-DsbA-L-WT マウスを VDAC1 プラスミドの有無にかかわらず処理し、IR モデルを確立しました。 （バン。 (b) 血清クレアチニン。 (c) ヘマトキシリンおよびエオシン染色。 (d) TUNEL 陽性細胞の代表的な切片。 (e) 管状損傷スコア。 (f) TUNEL 陽性細胞の数。 （g）イムノブロットでは、ミトコンドリア画分およびサイトゾル画分における切断されたカスパーゼ3、VDAC1、およびDsbA-Lの発現、ならびにBAXおよびCyt-cの発現を分析しました。 b-チューブリンとGAPDHは、それぞれ全溶解物またはサイトゾル負荷対照として使用されました。 COX IV をミトコンドリア負荷コントロールとして使用しました。 (hm) それらの間のグレースケール画像の分析。 原倍率×400。 スカーバー：100mM。 各実験(c、d、g)を独立して6回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 一元配置分散分析を複数グループの比較 (a、b、e、f、h ～ m) に使用しました。 #p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

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11. CLP誘発腎損傷はPT-DsbA-LKOまたはPT-VDAC1-KOマウスでは軽減された

敗血症誘発性 AKI も臨床現場でよく見られる AKI の原因です。 PT-DsbA-L または VDAC-WT および PT-DsbA-L または VDAC1-KO の同腹子に CLP モデルを適用し、術後 18 時間で安楽死させました。 結果は、PT-DsbA-L または VDAC1- KO マウスが、CLP によって誘発される BUN およびクレアチニンレベルの上昇、および腎組織損傷および腎細胞アポトーシスのレベルの増加を顕著に減少させることを示しました（図 S1 および S2 a～f） ）。 イムノブロッティングにより、PTDsbA-L または VDAC1- KO マウスでも、切断型カスパーゼ-3 レベルの低下、ミトコンドリア内の Bax 蓄積レベルの低下、サイトゾルへの Cyt-c 放出速度の低下が示されたことが確認されました (図S1 および S2 g-n)。 まとめると、これらのデータは、DsbA-L と VDAC1 の両方が敗血症 AKI の進行を媒介することを実証しました。

12. PT-DsbAL-KO または PT-VDAC1- KO マウスでは、VAN 誘発腎損傷が軽減されました

バンコマイシン (VAN) 誘発性 AKI も AKI の重要なモデルです。 PT-DsbA-L または VDAC1-WT および PT-DsbA-L または VDAC1-KO の同腹子に VAN (600mg/kg) を 7 日間連続して腹腔内注射しました。 結果は、PT-DsbA-L または VDAC1- KO マウスが、VAN 誘発性の BUN およびクレアチニンレベルの上昇、腎組織の損傷、および腎細胞のアポトーシスを顕著に減少させることを示しました (図 S3 および S4 an-f)。 免疫ブロット分析により、PTDsbA-L または VDAC1- KO マウスでは、切断型カスパーゼ-3のレベルが低下し、ミトコンドリア内の Bax 蓄積の程度が低下し、細胞内への Cyt-c 放出速度が低下したことがさらに確認されました。サイトゾル（図S3およびS4 g〜m）。 要約すると、これらのデータは、DsbA-L と VDAC1 の両方が VAN 誘発性 AKI を媒介することを実証しました。

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13. DsbA-L 媒介 I/R 誘発 HK-2 細胞アポトーシスは VDAC1 と関連していた

上記の結果から、DsbA-L が BUMPT 細胞のアポトーシスに関与していることがわかりましたが、ヒト尿細管細胞における DsbA の機能は依然として不明です。 DsbA-L siRNA を HK2 細胞にトランスフェクトし、次に 2 時間 ATP 枯渇に曝露し、2 時間回復させました。 イムノブロットの結果は、DsbA-L siRNA が、I/R 誘発性の切断型カスパーゼ -3 および VDAC1 発現の増加、ミトコンドリアにおける Bax の蓄積の増加、およびサイトゾルへの Cyt-c の産生の増加を顕著に改善することを実証しました (図S5およびh）。 データはまた、HK2 細胞のアポトーシスにおける DsbA-L の役割が I/R 治療中の VDAC1 に関連していることを示唆しました。

14. DsbA-L 媒介 I/R 誘発 HK-2 細胞のアポトーシスは VDAC1 に依存します

HK2細胞アポトーシスにおけるDsbA-Lの役割がVDAC1に依存しているかどうかをさらに検証する。 まず、HK2 細胞を DsbA-L siRNA と VDAC1 プラスミドの有無にかかわらず同時トランスフェクトし、その後 2 時間 ATP 枯渇に曝露し、2 時間回復させました。 イムノブロットの結果は、DsbA-L siRNA が、I/R 誘発性の切断型カスパーゼ -3 および VDAC1 発現の増加、ミトコンドリアにおける Bax の蓄積の増加、およびサイトゾルへの Cyt-c の産生の増加を顕著に軽減することを示しました。この効果は、VDAC1 プラスミドの過剰発現によって逆転しました (図 S6a ～ h)。 次に、HK2 細胞を VDAC1 siRNA と DsbA-L プラスミドの有無にかかわらず同時トランスフェクトし、I(2 時間)/R(2 時間) に曝露しました。 イムノブロットの結果は、VDAC1 siRNA が、I/R 誘発性の切断型カスパーゼ -3 および VDAC1 発現の増加、ミトコンドリアにおける Bax の蓄積の増加、およびサイトゾルへの Cyt-c の産生の増加を顕著に改善することを示しました。この効果は、は、DsbA-L プラスミドの過剰発現によって増強されませんでした (図 S7a-h)。 データは、I/R 治療中に VDAC1 が HK-2 細胞における DsbA-L のアポトーシス促進の役割を媒介したことを明確に証明しました。

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a 、b 張宏良、a、b 王魯祥、a、b リー・イージャン、d 徐東祥、a、b チャイ・シャンピン、a、b ユアンチャン、e 鄭ペイリン、h、張東山 a、b *

中華人民共和国救急医学局

b 救急医学・難病研究所、中南大学第二祥雅病院、〒410011、中華人民共和国湖南省長沙市

c 中華人民共和国眼科

d 中華人民共和国泌尿器外科

e 中華人民共和国胸部外科

f 中華人民共和国第二襄雅病院一般外科

g 中国湖南省長沙の中南大学公衆衛生学部

h 中国深セン市、済南大学第二臨床医科大学、南方科技大学第一附属病院、深セン人民病院内分泌科

1 Xiaozhou Li と Jian Pan はこの研究に同等に貢献しました