PART1 A Cistanches Herba Fraction /𝛽-Sitosterolは、C2C12筋管におけるミトコンドリア脱共役のレドックス感受性誘導およびアデノシン一リン酸依存性プロテインキナーゼ/ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体𝛾コアクチベーター-1の活性化を引き起こす還元効果

Hoi Shan Wong、Jihang Chen、Pou Kuan Leong、Hoi Yan Leung、Wing Man Chan、Kam Ming Ko

香港科技大学生命科学部、九龍、香港

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

2014年8月29日に受領。 2015年1月14日受理アカデミックエディター：ManLiCopyright©2015

Hoi Shan Wong et al。これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの下で配布されるオープンアクセスの記事であり、元の作品が適切に引用されている限り、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、および複製を許可します。 以前の研究では、HCF1の半精製画分がCistanches Herba、通常の食餌および高脂肪食を与えられたマウスの体重減少を引き起こします。 体重の減少は、ミトコンドリアの脱共役の誘導とマウス骨格筋の代謝酵素活性の変化に関連していた。 HCF 1-による体重減少の根底にある生化学的メカニズムをさらに調査するために、HCF1とその有効成分である𝛽-シトステロール（BSS）がC2C12筋管に及ぼす影響を調べました。 HCF1 / BSSとのインキュベーションは、おそらくミトコンドリア内膜を流動化することにより、ミトコンドリア膜電位（MMP）の一時的な増加を引き起こしました。 MMPの増加は、ミトコンドリアの活性酸素種（ROS）の生成の増加と並行して行われました。 次に、ミトコンドリアのROSは、タンパク質3（UCP3）の脱共役によるミトコンドリアの脱共役の酸化還元感受性誘導を引き起こしました。 生化学的分析は、HCF1がアデノシン一リン酸依存性プロテインキナーゼ/ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体𝛾コアクチベーター-1経路を活性化し、それによってシトクロムcオキシダーゼとUCP3の発現を増加させることができることを示しました。 ミトコンドリアカプラーを使用した動物実験でも、HCF1-による体重減少におけるミトコンドリア脱共役の役割が確認されました。 結論として、HCF1 / BSSは、ミトコンドリアの脱共役の酸化還元感受性誘導とC2C12筋管におけるAMPK / PGC -1の活性化を引き起こし、その結果、エネルギー消費の増加により体重と肥満が減少します。

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1.はじめに

体脂肪の異常な蓄積として定義される肥満は、公衆衛生上の脅威として浮上しています。 代謝的に健康な状態または代謝的に障害のある状態に関係なく、肥満は併存疾患および死亡のリスクの増加と関連していることがわかっています[1]。 中枢性肥満、コレステロールプロファイルの異常、および血漿トリグリセリドレベルの上昇は、これらすべてが肥満者の一般的な特徴であり、肥満者における2型糖尿病、心血管疾患、非心血管死、および肥満関連癌の高い発生率の一因となっています。 2]。 したがって、体重と肥満の減少は、肥満に関連する健康への影響を防ぐための鍵と見なされてきました。 肥満の管理は、主に、エネルギー消費量を増やしたり、エネルギー摂取量を減らしたりすることによって、最適なエネルギーバランスを確立することを強調しています。 身体活動の増加や健康的な食事パターンの発達を含むライフスタイルの変更は、一般的に減量を誘発するための安全なアプローチと考えられています。 ただし、このようなアプローチは一般に非効率的であることがわかっています。HindawiPublishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2015、Article ID 142059、12 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Evidence-Based Complementary andエネルギー消費を増やす、またはエネルギー摂取を減らすための代替医療[3]。 したがって、薬剤の使用に基づく戦略は現在活発に調査されています。 これに関連して、私たちの以前の発見は、HCF1、ホンオニクハーブ（乾燥した植物全体ニクジュヨウ繁体字中国語医学で「陽を活性化する」強壮剤として特徴付けられるYCMaは、食事による肥満とそれに関連する代謝異常の予防に効果的であることが示されました[4]。 HCF1の経口投与は、おそらく骨格筋のミトコンドリア脱共役の誘導により、通常食（ND-）および高脂肪食（HFD-）を与えられたマウスの体重を減少させ、結果としてエネルギー消費を増加させました[4 ]。 ただし、そのようなHCF 1-によって誘発されるミトコンドリアの脱共役（したがって体重の減少）の根底にあるメカニズムは不明なままです。 ミトコンドリアの脱共役は、ミトコンドリア内膜（IMM）を横切る代替のプロトンコンダクタンス経路を導入することによってプロトン勾配を消散させ、その結果、ミトコンドリア膜電位とミトコンドリアATP生成が減少します。 プロトン輸送のこの無駄なサイクルは、さまざまな組織で代謝エネルギーの大部分を消費し、毎日のエネルギー消費のかなりの部分を占め、その後、燃料分子（酪酸など）の使用が増加し、それによって体重が減少し、肥満の減少[5、6]。 HCF1によって生成されるミトコンドリア脱共役効果を確認するために、MMPおよびUCP3発現に対するHCF1の効果を、C3Hマウスの大腿筋に由来する分化筋細胞であるC2C12筋管で調べました。 私たちの目的は、HCF1によってもたらされる軽量化の根底にある生化学的メカニズムを調査することでした。 𝛽-HCF1の有効成分であるシトステロール（BSS）も比較のために研究されました。 HCF 1-によって誘発されたHFDを与えられた肥満マウスの体重減少におけるミトコンドリア脱共役の関与の可能性は、HCF1と化学カプラー6-ケトコレスタノール（kCh）の同時投与によってさらに調査されました。 遍在的に発現するセリン/スレオニンプロテインキナーゼであるアデノシン一リン酸依存性プロテインキナーゼ（AMPK）は、細胞のエネルギー代謝を制御するための重要なハブを構成します。 活性化されると、AMPKは細胞内/細胞外シグナルを統合し、さまざまな細胞シグナル伝達カスケードを介して細胞応答を誘発します[7、8]。 AMPKは、直接リン酸化を介して代謝酵素活性を調節することにより、細胞代謝を調節することができます。 AMPKはまた、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体𝛾coactivator -1（PGC -1）のリン酸化を介して、転写レベルで長期的な効果を生み出します。これにより、エネルギー代謝とミトコンドリア機能に関連する遺伝子発現に適応的な変化がもたらされます。 [9、10]。 この点で、C2C12筋管のAMPK /PGC-1シグナル伝達経路に対するHCF1/BSSの影響も調べました。

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2。材料と方法

2.1。 ハーブ抽出。

Cistanches Herba、乾燥した植物全体ニクジュヨウYC Ma（ハマウツボ科）は、地元のハーブディーラー（Lee Hoong Kee）から購入しました。 ハーブはサプライヤーによって認証され、バウチャー標本（HKUST00301）が香港科技大学（HKUST）の生命科学部に寄託されました。 Aホンオニクハーブ抽出物は、前述のように[11]、78°Cで2時間還流下で加熱することにより、粉砕したハーブ材料をエタノール抽出することにより得られ、収率は14％（w / w）でした。 抽出物は、シリカゲルクロマトグラフィーを使用してさらに分画された[12]。 HCF1は1.14パーセント（w / w）の収率で得られました。 抽出物は、50℃で減圧下で溶媒を蒸発させることにより乾燥させ、乾燥した抽出物は、使用前に-20℃で保存した。

2.2。 化学薬品。

抗𝛽-アクチン抗体、BSS（CAS 83-46- 5）、プロテアーゼ阻害剤カクテル、およびホスファターゼ阻害剤カクテル3は、Sigma（St Louis、MO）から購入しました。 抗AMPK𝛼1 / 2抗体、抗p-AMPK𝛼1 / 2抗体、抗PGC -1（H -300）抗体、抗UCP3（E -18）抗体、{{16} } [4-（2-ピペリジン-1-イル-エトキシ）-フェニル）]-3-ピリジン-4-イル-ピラゾロ[1、5- a ]-ピリミジン（CC）、および6-ケトコレスタノール（kCh）は、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA、USA）から購入しました。 抗COX抗体はCellSignaling（Danvers、MA）から購入しました。 抗ラミンB1抗体はAbcam（Cambridge、MA）から購入しました。 Bio-Radアッセイ試薬は、Bio-Rad Laboratories（Richmond、CA、USA）から購入しました。 他のすべての化学物質はSigma（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。

2.3。 細胞培養。

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）のC3Hマウス骨格筋由来筋芽細胞培養[13]であるC2C12は、Zhenguo Wu教授（香港科技大学生命科学部）から提供されました。 細胞株は、10パーセント（v / v）ウシ胎児血清（FBS）、100 IU / mLペニシリン、および100𝜇gを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Gibco BRL Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド）で培養しました。 / mLのストレプトマイシン、および17mMNaHCO3。 C2C12筋芽細胞のC2C12筋管への分化は、完全培地を10％（v / v）FBSではなく2％（v / v）馬血清（HS）を含む分化培地に置き換えることによって誘導されました。 細胞は、37℃の空気中で5パーセント（v / v）CO2の雰囲気下で増殖させた。

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2.4。 C2C12筋管の生化学的分析

2.4.1。 MMP。

ミトコンドリア膜電位は、蛍光カチオン色素、5,5,6、6 -テトラクロロ- 1、1,3、3 -テトラエチルベンズイミダゾリル-カルボシアニンヨージド（JC - 1）を使用して測定しました。 [14]。 細胞は、96-ウェルマイクロタイタープレートで1。0×104細胞の密度で培養されました。 安定した付着後、細胞を20𝜇M JC -1（培地に溶解）で37℃で10分間前染色しました。 予備染色後、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を添加したハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で細胞を2回洗浄しました。 MMPの測定は、HCF1/BSSを含む培地の添加によって開始されました。 膜電位の高いミトコンドリアの内膜に形成されるJC-1分子のJ凝集体の量は、JC -1赤色蛍光（Ex 485 nm / Em 580 nm）を監視することによって決定されました。 -ベースの補完代替医療3、37°C​​で1時間。 MMPは、テストされたサンプルの蛍光強度からブランクサンプル（つまり、培地のみを含む）の蛍光強度を差し引くことによって推定されました。 HCF1 / BSSで培養された細胞のMMP値は、それぞれの非HCF1 / BSSで培養された対照値で正規化され、パーセント対照として表されました。

2.4.2。 アデノシン一リン酸依存性プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化。

C2C12筋管を6-ウェルマイクロタイタープレートに播種しました（1.5×105細胞）。 安定した付着後、細胞をHCF1/BSS含有培地で8時間プレインキュベートしました。 次に、プレインキュベートした細胞を300μLのドデシル硫酸ナトリウム-（SDS-）溶解バッファー（20 mM Tris-Cl、2 mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、3 mMエチレングリコール四酢酸（EGTA）、1％（w / v）Triton X - 100、10パーセント（w / v）グリセロール、5パーセントSDS、1 mMジチオスレイトール（DTT）、プロテアーゼ阻害剤カクテル、およびホスファターゼ阻害剤カクテル3、pH 7.5）。 ライセートをさらに12000×g、4℃で10分間遠心分離し、細胞破片を除去しました。 AMPK活性化の程度は、SDS-PAGE分析後の抗p-AMPK𝛼1 /2抗体と抗AMPK𝛼1 / 2抗体を使用したウエスタンブロット分析により、ホスホル-AMPK𝛼（p-AMPK）とAMPK𝛼の相対比から評価されました。 10パーセント（v / v）アクリルアミドの分離ゲル。 細胞溶解物（20𝜇g）をロードし、𝛽-アクチンを参照マーカーとして使用しました。 免疫染色されたタンパク質バンドをデンシトメトリー（Quantiscan、Biosoft）で分析し、p-AMPK𝛼とAMPK𝛼の量（任意単位）をサンプルの𝛽-アクチンレベル（任意単位）を参照して正規化しました。

2.4.3。 PGC-1核転座。

C2C12筋管は、1 00mm培養プレートで2.0×106細胞の密度で培養されました。 8時間後、HCF1 / BSSプレインキュベーション細胞をトリプシン処理し、1 mLの氷冷低張バッファー（1 0 mM HEPES、1.5 mM KCl、および1.5 mM MgCl2、pH 7.9）と4°Cで10分間インキュベートしました。 インキュベーション後、500×g、4℃で10分間の遠心分離により細胞を回収しました。 収集した細胞を300𝜇L低張バッファーに再懸濁し、0.5 mM DTT、0.1％（w / v）ノニルフェノキシ-ポリエトキシエタノール（NP -40）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加して、可溶性サイトゾルタンパク質の抽出を促進しました。 。 得られたライセートを12000×g、4℃で1分間遠心分離し、細胞質（上清）および核（ペレット）画分を生成しました。 核タンパク質の分離は、ペレットを25𝜇Lの氷冷高張バッファー（20 mM HEPES、25％（w / v）グリセロール、400 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、pH 7.9）、4℃で30分間、続いて12000×g、4℃で5分間遠心分離。 PGC -1核転座の程度は、上記のように、SDS-PAGE分析に続くウエスタンブロット分析を使用して、細胞質ゾルおよび核画分のPGC-1レベルの相対比から推定されました。 細胞質ゾルと核の両方の画分（20𝜇g）をロードし、𝛽-アクチンとラミンB1をそれぞれ細胞質ゾルと核の参照マーカーとして使用しました。 PGC -1の量（任意単位）は、サンプル中の𝛽-アクチンおよびラミンB1レベル（任意単位）をそれぞれ参照して正規化されました。

2.4.4。 ミトコンドリア脱共役タンパク質3（UCP3）およびチトクロームcオキシダーゼ（COX）の発現。

C2C12筋管を100mm培養プレートに播種しました（2。0×106細胞）。 安定した付着後、細胞をHCF1/BSS含有培地と37℃で48時間プレインキュベートしました。 HCF1 / BSSを含む培地を除去した後、細胞をトリプシン処理し、300mLのSDS溶解バッファーを添加して溶解しました。 細胞溶解物を12000×g、4℃で10分間遠心分離し、細胞破片を除去しました。 上清中のUCP3およびCOXレベルは、上記のSDS-PAGE分析に続いて抗UCP3（E - 18）抗体および抗COX抗体を使用したウエスタンブロット分析によって決定されました。 細胞溶解物（50𝜇g）をロードし、𝛽-アクチンを参照マーカーとして使用しました。 UCP3とCOXの量（任意単位）は、サンプルの𝛽-アクチンレベル（任意単位）を参照して正規化されました。

2.5。 動物の世話。

ICRマウス（8週間、男性は30〜35 g、女性は25〜30 g）を、約22℃の空気/湿度制御環境で12時間の暗/明サイクル下で維持し、餌と水を自由に摂取させました。香港科技大学（HKUST）の動植物ケア施設（APCF）で。 すべての実験手順は、研究実践委員会（HKUST）によって承認されました（動物プロトコル承認番号2013049;承認日：2013年9月25日;実験期間：3年）。

2.6。 治療プロトコル。

6-ケトコレスタノール（kCh）がHFD給餌マウスのHCF 1-誘発体重減少に及ぼす影響を調べるために、動物をランダムに6つのグループに割り当て、各グループに10〜15匹のマウスを配置しました。 ）通常の食事（ND、脂肪に由来する13％のエネルギー、LabDietから購入、製品番号5010）コントロール。 （2）NDとkCh（1日量9 mg / kg）。 （3）HFD（脂肪に由来する60％のエネルギー、Research Diet Inc.から購入、製品番号D12492）コントロール。 （4）HFDとHCF1（1日量45 mg / kg）。 （5）HFDとkCh; （6）HFD + HCF1+kCh。 1日量45mg/ kgのHCF1は、雄マウスの体重を大幅に減少させることが示されました[4]。一方、1日量9 mg / kgのkChは、HCFを無効にすることがわかりました1-。マウス骨格筋から単離されたミトコンドリアで誘導された脱共役効果（データは示されていない）。 動物に、kCh、HCF1、またはHCF1 / kChを週5日、8週間（すなわち、合計40回）胃内投与した。 対照マウスはビヒクル（オリーブオイル）のみを投与された。 実験中、マウスの体重と摂餌量を毎週モニターした。 体重の変化は、時間（1週目から8週目）に対する初期体重の割合をプロットしたグラフの曲線下面積（AUC）を計算することによって定量化され、任意の単位で表されました。 一晩絶食した後、最後の投与（kCh、HCF1、またはHCF1 / kCh）の24時間後に頸椎脱臼によりマウスを犠牲にした。 ミトコンドリア呼吸の測定のために、腓腹筋のサンプルを切除した。 脂肪パッド（性腺、後腹膜、腸間膜脂肪）を解剖し、重さを量りました。 特定の脂肪パッドの重量と体重の比率を推定し、「脂肪パッド指数」として表した。

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2.7。 マウスの生化学的分析

2.7.1。 サンプル準備。

細かく刻んだ腓腹筋組織を、緩衝液（100 mM KCl、50 mM MOPS、pH 7.2）中の1 0 mLコラゲナーゼ溶液（0。075パーセント（w / v））と混合しました。 4℃で20分間インキュベートしました。 消化した組織混合物を600×g、4℃で20分間遠心分離しました。 上澄みを除去した。 消化した組織を20mLの氷冷ホモジナイザーバッファー（50 mMスクロース、200 mMマンニトール、5 mM KH2PO4、1 mM EGTA、および5 mM MOPS、pH 7.2）と混合し、テフロンガラスホモジナイザーを使用して氷上でホモジナイズしました。 4000 rpmで25〜30回の完全なストローク。 次にホモジネートを600×g、4℃で10分間遠心分離し、核を含まない画分（上清）を得ました。 ミトコンドリアペレットは、9200×g、4℃で30分間の遠心分離により、筋肉ホモジネートから調製されました。 ミトコンドリア画分は、125 mM KCl、10 mM Tris-Base、2 mM KH2PO4、0.5 mM EGTA、および20 mM MOPS、pH7.5を含むバッファーにペレットを懸濁することによって得られました[15]。

2.7.2。 ミトコンドリア呼吸。

マウス骨格筋から分離されたミトコンドリアの呼吸数は、Wong andKo[12]によって説明されているように決定されました。 簡単に説明すると、ミトコンドリア呼吸は、クラーク型電極（Hansatech Instruments、Norfolk）を使用して3 0 Cで偏光測定しました。ミトコンドリア画分（1mgタンパク質/mL）を呼吸バッファー（3 {{17}）でインキュベートしました。 } mM KCl、6 mM MgCl2、75 mMスクロース、1 mM EDTA、および20 mM KH2PO4、pH 7.0）。 15mMピルビン酸ナトリウムと5mMリンゴ酸ナトリウムを含む基質溶液を加えた。 平衡化後、ADP（最終濃度0.6 mM）を添加して状態3の呼吸を開始しました。 追加されたADPのすべてがATP生成に使い果たされたとき、オリゴマイシンが追加されて状態4の呼吸を誘発しました。 呼吸制御比（RCR）は、状態3と状態4の呼吸数の比を計算することによって推定されました[16]。

2.7.3。 マウス骨格筋におけるミトコンドリアUCP3の発現。

ミトコンドリアUCP3レベルは、10％アクリルアミドの分離ゲルを使用した、ミトコンドリア画分のSDS PAGE分析に続く抗UCP3（E -18）抗体を使用したウエスタンブロット分析によって推定されました。 マウス骨格筋から分離されたミトコンドリア画分（〜60𝜇g）をゲルにアプライし、チトクロームcオキシダーゼ（COX）を参照マーカーとして使用しました。 免疫染色されたタンパク質バンドは、デンシトメトリーによって分析され、UCP3の量（任意単位）は、サンプルのCOXレベル（任意単位）を参照して正規化されました。

2.8。 タンパク質アッセイ。

タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイキットを使用して決定しました。 ミトコンドリア/細胞溶解物サンプルのアリコート（10𝜇L）を40𝜇Lの水で希釈しました。 次に、希釈したサンプルのアリコート（10𝜇L）を96-ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、続いて200𝜇Lの希釈したBio-Radアッセイ試薬を加えました（5-倍希釈）。 混合物を室温で５分間放置し、次いで５７０ｎｍでの反応混合物の吸光度を測定した。 タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を使用した検量線から決定されました。

2.9。 統計分析。

特に指定のない限り、すべてのデータは平均±平均の標準誤差（SEM）として表されました。 データは、特に指定がない限り、一元配置分散分析（一元配置分散分析）によって分析され、グループ間の差異は、テューキー範囲検定を使用して検出されました𝑃<>

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3.結果

3.1。 C2C12筋管のMMPに対するHCF1/BSSの効果。

化学的脱共役剤であるカルボニルシアニド{{0}}（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）を1𝜇Mの濃度でインキュベートすると、MMPが時間依存的に減少し、減少の程度は測定の終わり（図1および2）。 対照的に、HCF1とBSSは、3 0 ng / mLと10𝜇Mの濃度で、HCF1 / BSSインキュベーションの最初の10分間でそれぞれ5％と4％MMPを増加させました（図1と2） 。 最初のHCF1/BSSによる増加に続いて、測定終了時（60分のHCF1 / BSSインキュベーション）のMMPがそれぞれ初期値の95％と93％に徐々に減少しました（図1および2）。 MMPのHCF1/BSS誘発性変化は、特定の阻害剤の使用によって特徴づけられました。 ミトコンドリア複合体I阻害剤であるロテノン（0.1 nM）、および膜剛性の増強剤であるコレステロール（0.3𝜇M）は、測定の過程を通じて、HCF1 / BSSによって誘発されるMMPの変化を抑制しました（図1および2）。 一方、UCPの特定の阻害剤、GDP、化学カプラー、6-ケトコレスタノール（kCh）、または抗酸化剤、ジメチルチオ尿素（DMTU）との共培養は、HCF1-による還元を減少させました。後のHCF1インキュベーション時のMMP（図1）。 GDP、kCh、およびDMTUは、BSSインキュベーションの後半でBSSによって誘発されるMMPの低下も減少させ、それぞれの時間一致コントロールと比較した場合、MMP値は110％でした（図2）。

3.2。 C2C12筋管のAMPK活性化に対するHCF1/BSSの効果。

AMPKに対するHCF1の効果は、AMPK活性化の程度を示す総AMPK𝛼（AMPK𝛼）に対するリン酸化AMPK𝛼（p-AMPK𝛼）の比率を測定することによって調べられました。 30および100ng/ mLの濃度でのHCF1とのインキュベーションは、AMPK活性化の時間依存的な増加をもたらし、これらの増加の程度は、それぞれの時間と比較した場合、HCF1インキュベーションの8時間でそれぞれ32および43パーセントでした。マッチドコントロール（図3）。 HCF1と並行して、BSS（10𝜇M）とのプレインキュベーションは、プレインキュベーションされていないコントロールと比較して、AMPK活性化の程度を25％有意に増加させました（図5）。 C2C12筋管におけるHCF1/BSS誘発性AMPK活性化は、kCh（デカップラー）またはDMTUのいずれかとの共培養によって完全に無効になりました（オンラインで入手可能な補足資料の図4および5、表1および2）

3.3。 C2C12筋管におけるPGC-1核転座に対するHCF1/BSSの効果。

PGC -1の活性化は、PGC-1核転座の程度によって間接的に測定できます。 HCF1およびBSSとのプレインキュベーションは、細胞質に対する核内のPGC -1の比率の上昇によって証明されるように、PGC -1核転座をそれぞれ25％および28％有意に増加させました（図6および7）。 AMPKの特異的阻害剤、6- [4-（2-ピペリジン-1-イル-エトキシ）-フェニル）]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[ 1、5- a]-ピリミジン（CC）、濃度10𝜇Mは、HCF1 / BSSによるPGC-1核転座の増加をC2C12筋管でそれぞれ156％と235％抑制しました（表1および2）。 HCF1 /BSSによって誘発されたPGC-1の核転座は、kChまたはDMTUのいずれかとの共培養によっても防止されました（補足資料の図6および7、表1および2）。

3.4。 C2C12筋管におけるミトコンドリアUCP3およびチトクロームcオキシダーゼ（COX）発現に対するHCF1/BSSの効果。

AMPK /PGC-1経路におけるHCF1/BSS誘発性活性化の重要性を決定するために、UCP3およびCOX（ミトコンドリア質量の信頼できる指標）のレベルによって評価される、ミトコンドリアの脱共役および生合成に対するHCF1/BSSの効果細胞内）、それぞれ、調査された。 HCF1 / BSSとのプレインキュベーションは、ミトコンドリアのUCP3およびCOXレベルを大幅に増加させ、これらの増加の程度は、37および23パーセント（HCF 1-インキュベーション筋管）（図8）および52および24パーセント（BSSインキュベーション筋管）でした。 ）（図9）、それぞれ、それぞれのプレインキュベーションされていないコントロールと比較した場合。 HCF1 / BSSによって誘発されるUCP3およびCOXレベルの上昇は、HCF1とkCh、DMTU、または

CC（補足資料の表1および2）。 この実験で使用されたkChとCCの濃度は、C2C12筋管に対するkChとCCの細胞毒性効果を回避するために、それぞれ20と1𝜇Mに調整されたことに注意する必要があります（未発表の観察）。

3.5。 HCFで誘発された肥満マウスのHCF1-誘発体重減少におけるミトコンドリア脱共役の役割。

HCF 1-による体重減少におけるミトコンドリアの脱共役の考えられる役割は、化学カプラーkChを使用してさらに調べられました（補足資料の表3）。 HCF1は、NDおよびHFDを与えられたマウスの両方で、ミトコンドリア呼吸制御比（RCR）の減少とミトコンドリアUCP3発現の増加によって証明されるように、マウス骨格筋のミトコンドリア脱共役を誘発しました。 kCh自体（1日量9 mg / kg）は、ND給餌マウス（HFD給餌マウスではなく）でミトコンドリアRCRを23％有意に増加させました。 HFDを与えられたマウスにおけるHCF1-誘発ミトコンドリア脱共役は、kCh同時処理によって完全に阻害されました。 HCF1は、NDおよびHFDを与えられたマウスの両方で体重減少をもたらしました。 この効果は、HFDによって誘発される内臓脂肪指数の増加の抑制と関連していた。 HCF1とは対照的に、kChは、実験の8-週間のコース中に、NDおよびHFD動物の体重増加に検出可能な影響を与えませんでした。 kChとHCF1の同時投与は、マウスのHFD誘発体重および内臓脂肪指数の増加に対するHCF 1-誘発抑制効果を無効にしました（補足資料の表3）。