パート2：DHHC21欠損症は、敗血症性損傷時の腎機能障害を軽減します

コンタクトtina.xiang@wecistanche.com

討論

本研究では、敗血症性損傷時の腎灌流と機能の新規レギュレーターとしてDHHC21を報告します。 私たちの新しい調査結果は次のことを示しています：（1）Zdhhc21devde？ マウスは、WTマウスと比較して、敗血症性損傷後の腎機能が良好で、腎損傷が少ない;（2）DHHC21機能不全は、敗血症性損傷における腎組織灌流、酸素飽和、およびRBFを維持する;（3）DHHC21-触媒によるalARパルミトイル化はalARシグナル伝達経路の活性化およびalARによって誘発される腎動脈の収縮に必要です。 この研究は、敗血症性損傷時の腎灌流と機能の調節に関する新しいメカニズムの洞察を提供します。 DHHC21の機能障害が保護効果をもたらすことを示唆します腎臓機能敗血症性損傷において、DHHC21の阻害は、闘うための治療戦略として役立つ可能性があります腎機能障害敗血症性損傷中。

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腎組織の低灌流/低酸素症は、敗血症性損傷時の腎機能障害の主な原因の1つです3-5。 総ヘモグロビンのMSOT信号強度の低下、腎組織の酸素飽和度の低下、敗血症性損傷後のRBFの低下によって証明される、CLP後のマウスの腎低灌流を検出しました。 私たちの発見と一致して、RBFの低下は、腎臓損傷のある敗血症患者と敗血症損傷の大型動物モデルで観察されています7,10l1。またはRBF334を増やしました。 これらの矛盾する所見は、血流を測定するために使用されるさまざまな動物モデルおよび方法に起因する可能性があります。 たとえば、CLP誘発性の多菌性敗血症性損傷が一般的に使用されていますが、一部の研究ではEscherichiacoliの静脈内注射が使用されています35。

タンパク質パルミトイル化は、多くの疾患の病因と進行に関与する、タンパク質機能の新しい調節因子として最近報告されました。 これは、Schmidt et al.3637によって、新しいタイプの翻訳後修飾として最初に特定されました。DHHCファミリーの発見により、この分野の急速な拡大が促進されました38,39。 パルミトイル化とPATの役割は、脂質代謝を含む多くの生理学的および病理学的状態で報告されています。癌, 心血管疾患、および神経障害23、0、4。 多発性嚢胞腎および腎臓癌におけるパルミトイル化の関与は以前に報告されていますが23。腎臓病、特に敗血症性損傷時の腎機能障害。 私たちの知る限りでは、敗血症性損傷の腎機能障害におけるDHHC2lの役割を調査したのは私たちが初めてです。 我々の発見は、DHHC21の阻害が腎臓機能を大いに救い、敗血症性損傷において腎臓構造を維持することを示しています。

Zdhhc21dp / d4を利用した私たちの研究？ マウスは、腎機能に対するDHHC21機能不全の有益な効果は、敗血症性損傷時の腎組織灌流を改善する能力に起因することを示しています。 基礎条件下では、Zdhhc21ewaePマウスは、塩分/水分の不均衡または腎臓の構造的/機能的損傷の兆候を示していません5。 それでも、DHHC21の機能喪失は、敗血症性傷害によって誘発されるRBF、腎灌流、および腎酸素飽和度の低下を抑制します。 過度の腎血管収縮によって引き起こされる腎血管抵抗の増加は、敗血症性損傷における腎組織灌流障害の主な理由と考えられています6.9。 我々の結果は、敗血症性傷害におけるalARパルミトイル化の増加およびalARシグナル伝達経路の活性化によって証明されるように、敗血症性傷害誘発性腎組織低灌流の媒介におけるalARの関与を示している。 ただし、DHHC21機能障害は、alARpalmitoylationを阻害し、その下流のエフェクターを活性化し、腎動脈のフェニレフリン誘発性血管収縮を仲介するalARの鈍化した能力をもたらします。

「DHHC21によるalAR機能の調節の根底にある分子メカニズムはまだ完全に解明されていない。DHHC21の機能喪失によって引き起こされるalAR機能の欠陥は、alARのコンフォメーション変化に起因する可能性がある。多くのGPCRは適切なパルミトイル化に依存している細胞内コンフォメーション、GPCRのC末端テールに付着したパルミテートは原形質膜に挿入され、GPCRとそのパートナータンパク質との相互作用およびGPCRシグナルの伝播に不可欠な4番目の細胞内ループを作成します17,4。以前の研究Albarのパルミトイル化はそのC末端領域でも起こることを示しています44。したがって、DHHC 21-を介したlARパルミトイル化の欠如は、alARの細胞内コンフォメーションを変化させ、lARシグナルの伝播をブロックする可能性があります。 alAR活性化の下流シグナル伝達イベントであるERKの活性化が、9月にさらされたZdhhc21deviderマウスで阻害されることを示す我々の結果による ic傷害。 ただし、alARカルボキシル末端のDHHC 21-制御トポロジーは、X線結晶構造解析を使用してさらに確認する必要があります。

私たちの研究のもう1つの新しい側面は、敗血症性損傷時の腎臓の灌流と機能を評価するためのMSOTの利用です。 MSOTは、さまざまな臓器の灌流を測定するためのラベルフリーの方法と、腎臓機能を決定するための信頼性の高い画像技術として報告されています2832,45。 微小血管系の可視化を可能にしないドップラー流量計と比較して45、MSOTは、腎臓の微小血管系の灌流状態の定量的評価を提供しながら、150umで高い空間分解能の画像を生成します。 水溶性IRDye800CWは、腎クリアランスの測定に使用する安全なトレーサーであり、20 mg/kgの高用量で毒性を誘発しません。 私たちが観察したIRDye800CWの二相運動は、以前に発表された研究と一致しています。 私たちのMSOT記録は、敗血症の腎臓でのTmax遅延が大きいことを示しており、腎クリアランスの障害を示唆しています。 腎症研究は、MSOTによって検出された腎機能障害が糸球体の組織学的損傷と有意に相関していることを示しています30。 以前の出版物と一致する私たちのデータは、MSOTが腎灌流と機能を監視するための低侵襲で信頼性の高い技術であることを示唆しています。

現在、利用可能なDHHC21-特異的阻害剤はありません。 最も一般的に使用されるPAT阻害剤は2-BPであり、これは複数のDHHCに幅広い影響を及ぼし、酪酸代謝にも干渉します47。したがって、DHHC21を特異的に標的とする小分子阻害剤の開発は有望な方向性です。 alARがDHHC21の唯一の基質ではないことも指摘する価値があります。 血小板内皮細胞接着分子（PFCA M -1）、エストロゲン受容体カベオリン-1、内皮型一酸化窒素シンターゼ（eNOS）、Fyn、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD {{ 8}}）、およびPLCB122,41,4s、49、本研究の範囲を超えていますが、これらの基質が敗血症性損傷中の腎機能にも影響を与える可能性を排除することはできません。

結論として、本研究は、DHHC21がalARパルミトイル化およびalARを介した血管収縮を含むメカニズムを介して敗血症性損傷時の腎灌流の調節に重要な役割を果たすことを初めて示しています。 さらに、DHHC21の阻害は、敗血症性損傷時の腎機能に保護効果を発揮します。

材料および方法

試薬。 すべての試薬は補足表S1に記載されています。

動物。 Zdhhc21depherマウスとその野生型コントロールマウス（B6C3Fe）は、JacksonLaboratoryから購入しました。 Zdhhc21depheの遺伝子型？ マウスはシーケンシング（Genewiz、Inc.、NJ、USA）によって確認されました。シーケンシングに使用されたプライマーは、AGCTGACTGAAGGGCACC（順方向）およびAAAACCTGTAACGCATTTCCA（逆方向）23でした。 動物は12/12-時間の明/暗サイクルで飼育され、餌と水を自由に摂取できました。 この研究には、両方の性別のマウス（16-20週間）を使用しました。 すべての動物実験は、サウスフロリダ大学の動物実験委員会によって承認されており、実験室の管理と使用に関するNIHガイドに準拠しています。

盲腸の結紮および穿刺、マウスをイソフルランで麻酔した（3％の誘導および1％の維持）。 剃毛した腹部に正中切開を行い、盲腸を露出させ、回盲弁の下5 mmでしっかりと結紮し、結紮点の遠位にある20-ゲージ針で2回穿孔した。 各穿刺穴から1mmの糞便を押し出した。 その後、盲腸の位置を変え、腹部を2層で閉じました。 盲腸が乾燥するのを防ぐために、37C乳酸リンガー溶液を局所的に塗布した。 次に、輸液蘇生のために、マウスに37度の0。9パーセントの生理食塩水を皮下投与しました。 術前の0。5-1。5mg/kg用量のブプレノルフィン持続放出が鎮痛のために与えられました。 偽のマウスは同じ外科的処置を受けたが、盲腸結紮および穿刺は行われなかった50,51。

マルチスペクトル光音響トモグラフィー。 IRDye800CWの腎排泄の評価。 マウスをイソフルランで麻酔し、胴体周辺で脱毛した。 アルテラメディカルMSOTイメージングシステム（ドイツ、ミュンヘン）を使用して、マウスを複数の波長でイメージングしました：7 0 0、730,760,775,785、800,850 nm、10フレーム/秒の速度で。 マウスをホルダー内の仰臥位に置き、水平線形ステージに沿って動かして、固定位置の凹面トランスデューサーの上に腎臓を配置しました。 ベースライン記録後、100ulの0.9パーセント生理食塩水に溶解した60nmolのRDve800CWを10秒間静脈内注射しました。 画像は、逆投影式を使用して再構成され、マルチスペクトル分析で処理されました。 関心領域（ROI）は、腎皮質と髄質/骨盤領域の周りに描かれ、ROIのMSOT信号の時間的変化が描かれました。

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

腎臓の組織病理学。 腎臓を固定し、矢状面に沿って切断し、パラフィン包埋のために処理しました。 切片（5μm）を脱パラフィンし、再水和し、過ヨウ素酸で室温（RT）で8分間酸化した後、シフ液と25分間インキュベートしました。 次に切片をヘマトキシリンで対比染色した。 Keyence BZ-X710（Itasca、IL、USA）を使用して画像をキャプチャしました。 腎構造損傷は、糸球体異常、近位尿細管の刷子縁の喪失、空胞化、尿細管上皮の拡張、尿細管細胞の剥離/壊死、および好中球浸潤に基づいて評価された。 各機能は、重大度に基づいて0-5のスケールで評価されました。

クレアチニンと血中尿素窒素の測定。 敗血症性損傷の24時間後に心臓穿刺によりマウスの血液を採取した。 血漿は、RTで15分間2500gで血液を遠心分離することによって生成されました。 クレアチニンの測定：10-kDaスピンカラムを使用して血漿を除タンパクしました。 次に、ろ液中のクレアチニンのレベルをクレアチニンアッセイキットを使用して測定しました。 血中尿素窒素（BUN）のレベルは、製造元の指示に従って尿素窒素比色検出キットを使用して決定されました。

RBFとMAPの測定。 イソフルランを使用してマウスを麻酔した。 血圧トランスデューサーを頸動脈にカニューレ挿入した。 腹部に正中切開を行い、続いて左横切開を行って腎動脈を露出させた。 RBFは、超音波通過時間流量計（TS -420; Transonic Systems Inc.、Ithaca、NY、USA）を使用して測定しました。 露出した腎動脈の周りにフロープローブを配置した後、マウスを少なくとも30分間安定させた。 RBFとMAPは、PowerLab（AD Instruments、コロラドスプリングス、コロラド州、米国）を使用して同時に記録されました。 LabChartProバージョン7ソフトウェアを使用してデータを分析しました4,55

レジンアシストキャプチャ。 腎動脈を収集し、溶解バッファー（1 0 0 mM HEPES.25 mM NaCl、1 mM EDTA、1 0μMパルモスタチンB、プロテアーゼ阻害剤、pH 7.4）22、 56.組織溶解物をブロッキングバッファー（100 mM HEPES.1 mM EDTA、2.5％SDS、6 ul / ml MMTS、pH 7.4）とともに、50℃で30分間、一定のボルテックスでインキュベートしました。 5000gで30分間遠心分離してペレット化し、70％冷アセトンで5回洗浄しました。タンパク質ペレットを結合バッファー（100 mM HEPES、1.0％SDS、1 mM EDTA、pH 7.4）に再懸濁しました。タンパク質濃度を測定し、グループ間で正規化しました。各タンパク質サンプルを2つの等しい部分に分割し、それぞれに同量のイソプロピルセファロース6Bビーズ、Hydroxvlamine（0.2 M、pH 7.4）、NaCl（0.2 M）をそれぞれ加えました。RTで4時間インキュベートした後一定の回転で、パルミトイル化タンパク質を1×サンプルバッファー中の50 mM DTTで溶出し、SDS-PAGE用に収集しました。

ウエスタンブロッティング。 パルミトイル化lARの測定。 RACから収集されたサンプルは、4-20パーセントのTris-Glycineゲルにロードされ、電気泳動後にニトロセルロースメンブレンに転写されました。 RTで1時間ブロッキングした後、alARをウサギ抗lAR一次抗体（1：500）で4度で一晩プローブしました。 TBSTで3回洗浄した後、メンブレンをIRDye800CWロバ抗ウサギ二次抗体（1:20、000）とRTで45分間インキュベートしました。

ERKリン酸化の測定。 腎動脈を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む1×RIPAで溶解した。 膜はウサギ抗ERK（1：1 000）およびマウス抗リン酸化ERK（1：1000）抗体でプローブされました。 IRDye800CWロバ抗マウスおよびIRDye680RDロバ抗ウサギ抗体を二次インキュベーションに使用しました（1：20,000）。 膜は、Li-COROdysseyCLxを使用して画像化および分析されました。

ワイヤーミオグラフによる血管反応性の評価。 マウス腎動脈。 腎動脈（直径{{0}}μm）をWTおよびZdhhc21dp / deマウスから分離し、氷冷酸素化（95％O、/ 5％CO。）生理食塩水（PSS、13 { {47}} mM NaCl、4.7 mM KCl、1.18 mM KH、PO、1.17 mM MgSO.7H、O、14.9 mM NaHCO、5.5 mMグルコース、0.026 mM EDTA、および1.6 mM CaCl、pH 7.4）血管セグメント（〜長さ2mm）を2本のタングステンワイヤー（直径30um）の間のワイヤーミオグラフチャンバー（Living Systems Instrumentation、VT、USA）に取り付けた。 等尺性張力は、LabScribe v4iWorksソフトウェアと組み合わせたLivingSystemsシグナルコンディショナー（MYO-SC -1）を使用して記録されました。 37℃のPSSで30分間平衡化した後、正規化手順を実行して、最適な内周L、=0。9×L（Lo=100 mmHgの経壁圧に対応する内周）を決定しました。 。 次に、血管の生存率を60 mMKPSS（74.7 mM NaCl、60 mM KCl、1.18 mM KH、PO.1.17 mM MgSO.7H、O、14.9 mM NaHCO、5.5 mMグルコース、0.026 mM EDTA、1.6 mM CaCl、pH）でテストしました。 7.4）.KPSSに反応しなかった動脈は廃棄されました。 動脈は、増加する濃度のフェニレフリン（10 nM -30μM）で処理されました。 次に、アセチルコリン（10μM）を使用して内皮の完全性を評価した。 濃度応答曲線を作成しました。

人間の腎臓からの小さな動脈。 小さな動脈（直径〜1 0 00 um）は、移植手術のために拒絶された無傷の生存可能なヒトの腎臓から解剖されました。 血管セグメント（長さ約2 mm）をワイヤーミオグラフチャンバーのIバー（直径250 um）に取り付けました。 同様の平衡化および正規化手順が人間の動脈で実行されました。 次に、動脈をビヒクル対照（PSS中0.02パーセントDMSO）とともに1時間インキュベートした。 次に、血管の生存率を60 mM KPSSでテストし、濃度を上げてフェニレフリン（10 nM -30 uM）で処理しました。 洗い流した後、容器を2- BP（100 uM）で1時間インキュベートしました。 次に、血管の生存率を、100 uM2-BPの60mMKPSSで再度テストしました。 KPSSへの反応がないか低下した小動脈は廃棄されました。 次に、同じ濃度のフェニレフリン、続いてアセチルコリン（10 uM）で動脈をチャレンジしました。 ビヒクル制御または2-BP処理動脈の濃度応答曲線を作成して比較しました。

免疫蛍光。 ヒト腎動脈を10パーセントのホルマリンで48時間固定し、パラフィン包埋し、切片にしました。 次に、スライドを脱パラフィンし、再水和し、0.05パーセントのTritonX-1002を含むPBSで透過処理しました。 ブロッキング後、スライドをウサギ抗DHHC21およびヤギ抗lAR抗体（1：100）で4℃で一晩標識しました。洗浄後、ロバ抗ウサギAlexaFluor488およびロバ抗ヤギAlexaを用いて二次抗体のインキュベーションを行いました。 Fluor 568（1：500）。 DAPIを使用したProLongDiamond封入剤で封入した後、スライドをLeicaSP8スペクトル倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像化しました。

統計分析。 各統計的検定の詳細情報（たとえば、検定の名前、事後検定、n値、アルファレベル、p値）は、補足表S2にリストされています。 すべてのデータは正規分布の仮定を満たしています。 正規性検定は、アルファレベルを0。05に設定してシャピロ-ウィルク検定を使用して実行されました。 2つのグループ間の比較はスチューデントのt検定（両側）を使用して分析され、3つ以上のグループは一元配置分散分析とテューキー事後分析を介して比較されました。 ワイヤーミオグラフ曲線の比較は、Two-wayANOVA.pを使用して実行されました。<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">