さまざまなカズラコクシネア抽出物の光防護および抗メラニン形成特性

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UVA（320–400 nm）、UVB（280–320 nm）、およびUVC（100–280 nm）を特徴とする太陽紫外線（UV）放射は、細胞毒性、遺伝子毒性に起因する皮膚がんおよび光老化を引き起こす最も重要な環境要因です。 、および光毒性。 具体的には、UVAとUVBの放射は、それぞれ1日のUV照射の95％と3％を超えています[8]。 UVAおよびUVB照射は、皮膚の表皮および/または真皮層に浸透することにより、間接的または直接的に活性酸素種（ROS）を誘発し、酸化的損傷および細胞死を引き起こす可能性があります。 ここ数十年で、紫外線は深刻な皮膚の健康上の懸念になり、依然として世界中で危険なほど広がっています[9–11]。 紫外線照射は、皮膚の表皮細胞量の約95％を占めるケラチノサイトの直接かつ一貫した刺激剤です。 ケラチノサイトは、微生物、化学的、および物理的な危険に対する最初のバリアとして機能し、UVAおよびUVB放射線に対する防御に役立ちます。 ケラチノサイトがUVAおよびUVBにさらされると、細胞内ROSが生成され、アポトーシスが引き起こされます[12–14]。

メラノサイトは、皮膚表皮の生物学的防御において重要な役割を果たしているメラニン色素の生成と量に関与しています。 それらの調節不全は、色素沈着過剰または色素脱失障害を引き起こす可能性があります[15,16]。 メラノサイトは皮膚表皮の基底層に分布しており、日光への曝露、活性酸素種（ROS）、メラノサイト刺激ホルモン（-MSH）の影響も受けます[17,18]。 タイプ-3銅タンパク質ファミリーのメンバーであるチロシナーゼは、進化的に保存された金属タンパク質であり、メラニン形成、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、カテコラーゼ、およびジフェノールの活性に重要な役割を果たします。 チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1（TRP -1）、およびチロシナーゼ関連タンパク質-2（TRP -2）のダウンレギュレーションには、明確な触媒効果があります。 TRP -1は5、6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸オキシダーゼであり、TRP-2はドーパクロムトートメラーゼです[19,20]。 さらに、筋眼球症関連転写因子（MITF）とcAMP応答性エレメント結合タンパク質（CREB）は、主にメラニン形成を調節し、刺激のモードと強度に関する情報をコード化する転写因子です[17,21]。 複数の研究は、MITFおよびCREB経路がメラニン形成を調節すると述べています。 MITFは、メラニン形成関連酵素の転写における重要な要素であり、メラニン形成の中心的な調節因子です。 -MSHは、cAMP関連結合タンパク質（CREB）が関与するシグナル伝達メカニズムを介してMITFの発現を引き起こします。 次に、MITFはM-box配列（AGTCATGTGCT）で核に入り、特定のメラニン形成遺伝子と酵素の転写を促進します。 リン酸化されたCREBは、MitfプロモーターのCREコンセンサスエレメントに結合してMitf転写をアップレギュレートする-MSHによって刺激されることも知られています[21–24]。

この研究では、KC根（KCR）、茎（KCS）、葉（KCL）、および果実（KCF）の抽出物を包括的に比較し、それらの光防護および抗メラニン形成特性の複数の評価を行いました。

2。材料と方法

2.1。 KC抽出物の調製

釜山国立大学密陽キャンパスの9Lプラスチックポットで3年生のKC15植物を栽培しました。 KCは、この研究の著者であるYoungWhanChoi教授によって特定されました。 これらのサンプルは、釜山国立大学自然資源生命科学部園芸生物科学科の植物標本室にバウチャー標本（受入番号KC-PDRL -1）として寄託されました。 導電率レベルが1。0mS・cm-1で、次の元素（me・L-1）を含む完全な養液を使用して、植物に十分な水を与えました。NO3- N、16; NH 4- N、1.34; P、4; K、8; Ca、8; 港のKCガウンは、2020年12月に、根、茎、葉、果実を分類して収穫されました（図1A）。 採取したサンプルは直ちに凍結乾燥機で凍結乾燥し、分析まで20°Cでビニールバッグに保管しました。 KC（20 g）の乾燥した根、茎、葉、果実を微粉末に粉砕し、室温でエチルアルコールで抽出しました。 簡単に説明すると、KCのEtOH抽出物のろ過と蒸発は、45°Cの減圧下で行い、その後凍結乾燥しました。 最後に、さらなる実験のために、固体抽出物（50 mg / mL）をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解しました。

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2.2。 KC抽出物の総ポリフェノールおよびフラボノイド含有量

以前に説明されたように[25]、KCの根、茎、葉、および果実抽出物の総ポリフェノールおよびフラボノイド含有量は、フォリン-チオカルト（総ポリフェノール）および塩化アルミニウム（フラボノイド）比色法を使用して測定されました。 吸光度は、Ultrospec 6300 Pro（GE Healthcare Life Sciences、バッキンガムシャー、英国）を使用して700 nm（総ポリフェノール）で測定し、VICTORマルチラベルプレートリーダー（Perkin-Elmer、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を使用して510 nm（フラボノイド）で測定しました。 。

標準曲線は、標準として没食子酸（総ポリフェノール）とケルセチン（フラボノイド）を使用して作成され、結果は、KCの根、茎、葉、果実の抽出物のグラムあたりの没食子酸当量（GAE / g）およびケルセチン当量として表されました。 KCの根、茎、葉、果実の抽出物のグラムあたり（QE / g）。

2.3。 DPPHおよびABTSアッセイ

KCの根、茎、葉、および果実抽出物（{{0}}。5 mg / mL）のDPPHおよびABTSラジカル捕捉活性は、わずかな変更を加えた前述の方法[25]に従って測定されました。 KCの根、茎、葉、および果実の抽出物（0。5 mg / mL）をマイクロプレートでDPPH溶液（6 0 µM）と混合しました。 サンプルを激しく振った後、25°Cで0。5時間暗所に保管しました。 7 mM ABTSと2.6過硫酸カリウムのストック溶液を、蒸留水中、室温、暗所で18時間調製しました。 KCの根、茎、葉、および果実の抽出物（0.5 mg / mL）を作業溶液と混合し、暗所で室温で0.5時間放置しました。 サンプル混合物の吸光度を510nm（DPPH）または734 nm（ABTS）でモニターしました。

2.4。 細胞培養

付着したケラチノサイト（HaCaT）および付着したメラノサイト（B16F10）を、10％FBS（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、USA）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen）を含むDMEM（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、USA）培養液に接種しました。 Corporation、Carlsbad、CA、USA）、37°C​​、5％CO2で培養。 付着したHaCaTおよびB16F10細胞の増殖を定期的に観察し、培地を2〜3日ごとに交換しました。 対数増殖期の細胞をその後の実験に使用した。

2.5。 UVAおよびUVB照射

ケラチノサイトは、エネルギーの大部分を365nmの発光ピークで放出する5 8Wチューブを使用して、UVAまたはUVB照射（Bio-Link BLX -365、Villber-Lourmat、ドイツ、エバーハルツェル）にさらされました（ UVA）または312 nm（UVB）。 UVA照射線量は20J/ cm2であり、UVB照射線量は50 mJ/cm2でした。

2.6。 CCK-8およびLDH分析による細胞生存率および細胞毒性の測定

細胞生存率分析のために、CCK -8アッセイキット（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）のCell Counting Kit -8（CCK -8）溶液をHaCaTケラチノサイトに添加しました。およびB16F10メラノーマ細胞懸濁液を製造元の指示に従い、37°C​​で4時間インキュベートしました。 簡単に説明すると、2 104細胞を24-ウェルプレートの各ウェルに播種し、5％COとともに37°Cで24時間インキュベートしました。 簡単に説明すると、2 104細胞を24-ウェルプレートの各ウェルに播種し、5％COとともに37°Cで24時間インキュベートしました。 24時間のインキュベーション後、CCK -8試薬を各ウェルに添加し、細胞をさらに4時間インキュベートしました。 細胞毒性検出キット（Roche Applied Science、Switzerland）を使用して、HaCaTケラチノサイト培地での細胞外乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出を測定しました。 VICTORマルチラベルプレートリーダーを使用して、450 nm（CCK -8）および490 nm（LDH）で吸光度を分析しました。

2.7。 ケラチノサイトにおける細胞内ROS産生の評価

細胞内ROSレベルは、{{0}}（および-6）-クロロメチル-2'、7'-ジクロリド-ヒドロフルオレセインジアセテートアセチルエステル（CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）。 すべての手順は、製造元の指示に従って実行されました。 簡単に説明すると、KCの他の部分抽出物（0。5 mg / mL）処理後、ケラチノサイト（HaCaT）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、CM-H2DCFDA（5 µM）と0.5時間インキュベートしました。暗い。 その後、細胞内ROSの生成は、CarlZeiss蛍光顕微鏡を使用して視覚化されました。 蛍光強度は、フローサイトメーター（Fit NXT Flow Cyto、Thermo Fisher Scientific、パサデナ、カリフォルニア州、米国）を使用して蛍光色素（CM-H2DCFDA）に基づいて測定されました。

2.8。 アポトーシスの分析

曝露と処理後、HaCaTケラチノサイトをトリプシン処理して遠心分離しました。 続いて、得られた細胞のアポトーシスを、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）アネキシンV / Dead CellApoptosis Kit（Invitrogen Life Technologies、Carls-bad、CA、USA）を製造元の指示に従って使用して評価しました。 簡単に説明すると、ケラチノサイトをPBSで2回リンスし、アネキシン結合バッファー中のケラチノサイトを取得して、FITC /アネキシンV（成分A）およびヨウ化プロピジウム（PI）作業溶液と混合しました。 暗所で室温で15分間インキュベートした後、ケラチノサイトのアポトーシスを測定し、アポトーシス細胞の割合をフローサイトメーター（Fit NXT Flow Cyto、Thermo Fisher Scientific、カリフォルニア州パサデナ、米国）を使用して計算しました。 FL1（FITC / Nexin V）およびFL3（PI）チャネルのシグナルが検出され、四分円マーカー染色および染色された細胞のドットプロットが確立されました。

2.9。 細胞内メラニン含有量とチロシナーゼ活性の分析

細胞内メラニン含有量とチロシナーゼ活性アッセイは、わずかに変更された手順がどこで異なるかを説明することによって測定されました[24]。 メラノサイトを最終濃度0.5µM-MSHおよび0。5mg /mLKCその他の部分抽出物で48時間処理しました。 メラノサイトペレットを10パーセントDMSO中の1NNaOHで80°Cで1時間溶解しました。 相対的なメラニン含有量は、VICTORMultilabelプレートリーダーを使用して475nmでの吸光度を測定することによって決定されました。 細胞内チロシナーゼ活性は、L-DOPAを使用してドーパクロム産生の速度を測定することによって決定されました。 メラノサイトを氷冷PBSで洗浄し、1％（w / v）TritonX-100を含むPBSで溶解しました。 チロシナーゼ基質L-DOPA（2 mg / mL）は、同じリン酸溶解緩衝液で調製しました。 各抽出物を96-ウェルプレートに入れ、L-DOPA溶液を加えることで酵素分析を開始しました。 1時間のインキュベーション後、VICTORマルチラベルプレートリーダーを使用して475 nmで吸光度を測定し、ドーパクロムの生成を分析しました。 各測定値は、コントロールのパーセンテージとして表されました。 アルブチン（A、0.5 mg / mL）を陽性対照として使用しました。

Cistancheエキナコシドチロシナーゼ阻害剤です。

2.10。 定量的リアルタイムPCR

RNeasy Mini Kit（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用して、メラノサイトの各グループからトータルRNAを単離しました。 大容量cDNA逆転写キット（Thermo Fisher Scientific、米国オクラホマ州マイアミ）を使用して、製造元の指示に従って逆転写を行い、cDNAの最初の鎖を取得しました。 次に、ストランドを、Bio-RadChromo4TM機器とSYBRGreen qPCRマスターミックス（Thermo Fisher Scientific、マイアミ、オクラホマ州、米国）を使用した定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）のテンプレートとして使用しました。 PCRは、95°Cで5分間の前変性、95°Cで15秒間の変性、55〜58°Cで30秒間のアニーリングの下で​​実施しました。 GAPDH mRNAは、チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP-2mRNAの内部参照として使用されました。 標的遺伝子発現の相対値= 2-ΔΔCT。 プライマー配列は次のとおりでした：チロシナーゼセンス（5'-ggccagctttcaggcagaggt -3'）、チロシナーゼアンチセンス（5'-tggtgcttcatgggc aaaatc -3'）、TRP -1-センス（5 '-agccccaactctgtcttttc -3'）、TRP -1-アンチセンス（5'-ggtctccctacatttccagc -3'）、TRP -2-センス（5'- tccagaagtttgacagccc -3 '）、TRP -2-アンチセンス（5'-ggaaggagtgagccaagttatg -3'）、GAPDH-センス（5'-aggtggtctcctctgacttc -3'）、およびGAPDH-アンチセンス（5'-taccaggaaatgagcttgac -3'）。

2.11。 ウエスタンブロッティング

メラノサイトを収集し、哺乳類タンパク質抽出試薬（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して溶解しました。 すべての手順は、製造元の指示に従って実行されました。 すべてのタンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイキット（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して決定されました。 次に、ローディングバッファーをタンパク質上清に加えて混合しました。 混合物を10分間煮沸し、Mini-PROTEAN Precast Gels（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用してタンパク質を分離し、Hybondポリビニルリデンジフルオリドメンブレン（Amersham Biosciences、Piscataway、NJ、USA）に転写しました。 免疫検出は、チロシナーゼ（1：1000）、TRP -1（1：1000）、TRP -2（1：1000）、MITF（1：1000）、リン酸化CREB（p-CREB ​​1： 1000）、CREB（1：1000）、および-tubulin（1：1000）（Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA）、SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）を使用。 メンブレンを一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。 ヤギ抗ウサギ（IgG）二次抗体（1：5000、Cell Signaling Technology）をメンブレンに添加し、室温で1時間インキュベートしました。 タンパク質バンドは、強化されたPierce ECLウエスタンブロッティング基質（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して観察され、-チューブリンバンドの強度に対する標的タンパク質バンドの強度の比率として定量化されました。

2.12。 統計分析

すべてのアッセイを独立して少なくとも3回繰り返した。 すべての統計パラメータは、平均の平均標準誤差（SEM）として表されます。 一元配置分散分析（ANOVA）を使用して統計分析を実行した後、ダンの事後検定を実行しました。 p<><>

フラボノイドのテスト

3.結果

3.1。 KCのいくつかの部分抽出物の抗酸化特性の比較

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS（25.7±2.1パーセント）> KCF（8.7±1.1パーセント）（図1E）。

3.2。 UVA、UVB、または非照射の存在下でKCのいくつかの部分抽出物で処理された生存可能なケラチノサイトと損傷したケラチノサイトの比較

KCR、KCS、KCL、およびKCFオンケラチノサイトの効果を調べるために、次の実験を行いました。 まず、すべての抽出物を、UVA、UVB、または非照射の存在下でHaCaTケラチノサイトに適用しました。 CCK -8分析は、抽出物が0 .5 mg/mLの濃度でケラチノサイトの生存率を有意に変化させなかったことを示しました。 その後、ケラチノサイトは、UVAまたはUVB照射の存在下でKCR、KCS、KCL、およびKCFで処理されました。 図2AのCCK-8分析で示されているように、UVAおよびUVB照射はケラチノサイトの生存率を大幅に抑制しました。 しかし、UVAおよびUVBを照射したケラチノサイトの生存率は、KCL、KCR、KCS、およびKCFの順序で増加することがわかりました（図2A）。 また、細胞外LDH放出を測定することにより、損傷したケラチノサイトを監視しました。 結果は、UVAまたはUVB照射がLDH放出を有意に促進することを示しました。 ただし、KCL、KCR、KCS、およびKCFは、UVAまたはUVBにこの順序で曝露すると、LDH放出を大幅に減衰させました（図2B）。 上記の実験結果は、ケラチノサイトに対するＵＶＡまたはＵＶＢ照射の抗増殖および細胞毒性効果が、ＫＣＬ、ＫＣＲ、ＫＣＳ、およびＫＣＦの順序で軽減されることを示した。 特に、KCLは細胞の生存率を制御レベルに戻すことができます。

図2.UVA、UVB、または非照射の存在下でのKCR、KCS、KCL、およびKCF抽出物のケラチノサイト生存率および細胞毒性効果。

3.3。 UVAおよびUVB照射の存在下または非存在下でKCのいくつかの部分抽出物で処理されたケラチノサイトにおける細胞内ROS産生の比較

ROSの細胞内産生は深刻なケラチノサイト損傷を引き起こすため、それらはUVAまたはUVB放射線誘発損傷の潜在的なメディエーターと見なされます。 いくつかの研究は、UVAまたはUVB照射が内因性ROS産生を誘発することを示唆しています[12,14]。 UVAまたはUVBを照射したケラチノサイトで内因性ROSレベルが増加したかどうかを判断することを目的としました。 したがって、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを使用して、プローブCM-H2DCFDAの細胞内蛍光強度を分析しました。 蛍光顕微鏡の結果として、CM-H2DCFDA染色画像は​​、コントロール、KCR、KCS、KCL、およびKCFで処理されたケラチノサイトでわずかな染色を示し、UVAまたはUVBで照射されたケラチノサイトで有意な染色を示しました（図3A）。 フローサイトメトリーの定量化された結果によると、UVAおよびUVB照射は、対照（5.7）と比較して、ケラチノサイトの細胞内ROSレベルをそれぞれ27.2±4.5％および34.1±4.2％増加させました。 ±0。2パーセント）。 さらに、蛍光顕微鏡の結果と同様に、細胞内ROSレベルは、UVAまたはUVB照射の存在下でKCL> KCR> KCS> KCFの順序でKC抽出物によって抑制されることが確認されました（図3B）。 これらの結果は、KCのいくつかの部分抽出物が、内因性ROSレベルを低下させることによってケラチノサイトの損傷を有意に抑制したことを示しています。

図3.UVA、UVB、または非照射ケラチノサイトの細胞内ROS生成に対するKCR、KCS、KCL、およびKCF抽出物の影響

3.4。 UVAおよびUVB照射の存在下または非存在下でKCのいくつかの部分抽出物で処理されたケラチノサイトのアポトーシスの比較

ケラチノサイト損傷の信頼できる指標であるアポトーシスを検出するために、ケラチノサイトをヨウ化プロピジウムと組み合わせたアネキシンVで染色しました。 フルオレセインイソチオシアネート（FITC）アネキシンV /デッドセルアポトーシスキットを使用して、ケラチノサイトのアポトーシス率をテストしました。 UVAおよびUVB照射は、アネキシンV染色活性を促進しましたが、KCR、KCS、KCL、およびKCFは、UVAおよびUVB照射の存在下でアネキシンV染色活性率を低下させました。 KCR、KCS、KCL、およびKCFのみ（0 .5 mg / mL）は、アネキシンV染色活性を誘導しませんでした。 フローサイトメトリーからの定量化されたデータは、UVAおよびUVB照射がケラチノサイトのアポトーシスレベルを46.3増加させることを示しました± 1.5パーセントと48.7 ± 1. 0パーセント、それぞれ、コントロールのパーセントと比較（5。0パーセント ± 0。7パーセント）。 重要なことに、アポトーシスのレベルは、UVAまたはUVB照射の存在下でKCL> KCR> KCS> KCFの順序でKC抽出物によって抑制されることが確認されました（図4A、B）。 全体として、UVAおよびUVB照射はケラチノサイト損傷を引き起こし、KCのいくつかの部分抽出物はUV照射によって誘発されたケラチノサイト損傷を弱めました。

図4.UVA、UVB、または非照射ケラチノサイトのアポトーシスに対するKCR、KCS、KCL、およびKCF抽出物の影響。

3.5。 -MSH処理の存在下または非存在下でKCのいくつかの部分抽出物で処理されたメラノサイトの細胞内メラニン含有量とチロシナーゼ活性の比較

KCR、KCS、KCL、およびKCFの-MSH誘発メラニン形成に対する生物学的可能性を調査する前に、KCR、KCS、KCL、およびKCF（0 .5 mg / mL）処理後の細胞生存率を以下を使用して評価しました。 -MSHの有無にかかわらずメラノサイトB16F10のCCK-8アッセイ。 KCR、KCS、KCL、およびKCF（0.5 mg / mL）は、-MSHの存在下または非存在下で細胞生存率を変化させませんでした（図5A）。 -MSHは、メラノコルチン1受容体に結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化することにより、細胞内メラニン含有量を増加させることができる重要なメラニン形成剤です。 メラノサイトのメラニン形成に対するKCR、KCS、KCL、およびKCFの影響を調査するために、細胞内メラニン含有量を目視観察および生化学的測定によって決定しました。 図5Bに示すように、細胞内メラニン含有量は-MSHによって有意に増加しました。 ただし、KCR、KCS、KCL、およびKCFとの同時処理は、-MSH処理と比較して細胞内メラニン含有量の顕著な減少を示しました。 細胞内メラニン含有量の阻害を示す生化学的測定のシーケンスは次のとおりでした：KCL> KCR> KCS> KCF（図5B）。 細胞内メラニン含有量アッセイに従って、細胞内チロシナーゼ活性アッセイを実施した。 -MSHで刺激されたメラノサイトの細胞内チロシナーゼ活性は増加しましたが、KCR、KCS、KCL、およびKCFで処理された-MSHで刺激されたメラノサイトの細胞内チロシナーゼ活性は減少しました。 細胞内チロシナーゼ活性の阻害を示す生化学的測定のシーケンスは次のとおりでした：KCL> KCR> KCS> KCF（図5C）。 これらの結果は、KCのいくつかの部分抽出物が、細胞の生存率を変えることなく、細胞内メラニン含有量を大幅に減少させ、チロシナーゼ活性を阻害したことを示しています。

3.6。 KCのいくつかの部分抽出物の存在下または非存在下で処理されたメラノサイトにおけるチロシナーゼ、TRP -1、およびTRP-2の転写および翻訳レベルの比較-MSH治療

メラニン形成マーカー（チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP -2）のタンパク質およびmRNA発現レベルのダウンレギュレーションに対するKCR、KCS、KCL、およびKCFの効果を調べるために、メラノサイトをKCRで処理しました。 、-MSHの存在下または非存在下でのKCS、KCL、およびKCF。 図6A–Cに示すように、チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP -2のmRNAレベルは、-MSH処理によって大幅に増加しました。 対照的に、-MSH処理と比較して、KCR、KCS、KCL、およびKCFは、チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP-2のmRNA発現をダウンレギュレーションしました。 さらに、KCR、KCS、KCL、およびKCFだけでは、チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP-2mRNAレベルに有意な影響はありませんでした。 ウエスタンブロット分析は、リアルタイムPCRと協力して実行されました。 結果は、-MSH処理がチロシナーゼ、TRP -1、およびTRP -2のタンパク質発現レベルを増加させ、これらのレベルがKCR、KCS、KCL、およびKCFとの同時処理によって減少したことを示しました（図6D ）。 チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP -2 mRNAおよびタンパク質発現の阻害を示す定量的リアルタイムPCRおよびウエスタンブロットのシーケンスは次のとおりでした：KCL> KCR=KCS> KCF（図6）。 これらの結果は、KCのいくつかの部分抽出物が抗メラニン形成を促進する可能性があることを示唆しており、これはメラニン形成マーカーのダウンレギュレーションによって示されました。

3.7。 -MSH処理の存在下または非存在下でKCのいくつかの部分抽出物で処理されたメラノサイトのMITF発現とCREBリン酸化の比較

チロシナーゼ、TRP -1、およびTRP-2はメラニン形成に不可欠です。 それらの発現はMITF発現とCREBリン酸化によって調節されています[17,21]。 ウエスタンブロット分析は、KCR、KCS、KCL、およびKCFが-MSH処理によって引き起こされるMITFのタンパク質レベルの増加を効果的に阻害したことを示しました。 さらに、KCR、KCS、KCL、およびKCFだけでは、MITFタンパク質の発現はほとんど検出されませんでした。 MITFタンパク質発現レベルの阻害を示す定量化されたウエスタンブロット結果のシーケンスは次のとおりでした：KCL> KCR> KCS> KCF（図7A）。 さらに、KCR、KCS、KCL、およびKCFは、CREBリン酸化に対する-MSH処理の効果を逆転させました。 KCR、KCS、KCL、およびKCFだけでは、CREBリン酸化にほとんど影響しませんでした。 CREBリン酸化レベルの阻害を示す定量化されたウエスタンブロット結果のシーケンスは次のとおりでした：KCL> KCR> KCS> KCF（図7B）。 これらの結果は、KCのいくつかの部分抽出物が、MITF発現およびCREBリン酸化を介して、少なくとも部分的にメラニン形成メラノサイトを抑制したことを示した。

4。議論

美白の人気は、紫外線照射の増加により世界中で高まっており、審美的な目的で今後数十年で高い割合に達する可能性があります[8]。 コウジ酸やアルブチンなどの多くの種類の漂白剤が、化粧品や医薬品の市場で使用されてきました。 さらに、天然抽出物は、その潜在的な抗酸化作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用、抗菌作用、およびその他の活性のためにますます注目を集めています[26,27]。 抗酸化剤と光防護および抗メラニン形成の特性に基づいて、いくつかの化粧品および医薬品の候補が開発されました。 美白候補のこれらの特性は、化粧品および医薬品の研究開発に不可欠な貢献者であることはよく知られています[28]。 TDMは、マルチコンポーネントおよびマルチターゲットの特性を備えており、人間の生物学的有効性と生活の質を大幅に向上させます[29]。 現代の植物化学研究によると、KCにはさまざまな成分が含まれており、リグナンとテルペノイドが主成分です[30]。 ジベンゾシクロオクタジエンリグナン、スピロベンゾフラノイドジベンゾシクロオクタジエンリグナン、アリールナフタレンリグナン、カドロンギラクトントリテルペノイド、セスキテルペノイドなど、202を超える化合物が同定されています[31,32]。 KCの乾燥した根、茎、および葉は、関節リウマチ、十二指腸潰瘍、胃腸障害、および婦人科の問題を治療するためにTDMで使用される幅広い伝統があります。 KCの乾燥した根は、熱を取り除き、毒素を排除し、浮腫を取り除くための利尿を誘発します。 KCの果物は主に新鮮な果物、ジュース、フルーツワインの形で消費され、人間の健康に有益であることを示しています[7,33,34]。 以前の研究では、リグナン、トリテルペノイド、フラボノイド、フェノール酸、ステロイド、アミノ酸など、栄養価と薬効が高い生物活性成分が豊富に含まれていることも示されています[3,35]。 この研究では、KCのさまざまな部分が抽出されました。 特に、KCの葉と根のポリフェノールとフラボノイドの総含有量は、茎と果実の含有量よりもはるかに高かった。 葉と根には、茎や果実の2倍以上のポリフェノールとフラボノイドが含まれています。 その結果、総ポリフェノールとフラボノイドがKCの光防護効果と抗メラニン形成効果に大きく貢献していると考えています。

紫外線によって引き起こされる皮膚の光毒性は、主に細胞の細胞毒性、細胞内のROSの蓄積、およびケラチノサイトのアポトーシスによるものです。 したがって、UVAおよびUVBを照射したケラチノサイトにおける細胞毒性、細胞内ROS蓄積、およびアポトーシスの阻害に焦点を当てることはより合理的です[36,37]。 この研究[10,38]で説明されているように、光細胞毒性（UVA：20 J / cm2、UVB：50 mJ / cm2）の結果に対するKC抽出物の介入は、KC抽出物が細胞毒性、細胞内ROS蓄積、およびアポトーシス。 以前の結果と一致して、KCの葉と根の光防御効果は茎と果実のそれよりはるかに高かった。 さらに、我々の結果は、KC抽出物が抗酸化活性を促進することによって上記の効果を示すことを示した。 メラニン形成は、UV照射後にしばしば観察され、主に色素沈着または色素沈着過剰に関連しています[39]。 以前の研究によると、-MSHを使用してメラニン形成を誘発する方法は広く認識され、適用されてきました。 したがって、この研究は、-MSHで刺激されたメラノサイトモデルの構築に基づいていました[24,39]。 KC抽出物が-MSHで刺激された細胞内メラニン含有量とチロシナーゼ活性を抑制していることを発見しました。 さらに、KC抽出物は、-MSHで刺激されたメラノサイトにおけるチロシナーゼ、TRP -1、TRP-2などのメラニン形成マーカーの転写と翻訳をダウンレギュレートしました。 さらに、-MSHで刺激されたメラノサイトにおけるMITFタンパク質の発現とCREBのリン酸化を調べました。 同様に、この研究では、KC抽出物がメラノサイトにおける-MSHを介したMITFタンパク質の発現とCREBのリン酸化を抑制することを発見しました。 光防護の結果と一致して、KCの葉と根の抗メラニン形成効果は茎と果実のそれよりはるかに高かった。

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5。結論

全体として、KC抽出物の潜在的な光防護および抗メラニン形成効果がこの研究で発見されました。 ポリフェノールとフラボノイドの含有量が高いKC抽出物は、ケラチノサイトとメラノサイトに対して光防御効果と抗メラニン形成効果を発揮する可能性があります。