RNAシーケンスに基づいた腎臓老化におけるLncRNAの役割の予測Ⅱ
Jan 26, 2024
lncRNA Gm43360 とその潜在的な標的 mRNA の相関関係
LncRNA Gm43360 は、2 つの lncRNA-mRNA 共発現ネットワークを接続しているため、研究のために選択されました。 Adra1a の発現レベルは Gm43360 の発現レベルと正の相関があり (rho=0.8650、p=0.026)、Csnk1a1 (カゼインキナーゼ 1A1) は負の相関があった (rho{{12 }}.8084、p=0.0084) (図 5a)。 lncRNA Gm43360 とその潜在的な標的 mRNA である Adra1a および Csnk1a1 の相関をさらに検証するために、この研究では lncRNA Gm43360 の過剰発現プラスミドを設計しました。 Csnk1a1 の発現は予想どおり減少し、Adra1a の発現も減少しましたが、有意ではありませんでした。 次に、siRNA によって lncRNA Gm43360 をノックダウンし、その標的 mRNA の発現が影響を受けるかどうかを検出しました。 予想通り、Csnk1a1は、siRNA陰性対照群と比較して、lncRNA Gm43360ノックダウン細胞で増加しました（図5b）。 10、細胞周期におけるlncRNA Gm43360の役割を検出しました。 細胞計数キット-8（CCK-8）の結果は、lncRNA Gm43360が細胞生存率を促進することを示しました（図5c）。 結果は、lncRNA Gm43360が陰性対照と比較してS期細胞の割合を増加させ、G1期細胞の割合を減少させたことを示した(図5d)。 Te p53 および p21 タンパク質は細胞周期の調節に関与しており、したがって細胞老化の痕跡でした。 p53およびp21の発現レベルは、対照群と比較して過剰発現群で有意に減少した。 p53およびp21の発現レベルは、siRNA対照グループと比較してsiRNAグループで有意に増加しました（図5e）。 lncRNA Gm43360の過剰発現により、SA- -gal陽性細胞の数が減少し、トランスフェクトGm43360のグループでは-gal陽性細胞が増加しました（図5f）。 総合すると、これらの結果は、lncRNA Gm43360 が尿細管上皮細胞の老化を阻害することを示しました。Csnk1a1の発現を阻害する.
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議論
本研究では、若年マウスと老マウスの腎臓から採取したmRNA発現データを評価し、異常発現したmRNAの機能を明らかにする生体情報解析を実施した。 我々は、347 の上方制御された mRNA と 355 の下方制御された mRNA、および 130 の上方制御された lncRNA と 91 の下方制御された lncRNA を観察しました。老齢マウスの腎臓と若いマウスの腎臓の比較。 さらに、これらの mRNA は、次のような老化関連経路に関与していることが示されています。酸化的リン酸化、AMPKシグナル伝達経路、Wntシグナル伝達経路、Rap1シグナル伝達経路、および加齢関連疾患は、腎老化の病因における差次的に発現されるmRNAの機能を実証した。
長い非コード RNA NEAT1 は、腎尿細管上皮細胞における腎線維症の進行における保護因子です [21]。 偶然にも、我々の配列決定結果では、老齢マウスの腎臓では若いマウスよりもlncRNA NEAT1の発現レベルが低く、これは以前の知見と一致している。 LincRNA-Gm4419 は、糖尿病性腎症における NF-kB/NLRP3 インフラマソーム媒介機構により炎症と線維症を促進します [22]。 我々の配列決定結果では、Gm4419 の発現が若いマウスよりも老齢マウスの腎臓で高いこともわかりましたが、有意な差はありませんでした。 LncRNA Gm43360 は第 5 染色体 (Chr5:122494022–122,494,908、2887 bp) に位置します。 UCSC ゲノムブラウザによると、Gm43360 はタンパク質をコードする遺伝子 Atp2a2 のイントロンに位置しています。 しかし、これまでに lncRNA Gm43360 の疾患への関与に関する報告はありません。 この研究では、lncRNA Gm43360 のノックダウンにより腎尿細管上皮細胞の老化が促進されました。 さらに、シーケンス結果から発現の異なる多くの lncRNA を特定し、それらを調査しました。
LncRNA は、lncRNA の制御機構に基づいてシス制御またはトランス制御に分類されました。 シス作用性 lncRNA は、プロモーター、エンハンサー、調節配列などのシス作用性エレメント (lncRNA と mRNA 間の距離が 100 kb 未満) に依存することにより、隣接する遺伝子の発現に影響を与える可能性があります。 トランス作用性 lncRNA は、トランスフェクション部位を離れ、離れた部位で機能する lncRNA を指します (つまり、lncRNA と mRNA の間の距離は 100 kb を超えます) [23]。 lncRNA MAAT は、シス制御モジュールを通じて隣接遺伝子 Mbnl1 の発現を増加させます [24]。 lncRNA Pnky は、皮質の発達においてトランス作用性調節因子としての役割を果たしています [25]。 この研究では、lncRNA Gm43360 と Csnk1a1 の間にトランスレギュレーション関係が存在しました。 Csnk1a1 は、細胞周期と細胞分裂プロセスに関与するタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子 [26] です [27]。 Csnk1a1 のダウンレギュレーションにより誘発される老化に伴う炎症結腸直腸腫瘍における増殖停止を伴う反応[26]。 Gm43360 が上方制御されると、Csnk1a1 は下方制御されました。 したがって、lncRNA Gm43360 が関与している可能性があります。腎臓の老化によるCsnk1a1発現の調節.
結論
lncRNA-mRNA 共発現ネットワークの研究腎臓の老化lncRNA、lncRNA Gm43360が腎臓の老化において保護的な役割を果たしている可能性があることを明らかにし、腎臓の老化に関与するメカニズムについての理解を広げました。腎臓の老化
材料と方法
サンプル 若齢 (3- 月齢) および老齢 (24- 月齢) の雄 C57BL/6J マウスを厦門大学実験動物センターから購入し、標準的な環境で飼育しました。 すべてのマウスには餌と水を自由に摂取させた。 マウスは屠殺される前に 1 か月間新しい施設に慣れさせました。 検体採取前に、マウスを７５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射することによりウレタンで麻酔した。 若いマウスと古いマウスを同じ日に屠殺しました。残存マウス腎臓各アッセイの配列決定には組織を使用しました。 RNA-seq と組織病理学が行われました。別々の腎臓同じマウスから。 腎臓組織をマウスから採取した。 1 つの腎臓はその後の切片包埋のために直ちに 10% 中性緩衝ホルマリンに浸漬され、もう 1 つの腎臓はいくつかの組織に分割され、直ちに液体窒素に入れられ、-80 度で保存されました。 この研究は、西安交通大学第一附属病院（中国陝西省）の倫理委員会（番号2018-G-164）の支援を受けた。 すべての方法は、動物倫理ガイドラインおよび規制に従って実行されました。 この研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。
腎臓の病理組織学
若年マウスと老マウスの腎組織サンプルを 10% パラホルムアルデヒド溶液で一晩固定しました。 切片のうち 10 枚を脱水し、パラフィン包埋し、4- μm の厚さで切片にしました。 PAS およびマッソン三色染色は、標準的なプロトコールを使用して実行されました。 画像をカメラで撮影し、染色陽性領域を測定しました。 病理組織カメラ画像の領域は、Image-Pro Plus 6.0 を使用して計算されました。
SA-gal 染色
SA{0}} gal 活性は、SA- - gal 染色キット (Cell Signaling Technology #9860) を製造業者のプロトコールに従って使用して分析しました。 陽性染色の領域を測定し、Image-Pro Plus 6.0 を使用して SA- - 陽性細胞を計算しました。
RNA抽出ライブラリの構築と配列決定
Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 はシーケンス ライブラリの構築に使用されました。 全 RNA の抽出後、Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) を使用して 2 ラウンドの精製を行い、mRNA を全 RNA (5ug) から精製しました。 精製後、高温で二価陽イオンを使用して mRNA を短い断片に分割しました (マグネシウム RNA 断片化モジュール (NEB、カタログ e6150、米国)、94 度 5-7 分)。 次に、切断された RNA フラグメントを SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen、カタログ 1,896,649、米国) によって逆転写して cDNA を取得し、次にこれを使用して大腸菌 DNA ポリメラーゼ I ( NEB、カタログ m0209、米国）、RNase H (NEB、カタログ m0297、米国)、および dUTP ソリューション (Termo Fisher、カタログ R0133、米国)。 次に、A 塩基を各鎖の平滑末端に追加し、インデックス付きアダプターへのライゲーションの準備をしました。 各アダプターには、アダプターを A 尾部断片化 DNA に連結するための T 塩基オーバーハングが含まれていました。 デュアルインデックスアダプターをフラグメントにライゲーションし、AMPureXP ビーズを使用してサイズ選択を実行しました。 U標識二本鎖DNAを熱不安定性UDG酵素（NEB、カタログm0280、米国）で処理した後、ライゲーション産物を次の条件でPCRで増幅しました。95度で3分間の初期変性。 98度で15秒間の変性、60度で15秒間のアニーリング、および72度で30秒間の伸長を8サイクル。 その後、72度で5分間最終伸長します。 最終的な cDNA ライブラリーの平均挿入長は 300±50 bp でした。 最後に、メーカーのプロトコールに従って、Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd.、杭州、中国) で 2×150 bp ペアエンド シーケンス (PE150) を実行しました [28]。
バイオインフォマティクス分析 クリーンリードのシーケンスとフィルタリング
プールされたRNAからテクノロジーによって構築されたcDNAライブラリー腎臓サンプルのマウスの配列を決定し、Illumina NovaseqTM 6000 配列プラットフォームで実行しました。 イルミナのペアエンド RNA-seq アプローチを使用して、トランスクリプトームの配列を決定し、合計 100 万件の 2 x 150 bp ペアエンド リードを生成しました。 シーケンスマシンから取得されたリードには、アダプターや低品質の塩基を含む生のリードが含まれており、これらは次のアセンブリおよび分析に影響を与えます。 したがって、高品質のクリーンリードを取得するために、リードは Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/、version:cutadapt-1.9) によってさらにフィルタリングされました。 パラメータは次のとおりです。
1) アダプターを含む読み取りを削除します。
２）ポリＡおよびポリを含むリードを除去する。
3) 5% を超える未知のヌクレオチド (N) を含むリードを削除します。
４）２０％を超える低品質（Ｑ値２０以下）塩基を含む低品質リードを除去する。
10 個の配列の品質は、FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/、0.11.9) を使用して検証されました。 これには、クリーン データの Q20、Q30、および GC コンテンツが含まれます。 その後、合計 G bp のクリーンなペアエンドリードが生成されました。 生の配列データは、アクセッション番号 GSE154223 で NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) データセットに提出されています。
参照ゲノム/アノテーションは Mus_musculus.GRCm38 でした。 分析に使用された遺伝子アノテーションのソースとバージョンは Ensembl_ v88 でした。
トランスクリプトのアセンブリ
まず、Cutadapt [29] を使用して、アダプターの汚染、低品質の塩基、および未決定の塩基を含むリードを除去しました。 10 配列の品質は、FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/) を使用して非常に高く評価されました。 我々は、Bowtie2 [31] と Hisat2 [32] を使用して、リードをマウスのゲノムにマッピングしました。 各サンプルのマッピングされたリードは、StringTie [33] を使用して組み立てられました。 10、すべてのトランスクリプトから腎臓サンプルPerl スクリプトを使用して包括的なトランスクリプトームを再構築するためにマージされました。 最終的なトランスクリプトームが生成された後、StringTie [33] とedgeR [34] を使用して、すべての転写物の発現レベルを推定しました。
LncRNAの同定
まず、既知の mRNA と重複する転写物および 200 bp より短い転写物は廃棄されました。 次に、CPC [35] と CNCI [36] を利用して、コーディングの可能性のある転写産物を予測しました。 CPC スコア付きのすべてのトランスクリプト<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.
差次的発現解析遺伝子 (DGE) 解析
StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 つは差次的に発現される遺伝子と考えられました。
lncRNAの標的遺伝子予測と機能解析
lncRNA の機能を探索するために、lncRNA のシス標的遺伝子を予測しました。 LncRNA は、隣接する標的遺伝子に作用する際にシスの役割を果たしている可能性があります。 この研究では、100 個の 000 上流および下流のコーディング遺伝子が Perl スクリプトによって選択されました。 次に、BLAST2GO スクリプトを使用して、lncRNA の標的遺伝子の機能解析を示しました [39]。 パブリック ドメインへの完全なコマンド リンクは、メイン · dandan-li/Jie-Li (github.com) にある Jie-Li/README.md でした。
遺伝子オントロジー (GO) カテゴリーと京都遺伝子・ゲノム百科事典 (KEGG) 分析
RNA シーケンスのためのバイオインフォマティクス分析は、OmicStudio ツール (http://www.omicsudio.cn/tool) を使用して実行されました。 予測された標的遺伝子の生物学的機能を分析するために、ジーンオントロジー (GO) 機能エンリッチメント分析と京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) [37-39] エンリッチメント分析が使用されました。 GO 分析は、細胞組成、分子機能、生物学的プロセスの 3 つの側面を通じて主要な生物学的プロセスを明らかにします (http://www.geneontology.org/)。 分析では、最初にすべての発現差のある遺伝子とバックグラウンド遺伝子を GO データベースに入れます。 各項目がマッピングされ、各項目内の遺伝子の数が計算され、超幾何分布を使用して仮説検定が実行され、エンリッチメント結果の P 値が取得されます。 P 値が低いほど、濃縮結果はより重要になります。 KEGG は、標的遺伝子に関連する重要な経路を探索するために、遺伝生物学によって差次的に発現される mRNA を解析するデータベース リソースです (https://www.genome.jp/kegg/)。 結果は p 値で表されます。 p 値が低いほど、濃縮結果はより重要になります。
qRT-PCR
GAPDH を内因性対照として使用しました。 次に、未知の遺伝子の相対発現量を計算しました。 すべてのプライマーは、この実験のために特別に設計および合成されました。 GAPDH用のプライマーが商品化されています。 Adra1a および Csnk1a1 プライマーの特異性は、融解曲線の単一ピークによって特定されました。
mRNA-lncRNA 共発現ネットワークの構築
トランスレギュレーションは研究に基づいており、トランスエネルギーが計算されました。 トランスエネルギーが小さいほど結合する可能性が高くなります。 次に、mRNA-lncRNAの相関係数も計算した。 mRNA-lncRNA ネットワークは、0.9 を超えるスピアマン相関係数を選択することによって構築されました。 mRNA-lncRNA 共発現ネットワークは、Cytoscape ソフトウェア (v3.7.1) を使用して構築されました。
細胞培養
マウス腎近位尿細管上皮細胞 (MRPT-EpiC) を、2% ウシ胎児血清 (FBS、カタログ番号 0010) を含む上皮細胞培地 - 動物 (EpiCM-a、カタログ番号 4131) および上皮細胞増殖サプリメント - 動物で培養しました。 (EpiCGS-a、カタログ番号 4182) 抗生物質を含まず、37 度、5% CO2 の加湿インキュベーター内で保管しました。 培地は 2 ～ 3 日ごとに交換しました。 対数増殖期の細胞は、増殖が90%に達した時点で継代培養した。 トリプシンで消化した細胞懸濁液を、各ウェルに 2*104 -5*104 個の細胞を含む 6- ウェル プレートに播種しました。 トランスフェクションに使用した細胞はすべて第 2 世代から第 5 世代の間でした。
プラスミド構築と細胞トランスフェクション
lncRNA Gm43360 過剰発現プラスミドは、GeneChem (上海、中国) によって構築されました。 プラスミド骨格は GV658 で、CMV プロモーターが lncRNA 発現を駆動しました。 クローン化されたヌクレオチド配列は補足資料で提供されます。 lncRNA Gm43360 ノックダウンの場合、3 つの lncRNA ENS が siRNA を00000197656-ターゲットしなければなりません（lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA） UGAAGUUTT-3'; および lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3'）は、GenePharma（中国、上海）で設計および合成されました。 製造業者のプロトコールに従って、ウェルあたり6μlのLipofectami™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA)を用いて、細胞を2500 ngのプラスミドまたは100 pmolのsiRNAでトランスフェクトしました。 RNA およびタンパク質の発現レベルはトランスフェクションの 48 時間後に検出され、各実験は少なくとも 3 回繰り返されました。 リアルタイム定量的 PCR を使用して、lncRNA Gm43360 の過剰発現とノックダウンの効率を検証しました。
ウェスタンブロット分析
培養細胞を氷冷したPBSで洗浄し、120μlのRIPA緩衝液（ハート、中国）を加え、プロテアーゼ阻害剤およびPMSF（ハート、中国）を加えて氷上で30分間静置した。 細胞を異なる微量遠心管に集めた後、タンパク質濃度を定量しました。 ローディングバッファーを各サンプルに加え、7 分間煮沸しました。 サンプル 30 マイクログラムを 12% SDS-PAGE (Beyotime、中国) で分離し、PVDF 膜 (Thermo Fisher、米国) に電気転写しました。 次に、膜を 5% ミルクでブロックしました。 メンブレンを特定の一次抗体、抗 p21 (1:1000、Abcam、ab109199)、抗 p53 (1:1000、Proteintech、10442-1-AP)、および抗 GAPDH (1:3000、Profintech) とインキュベートしました。 、60004-1-Ig) 4 度で一晩。 TBSTで洗浄した後、膜を二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。 タンパク質のバンドは、化学発光キット (Millipore、米国) を使用して観察されました。 GAPDH の発現を使用してタンパク質レベルを正規化しました。
細胞増殖アッセイ
細胞増殖能力は、細胞計数キット-8 (CCK-8) アッセイによって測定されました。 トランスフェクションの48時間後、90μlの新しい培地および10μlのCCK-8溶液を各ウェルに添加した(Beyotime、C0042)。 細胞を 5% CO2 中で 37 度で 1 ～ 4 時間インキュベートし、ユニバーサル マイクロプレート リーダー (Bio-Tek、米国) によって 450 nm で測定しました。
フローサイトメトリー分析
トランスフェクションの前日に細胞を6-ウェルプレートに播種しました。 トランスフェクションの 48 時間後、細胞をトリプシン処理し、1000 rpm で 5 分間遠心分離しました。 次に、細胞を 70% エタノール中で 4 度で少なくとも 4 時間固定しました。 遠心分離後、RNase A およびヨウ化プロピジウム (PI) 染色溶液を細胞に添加し、次いで細胞を室温、暗所で 30 分間インキュベートしました。 Te 染色された細胞は、ACEA NovoCyte (Biosciences, USA) を使用して分析されました。
統計分析
正規分布による測定データは平均値±SDで表示しています。 2 つの異なるグループ間の差は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して決定され、p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 すべての計算は、GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc.、米国) を使用して実行されました。
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