実験的肝障害に対するシスタンチェサルサからの総配糖体の保護効果

連絡先:オードリーフーワットサップ/ hp:0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

ワン・ヤンファン、チャオ・ジジュン、ハイ・ペンリ、シュエ・ペイフェン、リー・ホイ、リー・ミンホイ

要約

本実験では、マウスのアルコール性肝障害のモデルを確立し、肝機能の生化学的指標と肝組織病理学的変化を検査指標とした。調査する実験的アルコール性肝障害に対するシスタンチェサルサの全配糖体の保護効果.合計を与えるシスタンチェサルサの配糖体陽性対照薬として、高用量(130mg/kg)および経管栄養による中用量(100mg/kg)、低用量(65mg/kg)、および2座(150mg/kg)を投与する。結果は、血清ALTおよびASTが有意に増加することを示した。肝臓におけるSOD活性が低下し、MDA含量が増加する。肝細胞のリピドーシスが現れる。シスタンチェサルサ高用量群の総配糖体は、肝機能指数を改善し、肝細胞の脂質変性を減少させるのに有効である。これに基づいて、エキナコシドそしてアクテオシドシスタンチェサルサの全配糖体中の含量は29.1%であった。上記の実験は、シスタンチェサルサの全配糖体がマウスのアルコール性肝障害に対して保護効果を有することを示し、また、エキナコシドおよびアクテオシドがシスタンチェサルサの全配糖体の主な有効成分であることも確認された。

キーワード: シスタンチェサルサの総配糖体;高速液体クロマトグラフィー;アクテオシド;エキナコシド;アルコール性肝障害

チタンチェサルサは、サリナとしても知られるオロバンチャ科(Orobanchaceae)のシスタンチェ植物で、主に砂漠、砂漠、その他の乾燥地域に分布する多年生の草本寄生植物です。主な産地は新疆ウイグル自治区と内モンゴル自治区です。同科・同属のハーブ・シスタンチェが大量に発掘され、寄生植物の繁殖が困難なため、薬用資源は日々減少しており、市場の需要を満たすことは困難である。私たちの国では、民俗シスタンチェサルサはシスタンチェデゼルティコラの代用品として使用されていますが、その研究報告はほとんどありません。その薬効価をさらに明らかにするために、フェニレタノイド配糖体を含む物質の一種であるシスタンチェサルサの全配糖体(シスタンチェサルサの全配糖体)が薬理学的に研究されている。シスタンチェサルサの総配糖体は、神経に保護効果を有する[2]水酸基(OH・)による酸化的損傷からDNAを保護できるシスタンシェサルサフェニルエタノイド配糖体は、マウスの心臓、肝臓、および脳組織におけるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性を有意に増加させることができる[4]。上記の研究は、シスタンチェサルサの全配糖体抗酸化作用があります。

私の国では、アルコール性肝疾患(ALD)の発生率は年々増加しています。アルコールは、ウイルス性肝炎[5]に次いで肝障害の2番目に主要な原因となっています。アルコール性肝障害の治療のために、安全で効果的な薬物が不足しています。植物資源を使用して抗アルコールおよび肝臓保護薬および健康製品を開発する方法は、製薬および食品業界で広く注目されています。広範な文献の後、アルコール性肝障害が酸化ストレスに関連していることが見出されており、シスタンチェサルサの総配糖体は、アルコール性肝臓傷害に効果を有するy.保護効果に関する研究はまだ空白です。この実験の研究は、シスタンチェサルサの全配糖体の開発と利用のための科学的根拠を提供します。

1 材料と設備

1. 1 医薬品と試薬

チスタンチェサルサモンゴル薬用材料の識別と標準化のキーラボラトリー、包頭医科大学によって提供されました。Bifendate滴下丸薬(浙江省万坊製薬有限公司、バッチ番号A02121139);アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)キット、アスパルテーム酸アミノトランスフェラーゼ(AST)キット、マロンジアルデヒド(MDA)テストキット、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)キット、クーマシーブリリアントブルータンパク質測定キット(南京建城バイオエンジニアリング研究所、バッチ番号20110422);56°酒(北京レッドスター有限公司);他の試薬は国内で純粋です。

1. 2匹の動物

昆明種の雄マウス72匹、体重17〜22g(内モンゴル大学実験動物センター、動物資格証明書番号:6(モンゴル2002-0001))。

1. 3つの楽器

紫外可視分光光度計[ウニコ(上海)計器有限公司、モデルUV-2000];マイクロプレートリーダー(ベックマンコールター、米国、モデルAD340);高速遠心分離機(杭州アイプ機器有限公司、モデルTG18-WS);高速液体クロマトグラフ(サーモフィッシャーサイエンティフィック、モデルアルティメット3000);分析天秤(メトラートレドインスツルメンツ社製モデルAR153O);超音波発振器 (上海ブランソン, モデルSB3200);凍結乾燥剤(北京ボイカン実験機器有限公司、モデルFD-1-50)。

2 方法と結果

2. 1 シスタンチェサルサ活性の全配糖体に関する研究

2. 1.1 シスタンチェサルサ抽出の全配糖体

2. 1.1. 1 粗抽出物の抽出

シスタンチェサルサ粗粉末100gを秤量し、600mLの70%エタノールを加えて3時間浸漬し、超音波抽出を30分間、フィルター、フィルター残渣上で上記のステップを2回繰り返し、ろ液と濃縮液を組み合わせてアルコール味がなくなるまでエタノールを回収し、抽出物を集めて凍結乾燥し、シスタンチェサルサ粗抽出物19.46gを得た。

2. 1.1. 2 精製プロセス

シスタンチェサルサの粗抽出物10gをビーカーに入れ、超音波で溶解するために20mLの水を加え、無水エタノール80mLを加え、よく振って12時間置いて濾過を行い、濾液を濃縮してアルコール味がなくなるまでエタノールを回収し、凍結乾燥して、シスタンチェサルサ抽出物の全配糖体8.408gを得た。

2. 1.2 動物のグループ化と投与

実験前に72匹のマウスを適応的に給餌し、無作為に6群に分け、それぞれ12匹のマウス、すなわちブランク対照群、アルコール性肝障害モデル群、および陽性対照群(150mg/kgの2座)、シスタンチェサルサ高用量群の総配糖体(130mg/kg)、シスタンチェサルサ中用量群の総配糖体(100mg/kg)、およびシスタンチェサルサ低用量群の総配糖体(65mg/kg)とした。各群の動物に胃内投与(ig)を1日2回与え、ig容量は0.2mL/20g体重とした。ブランク対照群およびモデル群には、等量の生理食塩水を与えた。ブランク対照群を除く各投与の2時間後、他の群に0.4mL/20g体重igで56°液を10日間連続して投与し、急性アルコール性肝障害モデルを引き起こした。模型製作の9日目、断食は許されませんでした。10日目には、56°白ワインを3時間与えました。眼球を採取し、血清を分離した。採血後、マウスを屠殺した。体重を量り、肝臓の右葉を取り、それを10%ホルムアルデヒド固定液に入れ、残りの肝臓を-20°Cの冷蔵庫に入れる。

2. 1.3 統計処理

SPSS 11.5統計ソフトウェアを使用してデータ、分散分析、P<0.05 is="" statistically="">

2. 1.4 マウスの急性アルコール性肝障害の体重、肝臓重量、および肝臓指数に対するシスタンチェサルサの全配糖体の影響

表1に示すように、モデル群のマウスの肝重量及び肝指数は、ブランク対照群のものよりも有意に高かった(P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1.5 血清ASTおよびALTに対するシスタンチェサルサの全配糖体の効果

採取した血液を3.5×103 r/minで10分間遠心分離し、血清を調製した。ライの方法を用いて、UV-Vis分光光度計505nmの測定値を用いて、血清中のALTおよびASTの活性を決定した。表2に示すように、モデル群の血清ALTおよびASTは、ブランク対照群の血清ALTおよびASTよりも有意に高かった(P<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1.6 肝臓におけるMDA含量およびSOD活性に対するシスタンチェサルサの総配糖体の効果

0.3gの肝臓組織を取り、10%および1%のホモジネートを調製する。1%肝臓ホモジネートを3.5 × 103 r/minで10分間遠心分離し、上清を取ります。この溶液を、肝臓ホモジネート中のタンパク質を、クーマシーブリリアントブルー法により測定した。1%肝臓ホモジネート上清を取り、SODテストボックスに従って操作し、マイクロプレートリーダー上で450nmで読み取る。10%肝臓ホモジネート上清を採取し、MDA判定キットに従って操作し、532nmの分光光度計で吸光度(A532)を測定する。

表3に示すように、モデル群の肝臓におけるMDA含量は、ブランク対照群のそれよりも有意に高かった(P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1.7 マウスの肝臓組織の病理学的変化に対するシスタンチェサルサの全配糖体の影響

病理学的検査:10%ホルムアルデヒドで固定した肝臓組織、従来のパラフィン包埋切片(スライス厚5μm)、HE染色、および光学顕微鏡下での肝臓病理組織学的変化の観察。

ブランク対照群の肝臓は、色が濃い赤色で、質感が柔らかい。肝臓組織の構造は正常であり、肝小葉の構造は無傷である。それは明確な境界を持つ多角形であり、核は丸く、細胞の中心にはっきりと位置しています。モデル群およびシスタンチェサルサ中用量群および低用量群の総配糖体のマウスの肝臓容積が増加し、色が黄色になった。顕微鏡下での病理学的変化は、主に肝細胞の脂肪変性であり、細胞内に拡散性脂質液胞および肝細胞を有する。大きく、細胞質は小さな脂肪滴と液胞で満たされており、核はまだ中心にあります。陽性対照群およびシスタンチェサルサ高用量群の全配糖体群では、マウスの肝細胞のリピドーシスがある程度減少し、脂肪滴の数がある程度減少した。

2. 2 シスタンチェサルサの全配糖体の主成分分析

2. 2.1 クロマトグラフィー条件

クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィーカラムZORBAX ODS(250×4.6 mm, 5μm)とした。移動相:メタノール0.2%ギ酸溶液(27.5∶72.5)、グラジエント溶出;カラム温度 30°C;流量 1 mL/分;検出波長334nm。上記のクロマトグラフィー条件下で、エキナコシドそしてアクテオシド良いです。

2. 2.2 参照溶液の調製

正確に1.3 mgと1.2 mgの重量を量るエキナコシドそしてアクテオシド参照物質0.13mg/mLエキナコシド基準物質溶液及び0.12mg/mLアクテオシド参照溶液を調製した。

2. 2.3 試験液の調製

シスタンチェサルサ抽出物の全配糖体の0.1082gを正確に秤量し、移動相溶液で50mLに希釈する。

2. 2.4 線形関係

参照解 0 を正確に描画します。06, 0.12. 0.18. 0.24. 0.30, 0.48. 0.54. 0.72. 1.20mg/mLで液体クロマトグラフィーに5μLを順番に注入し、2つの基準物質の注入量(μg)を横軸、対応するピーク面積を縦軸とした回帰式を計算します。エキナコシド:Y = 11.868 X-0.0785、R = 0.9997;アクテオシド:Y = 18.026X-0.1913、R = 0.9997。その結果、エキナコシド基準物質は、0.0635〜0.4445μgの範囲で良好な線形関係を有する。アクテオシド基準物質は0.059〜1.18μgの範囲にあり、内線関係は良好である。

2. 2.5 精密試験

同じ試験液10 μLを正確に引き抜き、上記のクロマトグラフィー条件下で注入を5回繰り返す。クロマトグラムを記録し、ピーク面積を求める。結果は、エキナコシドのRSDは0.89%です。のRSDアクテオシドは1.87%であり、器具の精度が良好であることを示す。

2. 2.6 安定性試験

同じ試験液を、それぞれ0、2、4、8、16、32、40、48時間で、正確に10L引き抜き、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、そのピーク面積を測定する。その結果、エキナコシド1のRSDが得られた。58%、RSDはアクテオシド0 です。49%は、試験液が48時間以内であることを示す

安定性は良好である。

2. 2.7 再現性試験

同じバッチのサンプルの約0.2mgを正確に秤量し、合計5部、および5部の溶液を調製した。含有量決定方法に従って、液体クロマトグラフに正確に10μLピペットし、クロマトグラムを記録し、ピーク面積を求めた。結果は、エキナコシドのRSDが1.91%、バーバスカム配糖体のRSDが2.08%であったことから、本判定方法が良好な再現性を有することを示している。

2. 2.8 回復率テスト

正確に0.2 gの重量を量るシスタンチェサルサの全配糖体、エキナコシドおよびアクテオシド基準物質はそれぞれ、上記2.2.3に基づく方法に従って試験液を調製し、指定されたクロマトグラフィー条件下で含有量決定方法に従って測定を行う。その結果、エキナコシドの平均回収率は98である。49%、RSD 1。06%、アクテオシドの平均回収率は97.35%であり、RSDは1.45%である。

2. 2.9 サンプルの定量

基準液と試験液のそれぞれ10μLを精密に引き抜き、試料を注入し、上記のクロマトグラフィー条件を決定し、外部標準法により試料含有量を算出する。結果を表4に示す エキナコシドの平均含有量は24.5%であり、平均含有量はアクテオシド6%である。

3 議論

アルコール性肝障害は、肝障害および長期の大量飲酒によって引き起こされる一連の病理学的変化を指す。長期間のアルコール摂取は肝細胞の損傷を引き起こし、肝線維症、さらには肝硬変を発症する可能性があります[6]。モデル群と比較して、本実験におけるシスタンチェサルサ高用量群の総配糖体は、マウス血清中のALTおよびASTの活性を有意に低下させ、肝臓中のMDAの含有量を有意に減少させ、SODの活性を有意に増加させ、肝細胞のリピドーシスをある程度低下させた。、脂肪滴の数を減らします。中用量群および低線量群とモデル群との間に有意差はなかった。この実験の結果は、pマウスのアルコール性肝障害に対するシスタンシェの全配糖体の回転効果[7].

シスタンチェサルサの総配糖体は肝細胞損傷を保護します細胞膜の透過性を低下させ、血液中に放出されるALTおよびASTの含有量を増加させることによって;それはSODの活性を高め、体の代謝においてアルコールによって産生される多数のフリーラジカルを排除することができます。;それはMDAの形成を減少させ、それが組織細胞の膜構造を損傷するのを防ぐことができます[8-10]。シスタンチェサルサの全配糖体は、アルコール性肝障害に対して保護効果を有し、定量的な効果関係がある。文献を確認しても、シスタンチェサルサの全配糖体の有効成分の定量的分析はない。本稿では、アクテオシドそしてエキナコシド、シスタンチェサルサの全配糖体の主成分を、HPLCにより初めて定量分析したところ、配糖体全体の29.1%を占めていた。シスタンチェサルサの全配糖体の開発と利用のための科学的根拠を提供する。現代の薬理学的研究は、エキナコシドが血管性認知症ラットの過酸化水素および酸化ストレス損傷によって損傷を受けたPC12細胞に対して保護効果を有することを見出した[11,12]。両方ともエキナコシドおよびアクテオシドは、肝細胞の細胞傷害性に対して阻害作用を有するD GalNおよびTNF-αによって誘導される[13]。さらに、シスタンチェサルサの総配糖体は、アルコール性肝障害からマウスを保護しますによって拡張することができますエキナコシドおよびアクテオシド細胞の抗酸化酵素活性を増強し、肝細胞の抗酸化能力を改善し、それによって肝細胞原形質膜の完全性を維持し、その結果、肝細胞は正常に機能することができる 防御的および代償的機能。今後の研究でさらに単離し、分子生物学の手法を用いて、肝細胞アポトーシスに対する単量体化合物の調節および関連する標的遺伝子の調節との関係を研究する予定です。

参照

1 張 HW.化学成分に関する研究

Cistanche salsa (C. A. Mey.) G. Beckの指紋。ホーホット:内モンゴル医科大学、修士課程2008。

2 ティアンXF、プーXP。Cistanches salsa由来のフェニルエタノイド配糖体は、ニューロンにおけるメチルフェニルピリジニウムイオンによって誘導されるアポトーシスを阻害する。Jエスノファーマコール、2005、97:59-63。

3 王10世、江10世、呉恭。フリーラジカルに対するシスタンチェの配糖体の消去効果と、インビトロでのOH·誘発DNA損傷に対するその保護 China Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 呉HH.シスタンチェサルサ由来のフェニルエタノイド配糖体の調製および抗酸化活性。南京:南京農業大学、修士課程2008。