プロテオミクスとサイトカイン分析による筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群の症例と対照群の区別パート 1

抽象的な

背景筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群 (ME/CFS) は、原因不明の持続的な疲労と、認知障害、筋肉痛、運動後の倦怠感、免疫系機能不全などのその他の特徴を特徴とする複雑で不均一な疾患です。 サイトカインは血漿中に存在し、細胞外小胞 (EV) にカプセル化されていますが、EV の特性と ME/CFS におけるカーゴに関する報告はわずかしかありません。 ME/CFS に関連する血漿タンパク質またはタンパク質経路については、これまでにいくつかの小規模な研究で報告されています。

カンカは抗疲労およびスタミナ増強剤として作用することができ、実験研究ではカンカの煎じ薬が体重負荷のある水泳マウスで損傷した肝臓の肝細胞および内皮細胞を効果的に保護し、NOS3の発現を上方制御し、肝臓のグリコーゲンを促進することが示されています。合成し、抗疲労効果を発揮します。 フェニルエタノイド配糖体が豊富なカンカ抽出物は、ICR マウスの血清クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸レベルを大幅に低下させ、ヘモグロビン (HB) およびグルコースレベルを増加させる可能性があり、筋肉の損傷を軽減することで抗疲労の役割を果たす可能性があります。そして、マウスのエネルギー貯蔵のための乳酸の濃縮を遅らせます。 化合物カンカタブレットは、マウスの体重負荷水泳時間を大幅に延長し、肝臓のグリコーゲン貯蔵量を増加させ、運動後の血清尿素レベルを低下させ、抗疲労効果を示しました。 シスタンキスの煎じ薬は、運動中のマウスの持久力を向上させ、疲労の除去を促進することができ、負荷運動後の血清クレアチンキナーゼの上昇を抑え、運動後のマウスの骨格筋の超微細構造を正常に保つ効果があることを示しています。体力強化や疲労回復に効果があります。 シスタンキスはまた、亜硝酸塩中毒マウスの生存期間を大幅に延長し、低酸素症や疲労に対する耐性を高めました。

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メソッド我々は、筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群（ME/CFS）の症例および以前に公開された血漿サイトカインおよび血漿プロテオミクスデータを含む対照のコホートからの凍結血漿サンプルから細胞外小胞（EV）を調製しました。 血漿由来の細胞外小胞のサイトカイン含有量をマルチプレックスアッセイによって測定し、患者と対照間の差異を評価しました。 次に、この新しいデータだけでなく、被験者の健康状態を記述する広範な臨床データも考慮したマルチオミクス統計分析を実行しました。

結果ME/CFS 症例では、血漿中の EV のサイズと濃度が大きくなりました。 EV のサイトカイン含有量のアッセイにより、一部のケースでは IL2 が大幅に高いことが明らかになりました。 我々は、質量分析プロテオミクスから、EV サイトカイン、血漿サイトカイン、血漿タンパク質間の多数の相関関係を観察しました。 臨床データとタンパク質レベルの間の有意な相関関係は、疾患における特定のタンパク質と経路の役割を示唆しています。 たとえば、炎症誘発性サイトカインである顆粒球単球コロニー刺激因子 (CSF2) および腫瘍壊死因子 (TNF) のレベルが高いと、ME/CFS 症例における身体症状や疲労症状の増加と相関していました。 止血に関与するセリンプロテアーゼ SERPINA5 の値が高いほど、ME/CFS における SF-36 の一般的な健康スコアが高いと相関していました。 機械学習分類器は、症例と対照を区別できる 2 つの 0 タンパク質のリストを特定することができ、XGBoost は 86.1% の精度と相互検証された AUROC 値 { {15}}.947。 Random Forest は、7 つのタンパク質のみを使用して、79.1% の精度と 0.891 の AUROC 値で症例と対照を区別しました。

結論これらの発見は、ME/CFS 患者で同定されている生体分子の客観的な差異の相当数に追加されます。 免疫応答および止血に重要なタンパク質と臨床データとの相関関係が観察されたことから、ME/CFS におけるこれらの機能の障害がさらに示唆されています。

キーワード筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群、細胞外小胞、血漿、プロテオミクス、サイトカイン

背景

筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群 (ME/CFS) は、新たな衰弱性疲労、労作後の倦怠感、すっきりしない睡眠、および認知障害または起立不耐症という 2 つの追加症状のいずれかまたは両方が 6 か月間続いた後に診断される重篤な疾患です。 1]。 ほとんどの患者は、ウイルス様疾患の後に症状が生じたと報告していますが、エンテロウイルスファミリーが関与していることが時々示唆されているものの、以前の感染症の正体はほとんどの場合不明です[2、3]。 2020 年以前は、世界中で 6,500 万人が ME/CFS を経験すると推定されていました [4]。 SARS-COV2 のパンデミック以来、急性の新型コロナウイルスに罹患した人の一部は症状を経験し続けています-19。また、長期にわたる新型コロナウイルスの被害者の中には、ME/CFS 診断を満たす人もいます-19上記の基準[6]。 同様に、湾岸戦争病を患っている人には、長期にわたる新型コロナウイルスと ME/CFS の両方に重なる症状があります [7]。 しかし、神経画像法 [8] などのいくつかの検査では、湾岸戦争病と ME/CFS を区別します。 SARS-CoV-2 感染に関連しない Long COVID と ME/CFS が同様に画像処理やその他の手段によって区別されるかどうかはまだ不明です。

自然免疫系に関連し、補体カスケードやドーパミンシグナル伝達に関連する経路に関与するタンパク質が、脳脊髄液を分析した研究で対照と比較してME/CFS患者で豊富であることが報告されている[9,10 ]。 血漿質量分析により、ME/CFS ではエネルギー、脂質、アミノ酸代謝の調節不全も報告されています [11-13]。 しかし、より最近では、ターゲットを絞らない超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を使用した ME/CFS 関連の血漿プロテオーム解析により、ME/CFS 患者だけでなく、ME/CFS サブグループ（IBS の有無にかかわらず）と対照群と対照群との間で異なるプロファイルが特定されました。 ME/CFS 状態をかなり高い精度で予測できるタンパク質のセット (曲線下面積 (AUC)=0.774–0.838) [14]。

免疫機能と炎症反応はモジュレーターとして作用するサイトカインによって調節されており、その分泌は古典的な分泌様式で、または細胞外小胞へのカプセル化を介して起こり、分解酵素からサイトカインを保護していることが知られています[15]。 EV は細胞間コミュニケーションの主要な参加者の 1 つであり、炎症性、自己免疫、感染症の病態を引き起こします [16-19]。これまでの報告では、がんやアルツハイマー病だけでなく、循環する EV の数が増加していることが示されています [17、 20–22] だけでなく、ME/CFS [23–25] にもあります。 ME/CFS患者および特発性慢性疲労および臨床的うつ病患者から分離されたEVに関する最近の研究では、循環EV数のみを使用してAUC 0.802で2つのグループを区別することができ、90～94％で正しい診断が可能となった。 ME/CFS の場合 [24]。

病気で起こる混乱についての洞察を得るには、ME/CFS のさらなる分子的特徴付けが緊急に必要とされています。 同じ被験者セットに対してマルチオミック研究を行うと、新しい仮説が得られる可能性が高くなります。 さらに、高い感度と特異性で ME/CFS 被験者と健康な対照者を区別できれば、実験的治療の効果をモニタリングすることが可能になります。 ME/CFS 関連の異常を評価するための血液サンプルの利用は、より侵襲的または煩雑な方法と比較して、特に価値があると考えられます。

この研究では、2020年以前にME/CFS被験者と健康な対照から採取した血液サンプルから細胞外小胞（EV）を分離し、それらのサイトカイン含有量を測定しました。 この新しく生成されたデータは、同じサンプルに対するタンデム質量分析による血漿プロテオミクス分析 [14] および血漿サイトカイン レベルの測定 [26] からすでに公表されているデータとともに、複数の統計分析に一緒に使用されました。 我々は、ME/CFS 被験者と対照の間でレベルが大きく異なる一連の EV サイトカインを特定しました。 我々は、異なるEVサイトカインのレベル間、血漿サイトカインのレベル間、EVサイトカインと血漿サイトカインの間、およびサイトカインと他の血漿タンパク質の間の相関を観察した。 また、血漿サイトカインと特定の ME/CFS 症状の重症度との関係も検出しました。 対照では、4 つの血漿タンパク質のレベルが健康指標に関連していました。 止血に関与するタンパク質である SERPINA5 は、より高い SF-36 機能スコアと正の相関がありました。 機械学習を使用して、最も高い特徴重要度値を持つ 20 個のタンパク質を特定しました。 これら 20 種類の分析物と XGBoost を使用すると、非常に高い感度と特異度 (AUC=0.947) で ME/CFS を識別し、被験者を制御することができました。

メソッド

調査対象母集団

慢性疲労イニシアチブコホート[27]からの49人のME/CFS症例と49人の健康な対照からなる部分母集団が、この現在の研究の枠組みで分析された。 すべての症例は、1994 年の CDC 福田 [28] および/または 2003 年のカナダの ME/CFS に関するコンセンサス基準 [29] を満たしていました。 採血当日、臨床症状とベースライン健康状態は、Short Form 36 Health Survey (SF-36) [30] および多次元疲労インベントリ (MFI) スケール [31] を使用して評価されました。 末梢血をクエン酸ナトリウム BD VacutainerTM 細胞調製チューブに採取し、遠心分離して赤血球をペレット化しました。 得られた血漿サンプルは、示されているように監督医師から 4 つの場所から受け取った: ユタ州ソルトレイクシティ (ルシンダ・ベイトマン)、ネバダ州インクライン・ビレッジ (ダニエル・ピーターソン)、フロリダ州マイアミ (ナンシー・クリマス)、およびニューヨーク州ニューヨーク市 (スーザン) Levine) は、-80 度で保存され、コロンビア大学からドライアイスでコーネル大学に輸送され、細胞外小胞の単離のための処理前に -80 度で保存されました。 すべての参加者から書面による同意を得て、すべてのプロトコールはコロンビア大学アービング医療センターの治験審査委員会によって承認されました。

細胞外小胞の精製

細胞外小胞（EV）は、以前に記載されているように、ExoQuick™ 試薬（System Biosciences、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を使用した沈殿によって血漿サンプルから単離されました [25]。 簡単に説明すると、各被験者からの血漿サンプルを氷上で解凍し、室温で 3{6}} x g で 15 分間遠心分離して、細胞と破片を除去しました。 トロンビン (611 U/ml) (System Bioscience、米国カリフォルニア州パロアルト) を添加し、サンプルを室温で 5 分間インキュベートしてフィブリノーゲンを除去し、10,000 x g で 5 分間遠心分離し、上清を回収した。 次いで、サンプルをExoQuick™とともに4℃で60分間インキュベートし、12,000×gで5分間遠心分離し、得られたペレットを250μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水1X、pH7.4に再懸濁した。 サイトカイン/ケモカインおよび成長因子の定量化のためにサンプルを等分しました。

細胞外小胞のサイズと定量化

単離されたEVの濃度とサイズ分布は、Cornell Nanoscale Science and Technology FacilityのNanoSight NS300装置（英国ウースターシャー州マルバーン）を使用してサンプル中でアッセイされました。 サンプルを解凍し、PBS 1X で 1:2000 に希釈し、レーザー チャンバー (NanoSight Technology、ロンドン、英国) を通して 1 ml を注入しました。 各サンプルの 60 個のデジタル ビデオのツリー記録を取得し、NanoSight NTA 2.3 ソフトウェアで分析して、ナノ粒子のサイズと濃度を決定しました。 結果は平均化されました。

血漿および細胞外小胞の免疫プロファイリング

血漿中の免疫分子は、磁気ビーズベースの61-プレックスイムノアッセイ（カスタマイズされたProcartaTMイムノアッセイ、Affymetrix）を使用して以前に測定されました[26]。 細胞外小胞の免疫プロファイリングは、コーネル大学のヒト栄養化学サービス研究所で、ヒト 48- プレックス磁気ビーズ キット (Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Pannel、48-plex、Bio-Rad) を使用して実施されました。 ）。 分析前に、EV サンプルを Triton 1% で処理して、カプセル化されたサイトカインを放出させました [32]。 各サンプルは、MAGPIX® Multiplexing System (Luminex Corp.) で二重に測定されました。 各ウェルについて、特定の分析物について測定されたすべてのビーズの蛍光強度の中央値を使用し、2 回の反復を平均し、変動係数 (CV) が 15% 未満の場合に結果が受け入れられました。

血漿プロテオミクス

血漿プロテオミクスプロファイリングは、以前に記載されているようにコロンビア大学で実施されました[14]。 この研究に含まれる 49 人の ME/CFS 症例と 49 人の対照からのサンプルは、20 サンプル (11 ME/CFS 症例、9 対照) と 78 サンプル (38 ME/CFS 症例、40 対照) の 2 つのバッチで分析されました。 最初のバッチの 20 個のサンプルはランダムに選択されました。 症例と対照は、研究対象集団全体と同じマッチング変数で頻度がマッチングされました。 20-被験者サンプルセットと78-被験者サンプルセットでは、それぞれ合計257個と279個のアノテーション付きタンパク質が測定され、両方のサンプルセットで207個のアノテーション付きタンパク質が重複していました。

統計分析

すべての統計分析は、RStudio 経由で R バージョン 4.0.2 (2020-06-22) を使用して実行されました。 各タンパク質分析物について、検出不可能な値は最小値の半分に置き換えられました。 次に、タンパク質レベルを底 2 で対数変換し、さらなる分析のために標準化しました。 外れ値分析のために Z スコアと P 値が計算されました。 ノンパラメトリックウィルコクソン符号付き順位検定は、差異の有意性を検定するために実行されました (p<0.05) between cases and controls for age, BMI, SF-36 survey scores, and EV sizes and concentrations. The robust linear regression was performed using the lm function in the MASS package for determining the significance of differences for each analyte in control and ME/CFS groups with age, BMI, Irritable Bowel Syndrome (IBS), and sex as confounding variables. Robust linear regression was performed to eliminate contamination with outliers or influential observations. Robust linear regression is a form of weighted least squares regression, and we chose M-estimation with Huber weighting [33, 34] for further analysis.

主成分分析 (PCA) を使用して、タンパク質レベルのデータセットの次元を削減することでデータを単純化し、解釈可能性を高めました。 PCA は、R の統計パッケージを使用して実行されました。スピアマンの順位相関係数も、タンパク質分析物内およびタンパク質とメタデータ (年齢、BMI、性別、SF-36 スコア、IBS) の間で推定されました。 点双系列相関は、変数の 1 つが 2 値である場合に使用されました (例、女性対男性、IBS あり vs なし)。 カテゴリ変数は次のようにコード化されました。 コホート: コントロール=0; 私/CFS=1; 性別: 女性=0; 男性=1; IBS: IBSなし=0; IBS=1を患っています。 全体を通して、すべての p 値は、Benjamini-Hochberg 法 (FDR) [35、36] を使用して複数の仮説に対して調整されました。

機械学習アプローチを使用して、2 つのサンプル グループを区別する変数を特定しました (特徴選択)。 ME/CFS または健康対照としてのサンプルの分類は、3 つの教師あり学習アルゴリズムを使用して実行されました。R のランダム フォレスト関数を使用して実装されたランダム フォレスト [37]。 R の xgboost パッケージを使用する XGBoost [38] と、R 関数 glmnet を使用してロジスティック回帰に適用される最小絶対収縮および選択演算子 (LASSO) ペナルティ [39]。 特徴として、アルゴリズムは 353 種類すべてのタンパク質分析物、EV サイトカイン、血漿サイトカイン、血漿プロテオミクスを使用しました。 各分類器の特徴の重要度が計算されました。 LASSO の場合、「重要でない」特徴の係数はゼロに縮小されるため、特徴の重要性は、最良適合モデルにおける予測子のパラメーター推定値が 0 以外になる「パーセンテージ」 (250 回のランダムなリサンプリング相互検証反復のうち) によって評価できます。 ランダム フォレストの場合、特徴の「平均精度低下 (MDA)」は、その特徴内の値をランダムに並べ替えることによる分類精度の低下です。 重要でない予測子の場合、並べ替えはモデルの精度にほとんどまたはまったく影響を与えませんが、重要な予測子の値を並べ替えるとモデルの精度が大幅に低下するはずです。 したがって、特徴の重要性が高くなるほど、その値が並べ替えられたときの精度の低下が大きくなります。 最後に、XGBoost の場合、メトリクス「ゲイン」は、その機能が使用されているすべてのツリーにわたる平均ゲインを示し、各機能の相対的な寄与を表します。

特徴の重要性は、5 重交差検証の 250 回以上の反復の平均によって計算されました。 3 つのすべての分類子で重要度の測定値で上位 20 位にランク付けされたタンパク質分析物 (表 5) を、同じ分類子で予測子として再度適合させました。 機能選択の最適化に使用される受信者動作特性 (ROC) 曲線と曲線下面積 (AUC) は、R パッケージ キャレットを使用して計算されました。 ROC 曲線が生成される前に、データは対数変換され、自動スケール化されました。 なげなわペナルティは、予測にとって重要な多くの予測子と変数が選択される場合に使用されます。 すでに重要であると判断された変数を使用しているため、図 8 では、なげなわペナルティではなく非正規化ロジスティック回帰が使用されています。平均 AUC は、モデルのより正確な推定値を導き出すことを目的として、5 重交差検証を 250 回繰り返して計算されました。予測パフォーマンス。 特徴の重要度は、3 つの機械学習アルゴリズムごとに計算されました。

結果

母集団の特徴を調査する

研究集団内には、ME/CFS群と健康対照群にそれぞれ女性41名、男性8名、0女性4名、男性9名が含まれていた(表1)。 選択されたすべての患者は、1994 年の福田氏による ME/CFS の定義を満たしていました。 平均年齢と体格指数（BMI）は、ME/CFS 被験者と対照被験者間で同様であり、グループ間の性別の比較でも同様でした（表 1）。 ME/CFS患者の79パーセントは、病気の発症直前に起こる急性の、多くの場合病気のようなものを特定できましたが、20%は開始事象に気づかず、その発症が原因であると考えていました。進行性であり（表 1）、患者 49 人中 45 人は 3 年以上病気を患っていました。 MFI-20 スコアは、ME/CFS 被験者と対照の状態の反対の傾向を示しており、完全に機能している対照のスコアが低いのと比較して、スコアが高いほど患者の機能レベルが低いことを反映しています（表 1、p < 0.001） ）。 さらに、SF-36 の簡単な調査から得られた身体的コンポーネントスコアと精神的コンポーネントスコア (それぞれ PCS と MCS) は両方とも、予想通り、対照群の方が高かった (p < 0.001、表 1)。

図 1 に示す主成分分析は、SF-36 および MFI-20 のアンケートから得られたデータに対して実行されました。 最初の 2 つの主成分は、86.9% (PC-1 75.1%; PC-2 11.8%、図 1a) と 92.6% (PC-1 86) を説明しました。 SF-36 と MFI-20 のデータセット内の合計分散の 89%、PC-2 5.73%、図 1b)、2 つの有意なクラスターが観察され、 ME/CFS グループと対照グループ。 季節も採血場所もグループを区別できませんでした（追加ファイル1：図S1）。

細胞外小胞のサイズと濃度は、ME/CFS と健康な対照の間で異なります

ME/CFS 患者および健常人の血漿サンプルから細胞外小胞を沈殿法により精製し、そのサイズと濃度をナノ粒子追跡分析 (NTA) で分析して、臨床群間に差があるかどうかを調査しました。 精製されたすべてのナノ粒子は 500 nm 未満であり、そのほとんどは 30 ～ 130 nm の典型的なエキソソーム サイズ範囲内でした [40]。 NTAは、EV粒子サイズの平均が健常者（136.2±18.3 nm、範囲97～188 nm）とME/CFS患者（145.3±16.6 nm、範囲113～177 nm）の間で異なることを明らかにした（p=0.01 、図２ａ）。 血漿 1ml あたりの粒子の平均総濃度 (コントロール: 8.0±3.8×108、ME/CFS: 10.5±3.9×108、p)<0.001, Fig. 2b), the mean concentration of EVs that ranged from 30 to 130 nm in size (controls:4.3±1.8× 108,  ME/CFS:5.3±2.4× 108, p=0.05, Fig. 2c) and the mean concentration of particles greater than 130 nm (controls: 3.7±2.9× 108; ME/CFS: 5.6±2.7× 108, p<0.001, Fig. 2d) also exhibited a statistically significant difference between groups.

外れ値分析の結果、特定の被験者のデータがさらなる検討から除外される

データセット全体で外れ値の分析物の数を調べました。 半分以上の検出不可能な値を持つ分析物はすべて廃棄され、61 個の血漿サイトカインのうち 6 個が除去されました。 Z スコアは、各被験者および各分析対象物に対して計算されました。 0.05 未満の両側 q 値 (FDR に対して調整された p 値) を持つ被験者/分析対象ペアはすべて外れ値とみなされます。 結果として得られた q 値は、2 人の ME/CFS 患者が臨床的特徴によって当初は疑われなかった外れ値プロファイルを示しており、したがって、それらがそれぞれ外れ値の 43% と 50% に相当するため、EV サイトカイン データセットから削除されるべきであることを示唆しました (21 件と 24 件の外れ値)。 48 サイトカイン）。 血漿サイトカインのデータセットについては、異常値の割合が特に高い被験者は存在しませんでしたが、血漿プロテオミクスについては、ME/CFS 患者 1 人が 35% の異常値 (血漿タンパク質 208 個中 73 個の異常値) を示したため、さらなる分析には使用されませんでした。

特定のEVサイトカインおよび血漿サイトカインレベルがME/CFS群と対照群間で異なる

ノンパラメトリック符号付き順位ウィルコクソン検定を使用して、ME/CFS 患者と対照間の分析対象物のレベルの違いを調査しました。 EV サイトカインの中で、インターロイキン 2 (IL2) のレベルは対照と患者の間で著しく異なり (q=0.007)、次の 16 の EV サイトカインは {{32} }.1 < q < 0.2: IL12P40、TNF、IL1、CXCL8、CXCL1、IL15、CCL7、IL17、IL4、GM-CSF/CSF2、IL3、CCL5、NGF、IL1、IL7、IL1R1。 図 3 は、これら 17 個のサイトカインの対数変換されたタンパク質レベルの箱ひげ図を示しています。 血漿サイトカイン [41] および血漿プロテオミクス [14] については、多重比較のための補正後 (FDR < 0.2) に、症例と対照間で有意に異なる分析物はありませんでした。 詳細な p 値、q 値、および ME/CFS グループと対照の平均タンパク質分析物レベルの比は、追加ファイル 2: 表に記載されています。

さらに、主成分分析を使用して被験者内のサンプルの種類を比較しました。 この分析には、48-plex EV および 55-plex 血漿イムノアッセイからの合計 36 の一般的な分析物が使用されました。 各次元によって説明される変動の割合は、第 1 軸で 46.2%、第 2 軸で 15% であり、2 つの有意なクラスターが観察されました (図 4)。

タンパク質データセット内およびタンパク質データセット間には多数の相関関係が存在します

スピアマン相関分析はデータセット間で実行され、係数 r 0.6 以上の有意な相関のみを示す相関グラムとしてプロットされています (図 5)。 EV サンプルのサイトカイン レベル間で、ME/CFS 被験者では合計 316 件、対照では 300 件の有意な正の相関が見つかりました (q<0.01) and 88 and 73 had strong Spearman correlation coefcients (r ≥0.6) in the ME/CFS and control groups, respectively (Fig. 5a). Tirty-four of them were common to both groups (pink squares, Fig.  5a). When correlating plasma cytokines to each other, the ME/CFS cohort had 710 signifcant correlations including 327 at r ≥0.6 (q<0.01), and the control group had 394 with 146 at r ≥0.6 (q<0.01); 136 were common to both groups (Fig. 5b). In both EV and plasma cytokine correlation analysis, no signifcant negative correlations were found, and there was a higher number of positive correlations in the ME/CFS cohort as compared to the healthy individuals (Fig. 5a, b).

また、55 の血漿サイトカインと 48 の EV サイトカインレベルの間の相関関係も調査しました (追加ファイル 1: 図 S2)。 両方のグループで負の有意な相関は見られず、正の有意な相関はほとんど見つかりませんでした（r 0.5 以上で、ME/CFS とコントロールでそれぞれ 15 と 13、両グループに共通の 4 ）。 これらの有意な相関関係の中で、EV の LIF レベルは、ME/CFS の 8 つの血漿サイトカイン (CCL3、IL15、LIF、IL17、IL21、IFN 、TGF 、および TGF )、および対照群の 5 つの血漿サイトカイン (CCL3、IL1、IL17、 IL21、およびIFN）（補足図2）。

血漿プロテオミクスについては、ME/CFS 群と対照群でそれぞれ 160 と 130 の有意な正の相関が見つかり、スピアマン係数 r は 0.8 (q < 0.01) (図 5c) と 42 は両方のグループに共通でした (ピンクの四角、図 5c)。 ME/CFSグループのみで6組のタンパク質が有意な負の相関を示し（オレンジ色の四角、図5c）、そのうち3組にはSERPINA7が含まれ、1組は対照グループに特有でした（SERPINA1/KNG1、r=−0.82） 、q < 0.01、水色の四角、図 5c)。

血漿プロテオミクス データセットと EV サイトカインまたは血漿サイトカイン データセットとの関係を分析した場合、EV タンパク質と対照群の質量分析法で分析されたタンパク質との間に有意な相関関係が 1 つだけ見つかりました（CXCL12-ev/PROZ） 、r=0.69、q=0.014)。

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