血管関与に関連するヒアルロン酸結合タンパク質 2 の発現を特定するための詳細な血漿プロテオミクスを使用した、臓器解決型ベーチェット病のプロテオミクスランドスケープマッピング

客観的。

この研究は、BD患者の臨床評価と治療のためのバイオマーカーを同定するための詳細なプロテオミクスを使用して、さまざまな臓器が関与するベーチェット病（BD）の病因と不均一性を解明するために実施されました。

方法。

データに依存しない取得質量分析計と抗体マイクロアレイを備えた詳細なプロテオミクス プラットフォームを使用して、98 人の BD 患者と 31 人の健常対照者から採取した血漿サンプル中のタンパク質の発現レベルを測定しました。 私たちは、BD グループで変化した生物学的プロセスとシグナル伝達経路のバイオインフォマティクス分析を実行し、臓器解決型 BD 病因のプロテオミクス展望を構築しました。 次に、酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、108 人の BD 患者と 29 人の健康な対照からなる独立したコホートにおける疾患重症度のバイオマーカーと血管サブセットを検証しました。

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結果。

BD グループには 220 種類の異なる発現タンパク質があり、これにより BD 患者 (88.6%) と健康な対照 (95.5%) が区別されました。 バイオインフォマティクス分析により、補体活性化、創傷治癒、血管新生、白血球媒介免疫など、BD の発症に関連するさまざまな生物学的プロセスが明らかになりました。 さらに、器官分解されたBDの構築されたプロテオミクス状況により、治療の開発に使用できるさまざまな器官およびタンパク質標的に関連するBDのプロテオミクス特徴が特定されました。 ヒアルロン酸結合タンパク質 2、テネイシン、およびセルピン A3 は、血管 BD および治療標的の臨床評価のための潜在的なバイオマーカーとして検証されました。

結論。

我々の結果は、プロテオミクス特性と、血管性BDの臨床評価および潜在的な治療法のための潜在的なバイオマーカーの観点から、臓器解決型BDの病因についての貴重な洞察を提供する。

導入

ベーチェット病 (BD) は、シルクロードとして知られる古代の交易路沿いの人々に非常に蔓延している多全身性の慢性血管炎です。 2016 年の研究では、トルコにおける BD の有病率は、青年/成人人口 100 人あたり 602 人であることがわかりました。000(1)。 BD は非常に不均一であり、患者は口腔潰瘍、性器潰瘍、ぶどう膜炎、皮膚病変などの多臓器障害を示します。 BD は、血管動脈瘤の破裂や重度の神経合併症の結果として死に至る可能性があります。 さまざまな臓器に関連する BD の分子的特徴は不明です。 臨床診断方法とその後の治療の選択肢は主に臨床症状に依存します。 しかし、さまざまな臓器の関与に基づいて BD を区別できるバイオマーカーはありません。 ゲノミクスと比較して、プロテオミクスは、BD の病因に関する豊富な情報を取得し、BD の診断と治療のためのバイオマーカーを見つけるための代替アプローチを提供します。 Lee らは、2- 次元電気泳動とマトリックス支援レーザー脱離/イオン化タンデム飛行時間型質量分析を組み合わせて、22 種類の発現の異なるタンパク質を発見しました (2)。 腸 BD の 3 つの独特なタンパク質 (フィブリン、アポリポタンパク質 A-IV、血清アミロイド A) は、酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) を使用して独立したコホートでさらに検証されました。 Lopalco らは、25 種類の炎症性サイトカインを含む Bio-Rad サイトカイン ビーズ アレイを使用して、gp130/分泌型インターロイキン-6 (IL-6) 受容体、分泌型 IL-6 受容体、IL{{19} ｝、そして胸腺間質リンホポエチンの血清レベルは、皮膚粘膜症状のみを伴うサブグループと比較して、皮膚粘膜症状と眼病変を伴う BD サブセットで有意に増加しました (3)。 しかし、タンパク質と患者のグループが小さく、特定されたバイオマーカーが十分に検証されていなかったため、これらの研究で得られた情報は限られていました。 この研究では、カスタマイズ可能な抗体マイクロアレイを備えたデータ非依存取得質量分析計 (DIA-MS) と統合された詳細なプロテオミクス プラットフォームを使用して、私たちの知る限り、BD の初の包括的な血漿プロテオーム プロファイリングを実施しました (4)。 プロテオミクスデータを用いて、BD 患者と健常対照群の間で差次的に発現するタンパク質と、BD の発症に関するこれらのタンパク質の生物学的プロセスおよび経路を分析しました。 さらに、臓器を分解したBDランドスケープを構築し、各臓器のプロテオミクス特性を特定しました。 血管性 BD と疾患の重症度のバイオマーカーは、独立したコホートで検証されました。

患者と方法

この研究は、北京連合医科大学病院（JS-2049）の医倫理委員会によって承認されました。 この記事には、BD 患者または健康対照参加者を特定できるデータは含まれていません。 発見コホートには、98 人の BD 患者と 31 人の健康な対照が含まれていました。 血漿プロテオームは、DIA-MS と抗体マイクロアレイを使用して詳細に測定されました。 バイオインフォマティクス分析を使用して、BD グループにおける生物学的メカニズムの変化を特定し、器官分解された BD のプロテオミクス状況を構築しました。 候補血漿バイオマーカーは、健康な対照とBDおよび高安動脈炎の患者で構成される独立したコホートにおいてELISAを使用して検証されました。 発見および検証コホートの臨床的特徴と治療情報は補足表 1-6 に示されており、詳細な実験手順は関節炎およびリウマチの Web サイト https://onlinelibrary.wiley で入手できる補足資料に記載されています。 com/doi/10.1002/art.42348。

結果

患者の特徴。 BD 患者の臨床的特徴、および採血時のグルココルチコイド (GC) および免疫抑制剤の使用は、関節炎およびリウマチの Web サイト (https://onlinelibrary.wiley.com/doi) で入手できる補足表 1 に示されています。 / 10.1002/art.42348。 私たちのプロテオミクス分析では、98人のBD患者と31人の健康な対照（発見コホート）の間で性別と年齢に有意差は観察されませんでした（補足表1）。 BD グループでは、45 人の患者が軽度、38 人が中度、15 人の患者が重度の BD を患っていました。 BD患者は全員口腔潰瘍を患っており、20%以上が性器潰瘍(80.6%)、皮膚病変(65.3%)、眼病変(23.5%)、血管病変(22.4%)を患っていた。 発見コホートにおけるBD患者の血管関与は補足表2に示されており、候補バイオマーカーの発現を検証するために適用された検証コホートの特徴は補足表3〜5に示されています（関節炎およびリウマチ学のWebサイトで入手可能）でhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348)。

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DIA-MS と抗体マイクロアレイを使用した BD 患者の血漿プロテオームの詳細なプロファイリング。 タンパク質プロファイリング研究の概略図を図 1A および補足図 1 に示します。関節炎とリウマチの Web サイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1{{11} 02/art.42348。 BD 患者と健常対照者から採取したすべての血漿サンプルは、DIA-MS と再現性の高い抗体マイクロアレイで構成される詳細な血漿プロテオミクス プラットフォームを使用して測定されました。 抗体マイクロアレイを使用した血漿タンパク質検出のスピアマンの相関係数は、異なるアレイ内およびアレイ間でそれぞれ 0.98 および 0.93 でした (補足図 2A および 2B、関節炎およびリウマチの Web サイト https で入手可能) ://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348)。 DIA-MS を使用した血漿タンパク質検出のスピアマン相関係数は 0.92 でした (範囲 0.87 ～ 0.96; 補足図 2C)。 BD患者と健康なコントロールの抗体マイクロアレイによる代表的なスキャン画像は、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348で入手可能な補足図3に示されています。 結果は、全体として、BD 患者の血漿タンパク質が健康な対照の血漿タンパク質と比較して上方制御されていることを示しました。 詳細な血漿プロテオミクス プラットフォームを使用して、759 個のタンパク質を特定しました (補足図 1、4、および 5、関節炎およびリウマチの Web サイト (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348) で入手可能)。これらは血漿中に約 10 桁の大きさで分布していました (図 1B)。 これらのタンパク質には、410 のタンパク質バイオマーカー (ヒト疾患血漿タンパク質バイオマーカー データベース、オンライン http://biokb.ncpsb. org. cn/hdpp/#/) および現在承認されている、または進行中の臨床試験で研究中の 388 の治療標的が含まれています (治療標的)ターゲット データベース、オンライン (http://db.idrblab.net/ttd/) (図 1B)。 これらのバイオマーカーと治療標的の機能的注釈は、これらのタンパク質が、BD、ループス腎炎、強直性脊椎炎、血管炎を含むさまざまな自己免疫疾患および自己炎症疾患に属していることを示しています（関節炎およびリウマチ学で入手可能な図 1C および 1D および補足表 7 および 8）。ウェブサイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348）。 これらの結果は、当社のプラットフォームで検出された血漿タンパク質が BD の発生と発症に密接に関連していることを示唆しています。

図 1. データ非依存取得質量分析 (DIA-MS) および抗体マイクロアレイ解析を備えた詳細なプロテオミクス プラットフォームを使用した、ベーチェット病 (BD) 患者の血漿サンプルのプロテオーム プロファイリング。 BD のプロテオミクス研究のワークフロー。 B、ヒト血漿プロテオーム データベース (http://www.plasmaproteomedatabase.org/) の参照濃度に従って、DIA-MS および抗体マイクロアレイで検出された血漿タンパク質濃度の分布。 C、ヒト疾患血漿タンパク質 (HDPP) バイオマーカー データベース (http://biokb.ncpsb.org.cn/hdpp/#/) を使用して特定された、検出されたタンパク質バイオマーカーに関連する疾患。 D、検出された治療標的タンパク質に関連する疾患。治療標的データベース (TTD) (http://db.idrblab.net/ttd/) を使用して特定されました。 C および D の円の大きさは、各疾患で濃縮されるタンパク質の数に対応します。 HC=の健康なコントロール。 FASP=フィルターを利用したサンプル前処理。 QE-HF=Exactive HF ハイブリッド四重極オービトラップ (ThermoFisher) 質量分析計; Strep-PE=ストレプトアビジン-フィコエリトリン; ELISA=酵素結合免疫吸着アッセイ; IgA=免疫グロブリン A。

BD に関連して差次的に発現される血漿タンパク質のプロテオーム全体の分析。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ art.42348 で利用可能な補足図 1 は、DIA-MS および抗体マイクロアレイの結果から差次的に発現されたタンパク質がどのように特定され、統合されたかのフローチャートを示しています。 合計 493 個のタンパク質が DIA-MS のターゲットとなり、そのうち 379 個のタンパク質が DIA-MS で保持されました。<29 missing values in the BD group and < 7 missing values in the healthy control group. After 36 proteins with potential contaminations from blood cells (5) were removed, we analyzed 343 additional proteins for hypothesis testing, of which 166 proteins showed a statistically significant difference between the BD and healthy control groups. The antibody microarray detected 549 proteins. After 5 control proteins were removed, we retained 544 proteins for further analysis; of these, 74 proteins showed statistically significant differences between the BD group and the healthy control group (Supplementary Figure 1). In total, 220 (29.0%) of 759 proteins were significantly differently expressed between the BD group and the healthy control group (P < 0.05), as shown using our in-depth proteomics platform comprising DIA-MS and the antibody microarray (Figure 2A and Supplementary Figures 1 and 5, available at https:// onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). The number of differentially expressed proteins is 10-fold more than previously reported (2,3,6). Among these proteins, 5 were identified as potential plasma or serum biomarkers in proteomics research for patients with BD, including haptoglobin, apoprotein, transthyretin, immunoglobulin light chain, and immunoglobulin heavy chain. Furthermore, growth arrest–specific 6, resistin, von Willebrand factor (VWF), and others were also identified to be increased in the BD group (Figure 2B). We identified 215 new proteins associated with BD, including serpin A3 (SERPINA3), glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1 (GPLD1), and attractin (ATRN) (Figure 2C).

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BD 患者を健常対照者と区別できるかどうかを判断するために、22 の0 個の発現差のあるタンパク質の偏りのない階層的クラスタリング分析を実行しました (P < 0.05)。 {3}}.0% の BD 患者と 86.4% の健康な対照がクラスター化されました (補足図 6、関節炎とリウマチの Web サイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ で入手可能) 10.1002/art.42348)。 130 種類の差次的に発現するタンパク質 (P < 0.01) のうち、BD 患者の 88.6% と健康な対照の 95.5% がクラスター化されていることがわかりました (図 2D)。 さらに部分最小二乗判別分析により、差次的に発現されたタンパク質の分類に従って、BD グループの患者が健康なコントロールと明確に区​​別できることが明らかになりました (補足図 7、関節炎およびリウマチの Web サイト https://onlinelibrary.wiley で入手可能)。 com/doi/10.1002/art.42348)。 DisGeNET プラットフォーム (7) を使用した疾患の強化により、これらの差次的に発現されたタンパク質が、炎症、自己免疫疾患、および BD や血管炎を含む血管疾患と大きく関連していることがさらに示されました (図 2E および補足表 9、https の関節炎およびリウマチ学の Web サイトで入手可能) ://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348)。 Cytoscape と CluGo を使用したバイオインフォマティクス分析では、BD における次の 8 つの主要な生物学的プロセスが特定されました: 1) 補体活性化、2) 血漿リポタンパク質粒子レベルの調節、3) 創傷治癒、4) 血管新生、5) 白血球媒介免疫、6) ）ペプチダーゼ活性、7）細胞活性化の正の制御、および8）白血球遊走（図2Fおよび補足表10、関節炎およびリウマチのWebサイトhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348で入手可能） ）。 これらの生物学的プロセスは、BD 発生中の炎症と凝固の病理学的メカニズムに収束し、炎症中の脂質プロファイルと酸化ストレスによる修飾が内皮機能不全と血管イベントを引き起こします (8-11)。

一貫して、KEGG データベース (http://www.genome.ad.jp/kegg で入手可能) からの最も重要な経路は補体および凝固カスケード (図 3A) であり、38 個のタンパク質 (P < 0.05) でした。 ）は、19 の補体（C）成分（C1QA、C1QB、C1QC、C1S、C2、C4B、C4b 結合タンパク質アルファ鎖 [C4BPA]、C5、C6、C7、C8 アルファ鎖、C8 ベータ鎖、C8 ガンマ）を含む）が同定されました。鎖 [C8G]、C9、補体因子 [CF] B、CFH、CFH 関連タンパク質 4 [CFHR4]、CFI、およびコンポーネント受容体 1 様タンパク質）、5 つの凝固因子（F11、F12、F13B、F5、および F9） ）、4 つの凝固関連タンパク質（組織型プラスミノーゲン活性化因子 [PLAT]、プロテイン C、抗凝固プロテイン S [PROS1]、および VWF）、および 5 つのセルピンファミリータンパク質（SERPINA1、SERPINC1、SERPIND1、SERPINF2、および SERPING1）。 カスケード内の 25 個のタンパク質は、治療薬の開発可能な標的でした (図 3B)。 興味深いことに、KEGG 経路および補体および凝固カスケードに含まれるほとんどのタンパク質は、血液凝固/創傷治癒の最も豊富な生物学的プロセスに関与するタンパク質と重複していました (図 3B および補足表 10、https://onlinelibrary.wiley.com/ で入手可能) doi/10.1002/art.42348.)。 この研究では、KEGG 経路解析を使用して、黄色ブドウ球菌感染、プリオン病、百日咳、ヒトパピローマウイルス感染、単純ヘルペスウイルス 1 型感染、ウイルスタンパク質とサイトカインおよびサイトカイン受容体との相互作用など、いくつかの病原性感染経路が同定され、病原性感染の役割が強調されています。 BD (補足図 8A、関節炎およびリウマチ学の Web サイトで入手可能)https://オンラインライブラリ。

図 2. DIA-MS と抗体マイクロアレイによって同定された、BD 患者と健常対照群の間でタンパク質の発現差が確認されました。 BD 患者と健康な対照群で調節不全になっているタンパク質を示す Volcano プロット。 有意に上方制御および下方制御されたタンパク質 (P < 0.05) は、それぞれ赤色および青色の点で示されます。 B、BD 患者と健常対照の血漿中の代表的なタンパク質の発現強度を示す散布図。 記号は個々のサンプルを表します。 水平線は中央値を示します。 C、我々の研究で特定されたBD患者における差次的に発現されたタンパク質の数と、以前の研究で特定されたタンパク質の数を比較したベン図。 D、BD 群と健常対照群間で差次的に発現されたタンパク質の階層的クラスタリング分析 (P < 0.01)。BD 患者の 88.6% と HC の 95.5% がクラスタリングされました。 破線の長方形の領域は、各グループと対応する高発現タンパク質を示します。 E、健常対照と比較したBD患者における調節不全タンパク質に関連する疾患の濃縮（DisGeNETプラットフォームに由来）（log10 [q値] < -15）。 F、健康対照者と比較してBD患者において差次的に発現されたタンパク質を使用して同定された、有意に濃縮された生物学的プロセス(P<0.05)。 *=P < 0.05; **=P < 0.01; ***=P < 0.001; ****=P < 0.0001。 GAS6=の成長停止 – 特異的 6; RETN=レジスチン; VWF=フォン ヴィレブランド係数; SERPINA3=セルピン A3 (1-アンチキモトリプシン); GPLD1=グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ D1; ATRN=誘引 (他の定義については図 1 を参照)。

図 3. BD の発症に関連するシグナル伝達経路。 A、KEGG および Reactome データベースを使用して、健常対照と比較して BD 患者において差次的に発現されるタンパク質に関連するシグナル伝達経路が大幅に濃縮されたことが特定されました (P < 0.01)。 赤いフォントは、血液凝固と補体活性化に関連する経路を示します。 B、補体および凝固カスケード。KEGG データベースを使用して同定され、健常対照と比較して BD 患者において差次的に発現されたタンパク質との最も重要な関連性を示しています。 既知の承認済み薬剤が標的とする可能性のある特徴的なタンパク質が示されています。 CおよびD、健常対照と比較してBD患者において有意に発現されたタンパク質によって同定された、有意に濃縮されたタンパク質ドメイン(C)および細胞成分(D)(P<0.01)。 A、C、D では、バーの長さは P 値の 10 を底とする対数を示し、バーの隣の数字は各カテゴリに含まれるタンパク質の数を示します。 IGF=インスリン様成長因子; IGFBP=インスリン様成長因子結合タンパク質。 C=補数; ER=小胞体。 ECM=細胞外マトリックス。 CUB=は C1r/C1s、Uegf、および Bmp1 を補完します。 EGF=上皮成長因子。 アップ=がアップレギュレートされました。 Down=はダウンレギュレートされます (他の定義については図 1 を参照)。

wiley.com/doi/10.1002/art.42348) (12–17)。 13 の発現差の異なるタンパク質が関与する黄色ブドウ球菌感染の KEGG 経路 (P < 0.05) は大幅に濃縮されており (それらの一部は補足図 8B にマークされています)、BD の病因における黄色ブドウ球菌感染の役割が示唆されています (18,19)。 最後に、濃縮分析により、補体制御タンパク質に豊富に含まれるドメイン、スシリピート、膜攻撃複合体/パーフォリン、補体成分C1qドメイン、およびCUBドメイン（補体C1r/C1s、Uegf、およびBmp1の場合）を含む補体ドメインが同定されました。 ) (図 3C)。 細胞成分濃縮分析により、上方制御されたタンパク質は、特に、コラーゲン含有細胞外マトリックス、分泌顆粒内腔、血小板α顆粒、および血漿リポタンパク質粒子に濃縮されているが、下方制御されたタンパク質は主に、細胞外空間とエクソソーム (図 3D)。

血漿タンパク質に対する治療の影響を調査するために、GC および免疫抑制剤による治療に従って BD 患者をグループ分けしました。 治療の有無にかかわらず、BD 患者は健康な対照と明確に区​​別できます (補足図 9A、関節炎とリウマチの Web サイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art で入手可能)。 42348）。 この分析により、GCおよび免疫抑制剤で治療を受けなかったBD患者と比較して治療を受けたBD患者で変化した生物学的プロセスのほとんどは、免疫応答の制御に関連していることが実証されました（補足図9B）。 また、治療を受けていない BD 患者と、GC および免疫抑制剤治療を受けている BD 患者の間の血漿タンパク質の発現差も比較しました。 その結果、例えば、血漿リポタンパク質粒子レベルとクリアランス、およびセリン型エンドペプチダーゼ活性の調節に関与する68種類の発現差の異なるタンパク質（P < 0.05）が特定されました（補足図10、関節炎およびリウマチのウェブサイトhttps://で入手可能） onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348)。

器官分解された BD のプロテオミクス状況。 BD は、多臓器が関与する非常に不均一な疾患であり、さまざまな表現型の症状を示します (補足表 1、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art で入手可能) .42348）。 研究では、臨床症状に基づいて BD を細分類することが試みられています (20-23)。 プロテオミクスデータに基づいてBD患者間の不均一性を調査するために、220種類の発現差のあるタンパク質に対して教師なしコンセンサスクラスタリングを実行しました（図4A）。 主成分分析により、サブタイプ I およびサブタイプ II とサブタイプ III が明確に分離されていることが明らかになりました (図 4B)。 サブタイプ I 特異的タンパク質は主に血液凝固と補体活性化に関与し、サブタイプ II 特異的タンパク質は主にグルコースおよびタンパク質脂質代謝に関与し、サブタイプ III 特異的タンパク質は炎症反応に関与します (図 4D および補足図 11、関節炎およびリウマチ学の Web サイト (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348) で入手できます)。 プロテオミクスでサブタイプ化された BD グループ間で臨床的特徴に関する統計的に有意な差は見つかりませんでしたが、サブタイプ I とサブタイプ II は類似していることがわかり (図 4B)、これは主成分分析の結果と一致していました。 サブタイプ I およびサブタイプ II の BD 患者は、神経系障害（サブタイプ I で 13.8％、サブタイプ II で 8.2％、サブタイプ III で 0％）や血管障害（サブタイプ I で 27.6％、サブタイプ II で 22.4％）などの重篤な症状の割合が高かった。サブタイプ II では %、サブタイプ III では 0%)。 サブタイプ III の BD 患者は比較的軽度から中等度の症状を示しましたが、より高い割合の皮膚病変を示しました（サブタイプ III では 87.5%、サブタイプ I では 51.7%、サブタイプ II では 65.3%）（図 4E、補足表） 11、関節炎およびリウマチ学の Web サイト (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348) で入手可能)。 自己炎症、酸化還元不均衡、代謝変化、脂質異常症、凝固機能障害など、BD 発生中の複数の生物学的プロセスの変化を示す証拠が蓄積されています (8,24-27)。 したがって、我々の結果は、サブタイプ I およびサブタイプ II プロテオミクス グループに属する BD 患者は BD 重症度が高いにもかかわらず、2 つのグループの生物学的メカニズムが異なる可能性があることを示唆しています。

カンサス植物の免疫システムを高める

我々は、{{0}ステップクラスター分析を使用して、臨床データ（性別、年齢、重症度スコア、および臨床症状）に基づいてBDコホートのクラスター分析を実行しました（23）。 図 4E に示すように、BD 患者は 2 つのクラスター (クラスター 1 および 2) に分類され、患者は口腔潰瘍、皮膚病変、眼病変、および性器潰瘍などの症状によって分類されました。 クラスター 1 の BD 患者は、クラスター 1 の BD 患者と比較して、関節痛 (40.0%) および胃腸 (8.9%)、血管 (48.9%)、および神経 (22.2%) 系の症状を伴う関節炎表現型の発生率が有意に高かった。クラスター 2。次に、同じ BD コホートにおける臨床分類とプロテオミクス分類を比較しました。 その結果、プロテオミクスサブタイプ I および II 分類の患者と臨床クラスター 1 の患者は同様の臨床的特徴を共有し、患者は多臓器 (胃腸、血管、神経系) の関与とより高い疾患重症度を示したことが示されました (図 4E)。 逆に、プロテオミクスサブタイプ III 分類および臨床クラスター 2 の患者は同様の臨床特徴を示し、胃腸、血管、および神経系の関与を示す患者はいませんでした。 これらの発見は、プロテオミクス サブタイプ III の患者が臨床クラスター 2 でクラスター化され、プロテオミクス サブタイプ I および II の患者が臨床クラスター 1 でクラスター化された、偏りのない階層的クラスター分析 (図 4F) によってさらに裏付けることができます。これらの結果は、潜在的な有用性を示しています。 BD の不均一性と重症度を示すプロテオミクス分類。 BD 患者の治療戦略は、臨床的特徴と関与する臓器に大きく依存します。 しかし、器官分解された BD のプロテオミクス特性は不明です。

図 4. 血漿プロテオミクスと臨床変数を使用した BD 患者の分類。 A、各プロテオミクス サブタイプを伴う BD 患者の同時発生割合を示すコンセンサス マトリックスのヒートマップ。 B、BD 患者におけるプロテオミクス サブタイプ I、II、III の主成分分析。クラスター間の顕著な差異を示しています。 C、BD 患者における 3 つのプロテオミクス サブタイプにおける差次的に発現されたタンパク質の階層的クラスタリング分析 (P < 0.05、平均発現差 P > 0.2)。 D、3 つのサブタイプに関連する特定のタンパク質に基づく生物学的プロセスの機能グループ。 E、プロテオミクスサブタイプおよび臨床分類クラスターに従ったBD患者の人口統計学的および臨床的特徴の分布。 Ｆ、偏りのない階層的クラスタリング分析に基づく、ＢＤコホートにおけるプロテオミクスサブタイプおよび臨床分類クラスターに従った各臨床特徴の分布。 定義については、図 1 を参照してください。

図 5. 血漿プロテオミクスを使用した臓器分解 BD のランドスケープ マッピング。 A、器官分解されたBDのプロテオミクス状況。 左：表現型に応じた健常対照と比較したBD患者におけるタンパク質発現の変化倍数を示す図。 3 つのブロックは、左から右へ、健康な対照、対応する症状のない (2 つの) BD 患者、および対応する症状のある BD 患者を表します。 各ブロックの色の強度は、BD グループと健康なコントロール グループ間のタンパク質発現の変化倍数に比例します。 赤と青はそれぞれ上方制御されたタンパク質と下方制御されたタンパク質を示します。 右側は、差次的に発現された各タンパク質に関連する生物学的プロセス。四角形の灰色の強度は対数{6}}ベースの P 値を示し、数値は各カテゴリーに含まれるタンパク質の数を示します。 B、ヒアルロン酸結合タンパク質2（HABP2）、テネイシンC（TNC）、およびセルピンA3（1-アンチキモトリプシン）（SERPINA3）の発現とBD患者の重症度スコアとの間の相関関係（ピアソンまたはスピアマン）。 網掛けは 95% CI を示します。 C、健康な対照および軽度、中等度、および重度のBDグループにおけるHABP2、TNC、およびSERPINA3の発現強度対疾患重症度を示すバイオリンプロット。 記号は個々のサンプルを表します。 赤い水平点線は中央値を示し、上下の黒い点線は四分位範囲を示します。 *=P < 0.{{20}}5; **=P < 0.01; ***=P < 0.001; ****=P < 0.0001。 定義については、図 1 を参照してください。

したがって、我々は、異なる器官表現型を示した BD 患者の異なるグループで特異的に発現する 58 個のタンパク質を同定しました (図 5A)。 DrugBank データベース (https://go.drugbank.com/ で入手可能) での検索により、26 のタンパク質、すなわちアポリポタンパク質 A-IV、CFI、セルロプラスミン (CP)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 1 (GLUD1)、ヒアルロン酸結合タンパク質 2 が明らかになりました。 (HABP2)、F5、SERPINC1、SERPINA3、トランスフェリン受容体タンパク質1 (TFRC)、VWF、SERPINF2、CD44、Fc領域受容体III-A、アラニンアミノトランスフェラーゼ1、ロイコトリエンA-4加水分解酵素、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシンタイプ9、アンギオテンシノーゲン、C8G、ハプトグロビン、ペプチジル-プロリル シス-トランス イソメラーゼ A、セレノプロテイン P、SERPIND1、SERPING1、C4BPA、リンホトキシン アルファ、C4B、およびインタートリプシン重鎖 4 は、臨床または開発中の治療薬の標的です。 (補足表 12、関節炎とリウマチの Web サイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348 で入手可能。)。 表現型のうち、関節痛の症状を伴う関節炎表現型には、循環免疫グロブリンによって媒介される体液性免疫応答の制御、B 細胞媒介免疫の制御、免疫グロブリン媒介免疫応答の制御など、自己免疫に関連する生物学的プロセスが豊富に含まれています。 ; 胃腸の表現型は補体活性化とB細胞媒介免疫の調節に関連しています。 心臓に関与する表現型は、サイトカイン受容体活性、コラーゲン代謝プロセスの調節、および細胞外マトリックスの分解に関連しています。 精巣上体炎の表現型は急性期反応に関連しています。 そして、皮膚病変の表現型は、セリン型エンドペプチダーゼ阻害剤活性、血液凝固、循環免疫グロブリンによって媒介される体液性免疫応答、およびその他のプロセスに関連しています（関節炎およびリウマチのウェブサイトhttps://onlinelibraryで入手可能な図5Aおよび補足表13） .wiley.com/doi/10.1002/art.42348)。

血管表現型には、GLUD1、テネイシン C (TNC)、XC モチーフ ケモカイン リガンド 2、フィブリン細胞外マトリックス タンパク質 1 を含む上皮成長因子、HABP2、F5、ATRN、SERPINC1、GPLD1、インスリン様タンパク質など、差次的に発現されるタンパク質が最も多く含まれています。成長因子結合タンパク質 6、レクチンマンノース結合 2、SEPRINA3、TFRC、VWF、SERPINF2、およびリボヌクレアーゼ A ファミリーメンバー 4 (図 5A)。 バイオインフォマティクス分析により、これらの差次的に発現されるタンパク質が、とりわけ、血小板脱顆粒、血液凝固、翻訳後タンパク質リン酸化、セリン型エンドペプチダーゼ阻害剤活性、および急性炎症反応に関与していることが明らかになりました。 これらの結果はすべて、臓器分解型 BD のプロテオミクス状況を示しており、そこから各臓器表現型の標的タンパク質に対する個別化された治療法を開発できる可能性があります。

男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点

Identification of plasma proteins related to BD severity. Among the 220 unique differentially expressed proteins (P < 0.05), 28 were positively correlated with the severity of BD (Figures 5B and 5C and Supplementary Figure 12, available on the Arthritis & Rheumatology website at https://onlinelibrary. wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Seven proteins displayed a linear correlation with the severity score, namely, TNC, HABP2, SERPINA3, F5, ATRN, C4B, and CFH (Figure 5B and Supplementary Figure 12A). The expression of these 7 proteins was up-regulated in the severe BD group compared with the mild and moderate BD groups and the healthy control group, as indicated in the scatter plot in Figure 5C (see also Supplementary Figure 12A). Next, we selected and validated 7 protein candidates (TNC, HABP2, SERPINA3, ATRN, C4BPA, GPLD1, and C5) in an independent cohort composed of 108 patients with BD and 29 healthy controls by using quantitative ELISA (Supplementary Table 3, available at https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348). The reproducibility of the ELISA for the validation of plasma proteins was >0.9 (補足図 13、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348 で入手可能)。 BD グループでは、健康な対照グループと比較して HABP2、TNC、および SERPINA3 の血漿レベルの上昇が確認され (図 6A)、疾患の重症度との相関関係も確認されました (図 6B および 6C)。 また、BD 患者 (n=39) と高安動脈炎患者の対照群 (n=8) および健康な対照群 (n=10) の間で、ELISA を使用して評価した HABP2 の発現を比較しました。 ）（補足図 14 および補足表 5、関節炎およびリウマチ学の Web サイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348 で入手可能。）。 結果は、BD グループの HABP2 濃度が高安動脈炎および健康な対照グループの濃度よりも有意に高いことを示し (補足​​図 14)、BD 診断の潜在的なバイオマーカーとしての HABP2 の特異性を示しています。

クラウスの重症度スコアによると、血管症状が最大の重みを持っています。 したがって、静脈血栓症、動脈狭窄、閉塞、拡張、または動脈瘤の存在に応じて、患者を血管性 BD グループと非血管性 BD グループに分けました（補足表 4、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/1 で入手可能）。 0.10{{20}}2/art.42348)。 血管性 BD、非血管性 BD、および健常対照群間で HABP2、TNC、および SERPINA3 の発現レベルを比較しました。 結果は、3 つのタンパク質が血管 BD グループで有意に上方制御されていることを示しました (図 6D)。 HABP2、TNC、およびSERPINA3の受信者動作特性曲線分析も実行され、カットオフ、感度、および特異性が決定されました（補足表14、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/1で入手可能{{24 }}.1002/条項 42348.)。 その結果、HABP2 (曲線下面積 [AUC] 0.68、感度 0.69、特異度 0.69) および TNC (AUC 0.71、感度 0.58、特異度 0.77) が血管性 BD と非血管性 BD を区別できる可能性があることが示されました。 3 つのバイオマーカーのレベルを、不活動性血管性 BD 患者と活動性血管性 BD 患者間で比較しました。 その結果、HABP2、TNC、およびSERPINA3の発現レベルは、血管BD活性に関係なく、BD患者で一貫して高いことが示されました（補足図15、関節炎およびリウマチのWebサイトhttps://onlinelibrary.wiley.com/doiで入手可能） /10.1002/art.42348)。

図 6. 独立コホートにおける ELISA によって評価された血管 BD バイオマーカーの検証。 A、C、およびD、健康な対照群とすべてのBDにおけるヒアルロナン結合タンパク質2（HABP2）、テネイシンC（TNC）、およびセルピンA3（1-抗キモトリプシン）（SERPINA3）の血漿濃度（濃度）患者（A）、軽度、中等度、および重篤な疾患群のBD患者との比較（C）、非血管性BD（N-VBD）および血管性BD（VBD）患者との比較（D）。 B、HABP2、TNC、およびSERPINA3濃度とBD重症度スコア間の相関関係（ピアソンまたはスピアマン）。 網掛けは 95% CI を示します。 *=P < 0.05; **=P < 0.01; ***=P < 0.001; ****=P < 0.0001。 定義については、図 1 を参照してください。

血漿タンパク質、ベーチェット病の現在活動性フォームスコア、および臨床データ間の相関分析。 HABP2、TNC、およびSERPINA3は、非活動性BDおよび健康な対照群と比較して、活動性BDグループでレベルの上昇を示しました（P < 0.001）（補足図16A、関節炎およびリウマチ学で入手可能）ウェブサイト https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348)。 SERPINA3のレベルは、ベーチェット病現在活動性形態（BDCAF）スコアが高いグループで上昇しました（補足図16B）。 さらに、BD 患者では、SERPINA3 と BDCAF スコアのレベルは正の相関を示しました (r=0.39、p=0.0036)。一方、HABP2 と TNC のレベルは、BD 患者と正の相関を示さなかった。 BDCAFスコア。 さらに、患者の血漿レベルと臨床データの間の相関関係を分析しました（補足図 17A および補足表 15、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348 で入手可能）。 r > 0.3 の相関係数がコード プロットで強調表示されました。 代表的な散布図を補足図S17B〜Gに示します。 その結果、HABP2、TNC、およびSERPINA3レベルが、C反応性タンパク質レベル、好中球数、赤血球分布幅、好中球対リンパ球比、血小板数、および血小板分布幅と正の相関があることが示されました。 これらの結果はすべて、HABP2、TNC、およびSERPINA3が炎症、内皮機能、および血小板活性化と機能的に関連しており、BDの重症度と活性を示すバイオマーカーとして機能する可能性があることを示しており、将来的には別の臨床コホートで検証される必要がある。

議論

BD は、ヒトの組織や器官のあらゆるサイズの動脈および静脈で炎症を引き起こす原因となるさまざまな病原メカニズムを反映する、不均一な臨床症状を示す全身性血管炎です。 この研究では、BD 患者グループにおいて、さまざまな生物学的プロセスに関与する一連の調節不全タンパク質 (n=220) を特定し、バイオインフォマティクス分析を使用して、免疫と炎症の相互作用、血栓症の存在、およびBDにおける補体系によって媒介される病理学的役割。 KEGG 分析により、BD と補体および凝固カスケードおよび細菌感染との関連がさらに明らかになりました。 補体系は、脱顆粒、走化性、食作用、B 細胞受容体シグナル伝達経路、および膜攻撃複合体による細胞溶解によって病原体を防御するために自然免疫と炎症を仲介しますが、凝固カスケードは抗炎症反応、血管拡張、内皮透過性の増加と血小板の活性化。 Bakir-Gungorらは、ゲノムワイド関連データを用いて、補体と凝固カスケードがトルコ人と日本人のBD患者間に共通する6つの経路のうちの1つであることを示し、これは遺伝的背景から我々の結果を裏付け、さらに炎症機構と血管障害を実証している。 BD の病因における血小板増加症 (28)。 白血球媒介免疫、細胞活性化の正の制御、および白血球遊走は、BD における能動的な免疫応答および炎症応答を示しています。 好中球は活性化されて酸素フリーラジカルと好中球細胞外トラップを生成し、血管内皮細胞の炎症性損傷、静脈血栓症、動脈瘤を引き起こします。 活性好中球によって生成される活性酸素種は、脂質過酸化の増加で示されるように (9,11)、脂質およびリポタンパク質、特に低密度リポタンパク質の酸化と修飾を引き起こす可能性があり、その結果、心血管リスクが増加します (9,10)。ターンすると、炎症反応が増加します(10)。 この現象は、我々の研究で観察された血漿リポタンパク質粒子レベルの調節およびタンパク質-脂質複合体のリモデリングの生物学的プロセスと一致しています。 私たちの研究の証拠は、白血球の活性酸素種の生成と血漿脂質の過酸化を結び付ける Emmi らの発見と一致しています (8)。

プロテオミクスを用いたコンセンサスクラスタリング分析により、BD患者の不均一性が明らかになった。 サブタイプ I の患者はより重度の症状を示しており、これは血液凝固と補体活性化という活発な生物学的プロセスに関連している可能性があります。 対照的に、サブタイプ III の患者の症状は比較的軽度であり、このサブグループでは炎症反応が主な病理学的プロセスである可能性があります。 さらに、さまざまな臓器障害を伴う BD 患者のプロテオミクス特性を特定しました。 私たちのバイオインフォマティクス分析は、自己免疫と関節痛の症状を伴う関節炎表現型との関連によって例示されるように、各臓器表現型のタンパク質の特徴の機能を効果的に示します (29-31)。 主要な血管イベント、眼病変、および神経学的関与が、罹患率および死亡率の主な原因である(16)。 BD の治療は、関与する臓器の種類とその臓器系内の疾患の重症度によって異なります。 しかし、私たちの知る限りでは、BD に対する標的療法は現在まで利用できません。 我々の結果は、各臓器で解決されたBDの診断手順と治療法が、病原メカニズムの不均一性のために異なる可能性があることを示唆しています。 いくつかの重要なタンパク質は、胃腸、神経、眼、関節、血管の病変などの表現型の創薬可能な標的となる可能性があります。

さまざまな人種および民族間の血管性BD患者の割合は7.7%から43%の範囲である(32)。 この疾患は、ほとんどの場合、高リスクの動静脈血栓症および/または動脈瘤、高い疾患重症度、および累積年間再発率 38.4% を伴います (33)。 免疫および炎症因子は、BD における血管の関与および症状に寄与すると考えられています。 内皮細胞への損傷は、血栓リスクの傾向をもたらすことが知られています(34)。 さらに、線維化に伴う血管壁の損傷は、動脈壁の弱体化とその後の動脈瘤による血管壁の膨張を引き起こす可能性があります(35,36)。 不規則性、狭窄、閉塞も、急性炎症中および線維症後に誘発される可能性があります (37)。一方、慢性炎症は内皮の血管拡張特性の機能不全をさらに促進します (38)。 第 VII 因子活性化プロテアーゼとも呼ばれる HABP2 は、もともと内皮細胞のバリア調節に役割を持つグリコサミノグリカンであるヒアルロン酸に結合する能力によって発見され (39)、血液凝固と線維素溶解に関与しています (40)。 以前の研究では、HABP2 が炎症、アポトーシス、血管平滑筋細胞や内皮細胞の細胞増殖を活性化する可能性があり (41-43)、プロテアーゼ活性化受容体 (PAR、トロンビンと同様) を介して血管の完全性と透過性の調節因子として機能する可能性があることが報告されています。 )/RhoA/Rho 関連プロテインキナーゼ (ROCK) シグナル伝達経路 (44)。 HABP2 または PAR/RhoA/ROCK のサイレンシング (低分子干渉 RNA を使用) は、HABP2- 媒介の内皮細胞バリア破壊を阻害します (44)。 TNC は、血小板を活性化するか組織プラスミノーゲン活性化因子を下方制御することによってプラークの形成と破裂に寄与する炎症誘発性の細胞外マトリックス糖タンパク質です (45)。 血清 TNC レベルはアテローム性動脈硬化の重症度と相関しており (46)、一過性の TNC 発現は血管損傷中に上方制御されるが、修復が完了すると消失することが示されています (45)。

1-アンチキモトリプシンとしても知られる SERPINA3 は、いくつかのセリン プロテアーゼ、特にカテプシン G を阻害します (47)。 炎症細胞に加えて、収縮性の低い平滑筋細胞はマクロファージ様表現型に脱分化する可能性があり、これは血管壁損傷部位におけるサイトカインおよびSERPINA3の供給源でもある可能性がある(48)。 これまでの研究では、血管平滑筋細胞の増殖を負に制御する (49) または好中球の蓄積を阻害する (47) という SERPINA3 の積極的な役割が、有害な心血管イベントの発生を予測できる可能性があることを示しています。 しかし、SERPINA3 が BD 患者の血管炎の発症過程で役割を果たしているのか、それとも発症過程の産物なのかは不明のままです。 特に、HABP2 薬剤のヒアルロン酸は、抗炎症作用、創傷修復作用、組織再生作用、およびその他の重要な特性を示すアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンです。 ヒアルロン酸は、癌、眼科、関節科、肺科、鼻科、泌尿器科の治療やその他の用途で研究されています(50)。 SERPINA3を標的とする小分子（酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、亜鉛、塩化亜鉛）がいくつかあります（補足表12、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348で入手可能）。 これらの結果は、私たちの研究で特定されたバイオマーカーが、BD 患者の新しい治療法の開発におけるターゲットとしても機能する可能性があることを示しています。 私たちの研究にはいくつかの限界があります。 まず、血漿サンプルの数が制限されていました。 私たちの研究で特定されたバイオマーカーは、異なる自己炎症性疾患および自己免疫疾患を対照とした、異なるより大規模なコホートで検証される必要があります。 第二に、治療を受けていないBD患者のコホートで結果を検証する必要がある。 第三に、BD の発症におけるバイオマーカータンパク質の生物学的機能は、細胞モデルと動物モデルを使用した将来の研究で検討される必要があります。

総合すると、これは我々の知る限り、臓器分解された BD のプロテオミクス特性を包括的に分析した最初の研究です。 この結果は、BDの不均一性と病因についての基本的な洞察を提供し、将来の血管性BDの臨床評価と治療のための潜在的なバイオマーカーとして血漿タンパク質（HABP2、TNC、およびSERPINA3）を強調する。

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