SARS-CoV-2 の脆弱性部位のスパイクにより、抗原的に異なるオミクロン亜変異体に対する広範な防御抗体が誘導される

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) オミクロン変異体の急速な進化により、将来のモノクローナル療法やワクチン接種戦略に役立つ幅広い中和能力を持つ抗体を同定する必要性が強調されています。 本明細書において、我々は、受容体結合部位（RBS）を標的とする広範囲中和抗体（bnAb）であるS728-1157を同定した。これは、感染拡大前にWT SARS-CoV-2に感染していた個体に由来するものであった。懸念される変異体 (VOC)。 S728-1157 は、D614G、ベータ、デルタ、カッパ、ミュー、オミクロン (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/) を含むすべての主要なバリアントの広範な交差中和を実証しました。 BL.1/XBB)。 さらに、S728-1157 は、WT、Delta、BA.1 ウイルスによる生体内攻撃からハムスターを保護しました。 構造分析により、この抗体は、CDR-H1/の共通モチーフに加えて、重鎖相補性決定領域 3 (CDR-H3) との複数の疎水性および極性相互作用を介して、受容体結合ドメインのクラス 1/RBS-A エピトープを標的とすることが示されました。クラス 1/RBS-A 抗体の CDR-H2。 重要なことに、このエピトープは、ジプロリン (2P) 構築物と比較して、開いた融合前の状態、またはヘキサプロリン (6P) 安定化スパイク構築物においてより容易にアクセス可能でした。 全体として、S728-1157は幅広い治療の可能性を示しており、将来のSARS-CoV-2の変異種に対する標的主導のワクチン設計に情報を提供する可能性があります。

カンクサ-免疫システムを改善する

導入

2019年12月にパンデミックが始まって以来、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）ウイルスにより、2019年コロナウイルス感染症（COVID-19）の感染者数は6億6千万人を超え、感染者数は6.5人を超えています。世界中で数百万人の死者。 ワクチンと治療薬の急速な開発と配布により、新型コロナウイルスの影響は大幅に抑制されてきました-19が、さらなる免疫回避の可能性があるため、循環懸念変異種（VOC）の出現は引き続き大きな脅威となっています。そして病原性も増強される。 D614G バリアントは最も初期に出現したバリアントであり、その後広く普及しました。 WT と比較して、D614G 変異体は病原性の増加ではなく伝染性の増加を示したため、臨床試験でワクチンの有効性を低下させる可能性は低かった(1)。 D614G の出現から 2021 年 10 月までの間に、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタを含む 4 つの重要な VOC が世界中でさらに進化しました。 これらの変異株の中でも、ポリクローナル血清と mAb のこの株を中和する能力の低下によって示されるように、デルタ株は、その伝播性、疾患の重症度の増加、および部分的な免疫回避により、深刻な世界的脅威となりました (2-6)。 その直後の 2021 年 11 月に、Omicron の亜種が特定され、新しい VOC として発表されました。 この変異株はこれまでで最も多くの変異を有しており、以前の株よりも急速に拡散したようです (7、8)。 現在、新たな新型コロナウイルス感染症-19症例につながる幅広いOmicron亜系統が存在しており、BQ.1、BQ.1.1、XBB.1.5がBA.5よりも優勢となり、当時世界中の新規症例のほとんどを占めています。書くことの。 Omicron 変異体は、さまざまな程度で、COVID-19 ワクチン関連免疫による認識を回避する可能性があり、それにより、完全に mRNA ワクチン接種を受けた回復期の個人および新しい WT/BA.5 二価ワクチンで追加免疫された個人の血清抗体の中和能力が大幅に低下します。 mRNA ワクチン (9、10)。 同様に、Omicron 変異体は、初期の VOC に対して有効であることが以前に示されていたにもかかわらず、いくつかの緊急使用許可 (EUA) 治療用 mAb の結合を回避することができました (10-12)。 オミクロンに対する中和力の低下と将来の VOC の継続的な脅威により、多様に進化する SARS-CoV-2 系統から防御できる広範で強力な中和抗体を特定することが急務となっています。 この研究では、SARS-CoV-2の回復期患者の末梢血から、アルファ、ベータ、カッパ、デルタ、ミュー、 Omicron のバリアント (BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4、BA.5、BL.1、および XBB)。 この mAb、S728-1157 は、ハムスターの in vivo 攻撃後の肺および鼻粘膜における BA.1 オミクロン、デルタ、および WT ウイルス量を大幅に減少させました。 S728-1157 は、スパイク上の RBD がアップ構造にあるときに完全に露出する受容体結合部位 (RBS) に結合します。 この mAb は、IGHV3-53/3-66 クラス 1/RBS-A 抗体に共通する CDR-H1 および CDR-H2 に見られるモチーフを使用します (13、14) が、CDR との広範な独自の接触によっても使用されます。 -H3 は VOC スパイクの突然変異を回避します。 これは、Omicron 変異体を対象とする将来のワクチン追加免疫の合理的な設計を変更して、同様の CDR-H3 特徴を持つクラス 1/RBS-A mAb を最適に誘導するために、ほぼアップ構成で安定したスパイクを提示するように変更する必要があることを示唆しています。

カンクサの利点 - 免疫システムの強化

結果

多様な中和パターンと効力を示す RBD 反応性 mAb の単離。 Omicron 系統が普及する前に、N 末端ドメイン (NTD)、RBD、サブユニット 2 (S2) など、スパイクタンパク質上の異なるエピトープを標的とする 43 個の mAb を以前に特徴付けました。 これらの抗体はいずれも、当時流行していた SARS-CoV-2 変異体を中和できませんでした (15)。 この研究では、RBD 反応性 mAb の追加パネルが、以前に定義されたとおり (16)、強力な抗スパイク IgG 応答を示した高応答者 3 名から発現されました (補足表 1 および 3; この記事でオンラインで入手できる補足資料; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1)。 スパイク RBD 結合 B 細胞の割合は、中応答者および低応答者と比較して高応答者では同様でしたが (図 1、A ～ C)、重鎖体細胞超突然変異率は高応答者グループで有意に高かった (図 1) 、D、および E)、これらの個人は強力な交差反応性 mAbs を生成する可能性が最も高い可能性があることを示唆しています (16)。 これらの抗体は、エピトープ分類を特定するために、RBD 変異体に対してさらに調査されました (17)。 14 種類の RBD 反応性 mAb のうち、テストした主要な RBD 変異体に対する結合の低下がほとんどまたはまったく示されなかった 4 つのクラス 2 mAb、2 つのクラス 3 mAb、および 8 つの未分類 mAb を特定しました (図 1F)。 クラス 2、クラス 3、およびクラス 4 抗体は、以前の研究で定義された RBS BD、S309、および CR3022 エピトープにほぼ対応していることに注意してください (13、18)。 クラス 2 および 3 の RBD mAbs は、K417N/E484K/L452R/ N501Y 置換を含む多変種 RBD 変異体、ウイルス回避のための重要な変異を含むように人工的に設計された RBD を認識しませんでした (17、18)。また、クラス 2 および 3 の RBD mAb は、 SARS-CoV-1 および中東呼吸器症候群 (MERS)-CoV の RBD (図 1F)。 機能的には、クラス 2 および 3 RBD mAb は D614G および Delta 変異体を強力に中和しましたが、Beta、Kappa、および Mu に対する中和活性はより限定的でした (図 1G)。 アッセイされたクラス 2 または 3 抗体はいずれも、テストされた Omicron バリアントを中和しませんでした。

対照的に、未分類の mAb の大部分は RBD 多変種に結合し、SARS-CoV-1 RBD と交差反応しました (図 1F)。 これらのうち、3 つの mAb、S451-1140、S626-161、および S728-1157 を同定しました。これらは、D614G に対して高い中和効力を示し、ベータ、デルタ、カッパ、ミュー、および交差中和されました。 Omicron BA.1 の 99% 阻害濃度 (IC99) は 20 ～ 2,500 ng/mL の範囲です (図 1G)。 これら 3 つの mAb の広範な中和能力を考慮して、プラーク アッセイ プラットフォームに加えて、本物の BA.2.75、BL.1 (BA.2.75+R346T)、BA.4、 BA.5 および XBB ウイルスは、焦点低減中和テスト (FRNT) を使用しました (図 1G)。 これらのうち、S728-1157 は、BA.1、BA.2、BA.4、BA.5 を含む一連の Omicron バリアントに対して高い中和活性を示し、IC99 は、IC99 で測定すると最大 100 ng/mL でした。プラークアッセイ。 同様のシナリオが FRNT を使用して観察され、S728-1157 は BA.2.75、BL.1、BA.4、BA.5、および XBB に対して高い中和活性を維持し、IC50 は 8 ～ 300 ng の範囲でした。 /mL (図 1G)。 両方の中和アッセイプラットフォームで観察されたように、S451-1140 は BA.1、BA.2、BA.2.75、および BL.1 を強力に中和しましたが、BA.4 と BA.5 は中和しませんでした。 一方、S626-161 は、BA.1 変異体を超える Omicron 変異体に対して中和活性を示さなかった (図 1G)。 S626-161 は他の 2 つの抗体よりも試験した VOC に対する中和能力が低かったものの、SARS CoV-1 RBD に対して交差反応性を示しただけでなく、コウモリも中和することができた唯一の mAb でした。コロナウイルス WIV-1 および RsSHC014 (図 1、F および G)。 これらのデータは、S626-161 がこれらのアルボウイルス系統間で共有されているが、BA.2 以降の株には存在しない保存されたエピトープを認識することを示唆しています。 さらに、S728-1157 および S451-1140 と比較して、S626-161 はより長い CDR-H3 を有しており、前述のように、アルボウイルス間で共有される高度に保存された残基パッチを認識する能力が強化されている可能性があります。以前の研究 (19) (補足図 1)。 これら 3 つの mAbs の免疫グロブリン重鎖 (IGHV) および軽鎖 (IGLV または IGKV) 可変遺伝子を利用可能な SARS-CoV-2 中和 mAbs データベース (13、15、20–27) と比較したところ、重鎖がS728-1157 (IGHV3-66)、S451-1140 (IGHV3-23)、および S626-161 (IGHV4-39) によって利用される可変遺伝子は、は、RBDを標的とするいくつかの強力に中和するSARS-CoV-2抗体をコードしていることが以前に報告されている(21、22、28、29)。 ただし、S728-1157 のみがデータベースに報告されていない固有の重鎖および軽鎖可変遺伝子の組み合わせを持っており (補足表 3)、これが公的クロノタイプではないことを示しています。

図 1. 新型コロナウイルス-19 - 回復期患者から分離された RBD 反応性 mAb の特性評価

これら 3 つの mAb (S451-1140、S626-161、および S728-1157) は、SARSCoV-2 VOC に対する結合範囲を決定するためにさらに特徴付けされました (図 2、A および B) 。 S2 サブユニットにプロリン置換 (2P; ジプロリン) を含む融合前安定化スパイクは、WT スパイクと比較して優れた免疫原であることが示されており、現在のいくつかの SARS-CoV の基礎となっています-2 mRNA ベースのワクチンを含むワクチン (30、31)。 最近では、6 プロリン (6P; ヘキサプロリン) で安定化されたスパイクタンパク質が発現を促進し、元のジプロリン構築物よりもさらに安定していることが報告されました。 その結果、次世代の新型コロナウイルス-19ワクチンでの使用が提案されています(32, 33)。 ジプロリンとヘキサプロリンのスパイク構築物の間に抗原性の違いがあるかどうかを判断するために、両方の免疫原がテストパネルに含まれました。 ELISAで測定したところ、3つのmAbがWT-2Pスパイクと比較してより大きな程度で6P-WTスパイク抗原に結合することがわかりました（図2、AおよびB）。 3 つの mAb はすべて、WT-2P と比較して、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ ウイルスのスパイクに対して同等の結合を示しました (図 2、A および B)。 ただし、これら 3 つの mAb の結合反応性は、Omicron ファミリー抗原のパネルに対して実質的に低下しました (図 2、B、および C)。 S451-1140結合はBA.1およびBA.2に見られる変異に敏感であり、その結果、WTと比較してこれらの変異体に対する結合が大幅に減少し、中和が31-倍減少した-2それぞれ P 抗原と D614G ウイルス (図 2B)。 サルベコウイルス交差中和モノクローナル抗体 S626-161 も、スパイク BA.1 抗原への結合が 1.2- から 3.5- 倍減少することを示し、これが 2- の原因となる可能性があります。 BA.1に対する中和活性の1倍の減少（図1Gおよび図2、BおよびC）。 最も強力な広域中和抗体 (bnAb) である S728-1157 の場合、Omicron 抗原への結合は、Omicron 抗原と比較してより低い程度に減少しました (1.1- から 4.4- 倍の範囲)。 WT-2P はスパイクしましたが、中和活性には影響を受けませんでした (図 1G および図 2、B および C)。 BA.1 スパイクへの Omicron 中和 mAb 結合の大幅な減少は、その移動度の変化による可能性があり、Omicron 3-RBD-down 構造の密なパッキングと 1- の優先性に関連している可能性があります。以前の研究で報告されているように、RBD は抗体を回避するのに役立ちます (34)。 2P および 6P の安定化変異は、Omicron バリアントでも異なる効果を示し、3 つの mAb はすべて、BA と比較してスパイク BA への結合が 2.{67}}2 倍以上増加しました。1-2Pただし、スパイク BA.2 および BA.4/5 6P バージョンへの結合は、2P バージョンと比較して 1.2 × ～ 1.4 × わずかに増加しただけであり、六重極バージョンへの Omicron 中和 mAb のアクセス可能性がわずかに優れていることを示唆しています。特にスパイク BA.1 構造の場合。 ELISA に加えて、生物層干渉法 (BLI) を使用して、スパイク抗原のパネルに対するこれら 3 つの mAb の結合速度と平衡定数 (kon、koff、および KD) を定量しました (補足図 2)。 ヘキサプロリン スパイクに対するフラグメント抗原結合 (Fab) の認識速度は、ジプロリン スパイクと比較して 1.5- ～ 3.3- 倍速かった (補足図 2、B および C)。抗体は、2P 構築物よりも 6P 構築物に迅速に結合しました。 これは、ヘキサプロリン スパイク上の開いた状態の RBD 上でエピトープがよりアクセスしやすくなっていれば予想されたことかもしれません。 S626- 161 を除いて、Fab はジプロリン スパイクよりもヘキサプロリン スパイクからの解離が遅く（koff が低かった）、全体的な KD は S728-1157 と S451-1140 が結合していることを示しました。より高い親和性を持つヘキサプロリン スパイク (補足図 2、B および C)。 ヘキサプロリン スパイクへの結合の増加は、S728-1157 および S451- 1140 mAbs によって示されるように、1:2 相互作用モデルによるインタクト IgG の場合さらに顕著であり、6P 安定化による複数のエピトープの露出と一致しています。親和性が向上しました (補足図 2、A および C)。 総合すると、これらの結果は、RBD が開いた状態にある場合、標的となるエピトープが 6P 安定化スパイク上で比較的アクセスしやすい可能性があることを示唆しています。 次に、この推測を検証するために構造解析が実行されました。

図 2. Omicron 中和 mAb の結合幅

広範囲に中和する mAb の構造解析。 結合したエピトープの最初の近似値として、ELISA 競合アッセイを使用して、これら 3 つの広範に中和する mAb が、以前の研究で既知のエピトープ特異性を持つ mAb のコレクションである現在の mAb パネルと重複するかどうかを決定しました (15、25、35)。 、および現在臨床使用されている他の 2 つの mAbs、LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) および REGN10933 (Regeneron) (37)。 S451-1140 と S728-1157 の結合部位は、クラス 1 中和抗体である CC12.3 (23, 25)、および LY-CoV555 や REGN10933 を含むほとんどのクラス 2 抗体と部分的に重複していましたが、そうではありませんでした。クラス 3 およびクラス 4 抗体を使用します (図 3A)。 S626-161 は、クラス 1 CC12.3、CR3022 を含むいくつかのクラス 4 抗体、およびその他の未分類の抗体と結合領域で顕著な重複を共有しましたが、いくつかのクラス 2 および単一のクラス 3 抗体とは部分的な重複を持ちました (図3A）。 同様に、競合BLIアッセイにより、S451-1140とS728-1157はスパイクWT-6Pへの結合に関して互いに強く競合したが、S626-161は競合しなかったことが明らかになった（補足図） 3)。 全体として、これらのデータは、S451-1140 と S728-1157 が S626-161 とは異なる類似のエピトープを認識することを示唆しています。

図 3. S728-1157 の広範な中和のメカニズム

抗体 S728-1157 は IGHV3-66 によってコードされており、短い相補性決定領域 3 (CDR-H3) を持っていました。 特に、CC12.1、CC12.3、B38、およびC105 (13、18、23、29、38、39) に代表される、結合モード 1 (すなわち、RBS-A またはクラス 1 部位) で RBS に結合する mAb、 IGHV3-53 または 3-66 を使用する傾向があり、VOC 変異に敏感です (40)。 ただし、S728-1157 の CDR-H3 領域は、このクラスの他の抗体とは大きく異なり、その広範な活性の原因となっている可能性があります。 このエピトープにおける S728-1157 による広範な中和の構造基盤を理解するために、スパイク WT{ {31}}P-Mut7、C705 と C883 にプロトマー間ジスルフィド結合を有するスパイク WT-6P のバージョン、約 3.3 Å のグローバル解像度（補足図 4E）。 対称拡張、焦点を絞った分類、および精製方法を使用して、RBD-Fv 界面で約 4 Å の局所解像度を達成しました (補足図 4E および補足表 8)。 S728-1157 Fab の結晶構造は 3.1 Å の分解能で決定され、RBD-Fv 界面での原子モデルの構築に使用されました。 私たちの構造は、他の IGHV3-53/{{55} と同様に、S728-1157 が RBD-up 立体構造で RBS-A (またはクラス 1) エピトープに結合していることを確認しています (図 3B および補足図 4E)。 ｝ 抗体（図３Ｃ）。 S728-1157 によるアンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 結合部位の立体遮断は、SARS-CoV-2 に対するその高い中和能力を説明しています。 S728-1157 CDR-H1および-H2の32NY33モチーフおよび53SGGS56モチーフ(23)は、CC12.3とほぼ同じ方法でRBDと相互作用します(補足図4、BおよびC)。 ただし、CC12.3 の VH 98DF99 と比較して、S728-1157 CDR-H3 の VH 98DY99 は、RBD と疎水性相互作用と極性相互作用の両方を含むより広範な相互作用を形成し、これが VOC に対する広範な中和の原因となる可能性があります (図3D および補足表 6 および 7)。 S728- 1157 CDR-H3 のジグリシン VH 100GG101 も、CC12.3 の VH Y100 と比較してより広範な結合を促進する可能性があります。これはおそらく、CDR 先端の異なる立体構造をもたらすグリシン残基の柔軟性によるものと考えられます。 -H3 ループと 98DY99 での残基の相対シフト。

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Omicron VOC には RBD に広範な変異がありますが、結合は依然として観察されるため、これらの残基のほとんどは S728-1157 と相互作用しません (補足図 4A)。 スパイク WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 モデルから、Y505 から VL Q31、E484 から VH Y99 が水素結合を形成すると予測されます (補足図 4D および補足表 6) )、これらは Omicron の突然変異 Y505H および E484A によって破壊される可能性があります。 しかし、Y505H 変異は依然として VL Q31 との水素結合を可能にし、E484A 変異は疎水性残基 VL Y99、F456、および Y489 の近くに別の疎水性側鎖を追加します。 これらの接触は、S728-1157 がスパイク BA.1 抗原に対する中和活性を、たとえ減少したとはいえ保持できるようにするメカニズムの一部を説明する可能性があります (図 1G および図 2B)。 次に、BA.1 抗原は、スパイクタンパク質の立体構造を変化させる Omicron 変異に関連している可能性があります (34)。 ただし、S728-1157のいくつかの体細胞変異残基、つまりVH L27、L28、R31、F58、VL V28およびQ31は、SARS-CoV-2 RBDとの相互作用に関与しています（補足図1および補足表 7)。これも、CC12.3 と比較してその幅広い反応性に寄与している可能性があります。 全体として、私たちの構造研究は、SARS-CoV-2 VOC のほとんどの変異に対応できる S728-1157 の広範な中和の基礎を明らかにしました。

図 4. ハムスターにおける SARS-CoV-2 感染に対する bnAbs の保護効果。

S728-1157は、シリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2 BA.1 オミクロン、デルタ、およびWT SARS-CoV-2の複製を減少させます。 広範囲に中和する mAbs の防御効果を評価するために、SARS-CoV-2 に広く使用されているゴールデン シリアン ハムスター感染モデルを利用しました。 SARS CoV-2 ウイルス感染 1 日後に、ハムスターに 5 mg/kg のテスト mAb または無関係な抗原 (エボラウイルス糖タンパク質) を標的とするアイソタイプ コントロールを腹腔内注射により投与しました。 感染から 4 日後に肺および鼻の組織を収集しました (図 4A)。 S728-1157 の治療的投与により、感染ハムスターの鼻甲介と肺の両方で WT、BA.1 Omicron、および Delta 変異体の力価が減少しました（図 4、B ～ D）。 興味深いことに、肺における S728-1157 の効果は劇的で、WT および BA.1 オミクロンのウイルス量を約 104PFU 減少させ、BA.1 オミクロン変異体のウイルス力価は完全に消失しました (図 4C)。 in vitro 中和 (図 1G) とは対照的に、S451-1140 は肺および鼻甲介における BA.1 オミクロンのウイルス複製を減少させず、このクローンの in vitro 中和と in vivo 防御の間に断絶があることを示しています (図 4E)。 。 比較すると、S626-161の投与は、WTおよびBA.1攻撃後の肺ウイルス力価のわずかに有意な減少をもたらした(図4、F、およびG)。 これらのデータは、広範な保護性 mAb を正確に定義するには、中和活性と並行して保護効果を評価する必要があることを強調しています。 今後は、S728-1157 の保護能力がどの程度 Fc に依存するかを調べることが興味深いでしょう。 全体として、S728-1157 は、SARS CoV-2 変異体に対して広範な中和効果を備え、生体内で WT、デルタ、および BA.1 の複製を劇的に減少させることができる有望な mAb です。

SARS-CoV-2 感染では、強力な S728-1157 様の交差中和 mAbs が誘発されることはほとんどありません。 S728-1157 の交差中和と予防的可能性を考慮して、SARS-CoV-2 患者のポリクローナル応答において S728-1157 様抗体が一般的に誘導されるかどうかを評価しようとしました。 これを評価するために、回復期血清を使用して競合ELISAを実行し、S728-1157との結合について競合する可能性のある抗RBD抗体力価を検出しました（図5A）。 以前に定義したように、被験者は抗体反応の大きさに基づいて 3 つのグループに分けられました (15、16)。 高反応者および中等度反応者は、低反応者と比較して S728-1157 競合血清抗体の力価が高かったが (図 5B)、その力価はすべてのグループにわたって非常に低く、高レベルの S{{ WT SARS-CoV-2感染後のポリクローナル血清中の18}}様抗体。 S728-1157に加えて、S451- 1140、S626-161、LY-CoV555、REGN10933、CR3022、CC12.3を含む他のmAbと回復期血清の競合をテストしました。 S728-1157と同様に、ほとんどの回復期患者のポリクローナル血清において、S451-1140、S626-161、LY-CoV555、REGN10933、CC12.3と競合する抗体の力価が比較的低いことが観察されました。個体 (図 5、C ～ F および H)。 それにもかかわらず、高応答者は、低応答者よりも中和 mAb に対して著しく高い力価を示す傾向がありました (図 5、B ～ F および H)。 対照的に、CR3022 エピトープ部位を標的とする抗体は回復期の個人でより顕著であり、ポリクローナル血清中のクラス 4 RBD 抗体の濃縮を示唆しています (図 5G)。 特に、3 つの反応グループ間で CR3022 の力価に有意な差はなく、ほとんどの人で WT SARS-CoV-2 感染中に CR3022- 部位抗体が一貫して誘導されたことが示唆されました。 興味深いことに、CC12.3と比較して、高反応者の血清中でS728-1157は4-倍低いレベルで検出されました。 したがって、クラス 1 抗体は自然感染やワクチン接種によって頻繁に誘導されるにもかかわらず (14、20、28、29、41～43)、我々のデータは、このクラスのサブセットを表す S728～1157 様抗体は比較的まれであることを示唆しています。

さらに、回復期コホート血清における2P安定化スパイクと6P安定化スパイクに対する反応性の違いを調べました（図5、I〜K）。 3 つのレスポンダー グループすべてが、6P 安定化スパイク WT に対する抗スパイク反応性抗体を 2P 安定化スパイク WT よりも 6 ～ 11 倍高い程度にマウントしていることがわかりました (図 5J)。主要な抗原エピトープは、6P 安定化抗原上でより良好に表示または安定化されました。 同じサンプルを使用すると、高反応者と中等度反応者は、BA.1-2P に対する抗スパイク抗体の力価が BA.1-6P よりも 4 ～ 5 倍低かった (図 5K)。 注目すべきことに、低応答者は、WT-2P および 6P スパイクと比較して、スパイク BA.1 Omicron-2P および 6P に対する結合反応性の変化倍数が小さかった (2- 倍減少) ({ ｛２８｝倍減少）（図５、ＪおよびＫ）、これは、ＢＡ．１ Ｏミクロン反応性エピトープに対する血清抗体が、低反応性被験者においてより制限されている可能性を示唆している。 全体として、これらのデータは、WT ウイルスと Omicron ウイルスの両方について、6P 安定化スパイクへの自然感染によって誘導されるポリクローナル結合が向上していることを示唆しています。

S728–1157 様抗体は、ハイブリッド免疫の状況で最適に誘導されます。 現在の世界的な状況では、ワクチン接種なしのSARS-CoV-2の初感染は稀となっており、特定のワクチン接種/感染歴を持つ個人の間でSARS-CoV-2の免疫力が異なることがいくつかの研究で報告されている。 その結果、我々は次に、祖先型SARS-CoV-2単独によるWT感染を除いて、どの一般的な曝露が事前の有無にかかわらず、一価mRNAベースのワクチン接種者の血漿中にS728-1157様抗体を効果的に誘導するかを調査しようとした。感染。 私たちは、パンデミックの開始以来、医療従事者を長期的に追跡してきた、SARS-CoV-2に対する防御に関連した急速な免疫に関連した研究コホート(パリ)から必要な生体試料を入手しました(44)。 我々は、感染の有無に関わらず完全に免疫化された（ワクチン接種×2回）研究参加者、および感染の有無にかかわらず追加免疫された参加者（ワクチン接種×3回）から血漿サンプルを選択した。 さらに、二価 mRNA ワクチン (祖先 WA1/2020 プラス Omicron BA.5) を接種した研究参加者からのサンプルも含めました (図 6A および補足表 2)。 追加ワクチン接種を受けた参加者の画期的な感染は、ニューヨーク都市圏でオミクロン系統が他のすべてのSARS-CoV-2系統に取って代わられた時期に発生した。 我々は、2回ワクチン接種を受けた個体が、試験したサンプルの5つのグループの中でS728-1157競合血清抗体の力価が最も低いことを発見した(図6B)。 注目すべきことに、これらのレベルは、ワクチン接種を受けていない回復期コホートで観察されたレベルと同様でした（すべての反応者、図5B）。 比較すると、3回のワクチン接種のうち2回を接種した回復期の個人や、画期的な感染を経験し二価の追加免疫を受けた個人を含む、自然感染の既往歴のある個人は、非感染者と比較して有意に高いレベルのS728-1157誘発を示した。ただし、ワクチン接種を受けた人は対象外です (図 6B)。 非感染の 3- 用量グループは 2- 用量グループと比較して有意な増加のみを示しましたが、ワクチンの種類ごとのペアの内訳は、BNT162b2 と mRNA-1273 の相同な 3 回目の用量が S{{ 38}}様の中和抗体力価は、それぞれ2.72倍と2.85倍でした（図6、CおよびD）。 何らかの形でスパイクと合計3回接触した参加者のうち、回復期の2回ワクチン接種者のS728-1157-様抗体力価は、感染歴のない3回ワクチン接種者と比較して3倍高かったことから、SARS-CoV{{ 51}} 感染は、このクロノタイプをより最適に誘導します。 ハイブリッド免疫群の中で、二価追加免疫ワクチンの用量を受けたブレイクスルーを起こした追加免疫群の大多数は、回復期プレオミクロンワクチン接種群と比較してS728-1157抗体力価がわずかに高いだけであったことに注目し、これはS728-1157の抗体価が低いことを示唆している。 }} 力価は、3 回の曝露後にプラトーに近づいた可能性があります。 また、S728-1157 に加えて、CC12.3 および CR3022 と競合するポリクローナル抗体の力価も調査しました。 S728-1157-で観察されたものとは対照的に、すべての個体は、曝露の数や種類に関係なく、比較的高い力価のCC12.{60}}およびCR{61}}様抗体を示しました（補足図5）。抗体のような。 全体として、これらのデータは、SARS-CoV-2感染とmRNAワクチン接種の両方がS728-1157-様抗体の誘導に寄与し、ワクチン接種を受けた個体では感染がより支配的な役割を果たしているということを示しています。

カンクサ-免疫システムを改善する

最後に、mRNA ワクチン接種コホートにおける 2P 安定化スパイクと 6P 安定化スパイクに対する反応を比較すると、ほとんどのグループが両方の構築物に対して同様のレベルの抗体を誘発することがわかりました。 この例外は、未感染の３回ワクチン接種グループであり、６Ｐ安定化スパイクと比較して、統計的にはわずかに増加しただけではあるが、２Ｐに対する反応性が高いことを示した（図６Ｅ）。 これらのデータは、自然感染（図 5、J、K）とは対照的に、ワクチン接種単独では、Spike-2P 構築物内のエピトープにさらに限定されたポリクローナル応答を生成することを示唆しています。これは、Spike{{12} }}現在のワクチンの P 製剤。 最終的に、これらの発見は、将来の SARS-CoV-2 ワクチンの 6P 安定化が、S728-1157 のような広範な防御抗体クロノタイプの誘導に大きな利益をもたらす可能性があるという考えを裏付けています。

図 5. 広範囲に中和する RBD 反応性 mAb との回復期血清抗体競合、および 6P 安定化スパイクと 2P 安定化スパイクに対する血清抗体応答の比較

図 6. S728-1157 中和 RBD 反応性 mAb との mRNA ワクチン接種血清抗体競合、および 6P 安定化スパイクと 2P 安定化スパイクに対する血清抗体応答の比較。

議論

この研究では、新型コロナウイルス-19パンデミックの初期波中にSARS-CoV-2感染から回復した個人の記憶B細胞から単離された強力なbnAbを特定しました。 この bnAb、S728- 1157 は、実質的な結合反応性を維持し、Omicron BA.1、BA.2、BA.2.75、BL.1 ( BA.2.75+R346T)、BA.4、BA.5、および XBB は、ハムスターにおける Delta および BA.1 感染後の感染ウイルス力価を大幅に低下させることができました。

私たちのコホートからの回復期血清には、S728-1157 (クラス 1/RBS-A 抗体) およびクラス 2 エピトープ mAb と競合する抗体が低濃度で含まれていることがわかりました。 これは、S728-1157がクラス1エピトープを標的とする他​​の抗体とはやや独特であり、RBD特異的メモリーB細胞プールではまれに誘導されることを示唆しています。 その代わりに、我々の自然感染コホートは、CR3022 (クラス 4) エピトープを標的とする抗体を誘導するようでした。 この特異性を持つ抗体は多くの場合交差反応性がありますが、RBS を標的とする抗体ほど中和力は低くなります (14、17)。 これらのデータは、回復期血清中の豊富なクラス 3/S309 抗体がアルファおよびガンマ変異体に対する中和活性に寄与する可能性がある一方、クラス 2 抗体の欠如がデルタに対する中和能力の低下の原因となる可能性があることを示す、我々の以前の発見を補完するものである(15)。 。 それにもかかわらず、これらの RBS を標的とする抗体のほとんど (RBS-A/クラス 1、RBS-B、C/クラス 2、および RBS-D、S309/クラス 3) の Omicron 変異体に対する活性の範囲は非常に限られていると報告されています。 (11、40、45)。

今後の主な課題は、保存された RBS エピトープに対する広範な交差反応性抗体の誘発を改善する方法を決定することです。 これに関して、私たちはここで、ハイブリッド免疫を持つ個体は、感染歴のないワクチン接種を受けた個体に比べて、S 様抗体の力価が著しく高いことを観察しました。{0} 重要なことに、この現象は、曝露回数が制御されている場合（つまり、回復期の二回ワクチン接種者と未感染の三回ワクチン接種者）でも観察され、感染に関連する免疫（またはこのタイプの免疫を模倣できるワクチン製剤）の何らかの要素が影響していることを示唆しています。はこのクロノタイプの誘発にとって重要です。 これは、ハイブリッド免疫を持つ個人は、ワクチン接種または一次感染によって誘導される免疫応答のみを持つ個人と比較して、より広範な抗体反応性プロファイルを有することを証明する実験的証拠と一致しています(9)。

本明細書の構造は、S728-1157がアップコンフォメーションRBD内のRBS-A/クラス1エピトープに結合することを示した。 このエピトープは、1 つ (30、33、46、47) のみを提示する 2P スパイクと比較して、アップステートに 2 つの RBD を提示すると報告されている 6P 安定化スパイクでより容易にアクセスできるようです。アップコンフォメーションスパイクに特異的なものは、結合の向上を示します。 S728-1157は自然感染後に分離されました。 このような状況では、RBD が一時的であってもアップ構造をとって ACE2 に結合し、それによってこのエピトープを露出できなければならないことを考えると、S728-1157 様クローンを誘導する確率はより高くなる可能性があります。 大多数の IGHV3-53/3-66 RBS-A/クラス 1 抗体とは異なり、S728-1157 は、CDR-H3 と RBD 間の広範な相互作用を利用して、VOC スパイクの主要な変異に対応できます (29, 48–50）。 S728-1157 は、CC12.3 (IGKV3-20) などの他のそれほど広範ではない抗体と比較して、異なる軽鎖 (IGLV3-9) も使用しており、これが全体的な結合相互作用に影響を与える可能性があります。 ただし、我々の分析では、CC12.3と比較してS728-1157軽鎖とRBDの間の水素結合が少ないことが示されています（補足表7）。 この相互作用における VOC 交差反応性に重要な CDR-H3 接触残基のほとんどは生殖系列にコードされており、体細胞変異によって導入されるものではありませんが、フレームワーク領域または CDR-H1、CDR-H2、および CDR-L1 内のいくつかの体細胞変異残基は、 SARS-CoV-2 RBDとの相互作用に関与しています。 一方では、これは、IGHV3-53/66 クラス抗体をコードするメモリー B 細胞が、さらなる親和性成熟によって同程度の交差反応性を獲得する可能性があることを示唆しています。 一方、これは、S728-1157-様のナイーブB細胞を標的とする生殖細胞系列を標的とした免疫原を設計できる可能性も示している。 VOC 変異を克服できる選択された CDR-H3 を含む S728-1157 様抗体を特異的に誘発できるワクチンを設計することは困難かもしれませんが、他の強力な SARS-CoV{ {58}} 中和 mAbs 研究 (13、15、20–27)。 あるいは、他の病原体について以前に報告されているように、最適化された RBD 免疫原による反復免疫化によっても実現可能である可能性があります (51-55)。

RBS-A/クラス 1 抗原部位 (18) では多くの変異が観察されていますが、S728-1157 エピトープに関しては、全 RBD 接触残基 15 個のうち 13 個と CDR-H{{9} の 3 個のうち 2 個が変異しています。 }結合された RBD 接触残基は、Omicron および他のすべての VOC 内で保存されます。 これは、S728-1157 エピトープが見つかる RBD 領域には、その動的機能とウイルス適合性に重要な残基が含まれている可能性があり、したがって周囲の RBS-A/クラス 1 部位残基よりも変異や抗原ドリフトに対する耐性が低いことを示唆しています。 これが事実であれば、ウイルス変異体の進化に伴ってこの特定のエピトープが失われる傾向は減少するはずであり、S728-1157および類似の抗体およびエピトープの特性評価が変異体耐性ワクチンまたはmAb治療法の開発にとって重要となる。 要約すると、私たちの研究は、次世代の変異耐性コロナウイルスワクチンの免疫原設計に役立つ可能性がある、または SARS CoV-2 の進化に耐性のある mAb 治療薬として機能する可能性のある bnAb を特定しました。 特に、効力と幅の広さの組み合わせの点で、S728-1157 は現在までに単離されたクラス最高の抗体であると思われます。 この抗体が 6P 安定化により容易に結合することを考えると、6P 安定化された組換えスパイクタンパク質またはウイルス全体によって優先的に誘導されると予測され、これはヘキサプロリン修飾が将来の SARS-CoV から最適に防御するために将来のワクチン構築に利益をもたらす可能性があることを示唆しています。 -2 変異体およびその他のアルボウイルス。

カンクサ-免疫システムを改善する

メソッド

モノクローナル抗体の分離。 PBMC は白血球除去フィルターから分離され、以前に記載されているように凍結されました (24)。 B細胞はFACSを介してPBMCから濃縮されました。 細胞は、CD19、CD3、およびオリゴフルオロフォアに結合した抗原プローブで染色されました。 対象の細胞は CD3-CD19+ 抗原 + として同定されました。 すべての mAb は、以前に記載されているように (15、24)、単一細胞 RNA-Seq を通じて同定されたオリゴタグ付き抗原ベイト選別細胞から生成されました。 この研究で生成された単一 B 細胞データは、Gene Expression Omnibus: GSE171703 および GSM5231088–GSM5231123 に寄託されました。

JMP Pro 15 によって分析された抗原プローブ強度に基づいて mAbs を生成するために、抗原特異的 B 細胞が選択されました。抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は Integrated DNA Technologies (IDT) によって合成され、ヒト IgG1 およびヒト κ または λ 軽鎖にクローン化されました。以前に記載されているように、Gibson アセンブリによる発現ベクター (56)。 対応する mAb の重鎖と軽鎖を HEK293T 細胞 (ATCC) に一時的に同時トランスフェクトしました。 18時間のトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞にタンパク質を含まないハイブリドーマ培地上清(PFHM-II、Gibco)を補充した。 分泌された mAb を含む上清を 4 日目に採取し、以前に詳述したようにプロテイン A アガロース ビーズ (Thermo Fisher Scientific) を使用して精製しました (56)。 十分に特徴づけられた抗体の重鎖および軽鎖の配列は、タンパク質データバンク (PDB)、LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG)、CR3022 (PDB ID: 6W7Y)、および REGN1{{ １２５｝９３３（ＰＤＢ ＩＤ：６ＸＤＧ）であり、上記のように合成した。 CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) は、スクリップス研究所 (米国カリフォルニア州サンディエゴ) の Meng Yuan によって提供されました。 組換えスパイクタンパク質の発現。 組換え D614G SARS-CoV-2 全長 (FL) スパイク、BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P、XBB-6P、WT RBD、単一 RBD 変異体（R346S、K417N、K417T、G446V、L452R、S477N、F486A、F486Y、N487Q、Y489F、Q493A、Q493N、N501Y、 Y505A、および Y505F）、組み合わせ RBD 変異体（K417N/E484K/L452R/NN501Y）、SARS-CoV-1 RBD、および MERS-CoV RBD は社内で生成されました。 簡単に言うと、組換え抗原は、Expi293F 細胞 (Thermo Fisher Scientific) を使用して発現されました。 目的の遺伝子を哺乳動物発現ベクター (社内で改変した AbVec) にクローン化し、製造業者のプロトコールに従って ExpiFectamine 293 キット (Thermo Fisher Scientific) を使用してトランスフェクトしました。 トランスフェクション後4日目に上清を回収し、Ni-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)アガロース(Qiagen)とともにインキュベートした。 精製は、以前に記載されているように、重力流カラムを使用して実行され、イミダゾール含有緩衝液で溶出されました(57、58)。 溶出液を緩衝化し、Amicon遠心ユニット(Millipore)を使用してPBSと交換した。 組換え FL スパイクは、バリアント B.1.1.7 アルファ、B.1.351 ベータ、P.1 ガンマ、B.1.617.2 デルタ、BA.1、BA.2、および BA.4 オミクロンの 2P 変異によって安定化され、シアトル児童研究所のサザー研究所で製造されました。 K417V、N439K、E484K RBD、および組換え FL スパイク WT-2P および 6P は、マウントサイナイにあるアイカーン医科大学のクラマー研究室で製造されました。 SARS-CoV-2-6P-Mut7 およびスパイク BA.1-6P は、以前の研究で説明されているように設計および製造されました (59)。 各抗原のタンパク質配列とリソースを補足表 4 に示します。ELISA。 組換えSARS-CoV-2スパイク/RBDタンパク質を、50μL/ウェルのPBS中2μg/mLで高タンパク質結合マイクロタイタープレート(Costar)上にコーティングし、4℃で一晩保存した。 プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄し、２０％ ＦＢＳを含む１５０μＬのＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。 モノクローナル抗体を PBS で 10 ug/mL から始めて 1 倍に連続希釈し、ウェル内で 37 度で 1 時間インキュベートしました。 次いで、プレートを洗浄し、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098)、1:1、000)とともに37℃で1時間インキュベートした。 洗浄後、100μLのSuper AquaBlue ELISA基質(eBioscience)をウェルごとに添加した。 吸光度は、マイクロプレート分光光度計(Bio-Rad)で405nmで測定した。 アッセイは、すべてのプレートで既知の結合特性を持つコントロール抗体 S144-509 (15) を使用して標準化され、コントロールの吸光度が OD 3.0 に達するまでプレートを展開しました。 すべての mAb は 2 回ずつテストされ、各実験は 2 回実行されました。

血清ELISA。 高タンパク質結合マイクロタイタープレートを、PBS中の2μg/mLの組換えSARS-CoV-2スパイク抗原で4℃で一晩コーティングした。 プレートをPBS 0.05% Tweenで洗浄し、200 μL PBS 0.1% Tween + 3%でブロックした脱脂粉乳を室温 (RT) で 1 時間放置します。 血漿サンプルは、血清学実験を行う前に 56 度で 1 時間加熱不活化されました。 血漿を、PBS 0.1% Tween + 1% 脱脂粉乳で 2- 倍に連続希釈しました。 プレートを血清希釈液とともに室温で２時間インキュベートした。 抗体の結合を検出するために、PBS 0.1% Tween + 1% 脱脂粉乳で 1:3 に希釈した HRP 結合ヤギ抗ヒト Ig 二次抗体 000 を使用しました。 １時間のインキュベーション後、プレートを１００μＬのＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間発色させた。 次に、50μLの3M HClを使用して発色反応を停止させた。 吸光度は、マイクロプレート分光光度計(Bio-Rad)で490nmで測定した。 エンドポイント力価は、各サンプルのシグモイド 4PL (x は対数濃度) 標準曲線から外挿されました。 検出限界 (LOD) は、SARS-CoV 以前の個人からの血漿を使用して記録された OD シグナルの平均 + 3 SD として定義されます-2。 すべての計算は、GraphPad Prism ソフトウェア (バージョン 9.0) で実行されました。

競合ELISA。 RBD 反応性 mAb の標的エピトープ分類を決定するために、競合 mAb として既知のエピトープ結合特性を持つ他の mAb を使用して競合 ELISA を実行しました。 競合他社の mAb は、EZ-Link スルホ-NHS-ビオチン (Thermo Fisher Scientific) を使用して室温で 2 時間ビオチン化されました。 ビオチン化 mAb の過剰なビオチンは、7k 分子量カットオフ (MWCO) Zeba スピン脱塩カラム (Thermo Fisher Scientific) を使用して除去されました。 プレートを２μｇ／ｍＬのＲＢＤ抗原で一晩４℃でコーティングした。 プレートを PBS-20% FBS で RT で 2 時間ブロックし、未決定クラスの mAb または血清の 2- 倍希釈を 20 から添加しました。 μg/mLのmAbおよび血清の1:10希釈。 抗体を室温で 2 時間インキュベートした後、ビオチン化競合 mAb をその解離定数 (KD) の 2 倍の濃度で添加し、先に添加した mAb または血清と一緒に室温でさらに 2 時間インキュベートしました。 プレートを洗浄し、1:1、000の希釈率で100μLのHRP結合ストレプトアビジン(Southern Biotech)とともに37℃で1時間インキュベートした。 プレートは、Super AquaBlue ELISA 基質 (eBioscience) を使用して開発されました。 アッセイを正規化するために、競合するビオチン化 mAb を、競合する mAb または血清を含まないウェルに対照として添加しました。 コントロールウェルの吸光度が OD 1.0 ～ 1.5 に達したときにデータが記録されました。 次に、サンプルの観察された OD を陽性対照によって達成された OD で割り、この値を 1 から引いて 100 を掛けることによって、mAb 間の競合パーセントを計算しました。 血清の場合、OD は log10 変換され、非線形回帰によって分析されて 50 を決定しました。 GraphPad Prism ソフトウェア (バージョン 9.0) を使用した % 阻害濃度 (IC50) 値。 データを Log1P に変換し、目的の競合 mAb との 50% の競合を達成できる血清希釈の IC50 の逆数を表すグラフにプロットしました。 すべての mAb は二重にテストされ、各実験は独立して 2 回実行され、2 つの独立した実験からの値が平均されました。

プラークアッセイ。 プラークアッセイは、Vero E6/TMPRSS2 細胞（日本研究生物資源コレクション（JCRB））上の SARS-CoV-2 変異ウイルスを用いて実行されました（補足表 5）。 細胞を90%のコンフルエンシーに達するまで培養した後、トリプシン処理し、96-ウェルプレートに3×104細胞/ウェルの密度で播種しました。 翌日、102 PFU の SARS-CoV-2 変異体を、2- 倍希釈した mAb と 1 時間インキュベートしました。 抗体とウイルスの混合物を、Vero E6/TMPRSS2 細胞とともに 37 度で 3 日間インキュベートしました。 プレートを20%メタノールで固定し、次にクリスタルバイオレット溶液で染色した。 完全阻害濃度 (IC99) は、GraphPad Prism (バージョン 9.0) で実行された対数 (阻害剤) 対正規化応答 (可変勾配) を使用して計算されました。 すべての mAb は 2 回ずつテストされ、各実験は 2 回実行されました。 焦点低減中和テスト。 焦点低減中和試験（FRNT）は、プラークアッセイとは別に追加のプラットフォームとして中和活性を決定するために使用されました。 最終濃度 1:20 から開始する血清の段階希釈物を、ウェルあたり 103 病巣形成単位のウイルスと混合し、37 度で 1 時間インキュベートしました。 プールしたパンデミック前の血清サンプルを対照として使用しました。 抗体ウイルス混合物を、96-ウェルプレート内のVero E6/TMPRSS2細胞(JCRB)に接種し、37℃で1時間インキュベートした。 等量のメチルセルロース溶液を各ウェルに添加した。 細胞を 37 度で 16 時間インキュベートし、ホルマリンで固定しました。 ホルマリンを除去した後、細胞を SARS-CoV-1/2 核タンパク質 [クローン 1C7C7 (Sigma-Aldrich)] に対するマウス mAb で免疫染色し、続いて HRP 標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン (Sigma-Aldrich) で免疫染色しました。アルドリッチ; A8924)。 感染細胞をTrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences)で染色し、蒸留水で洗浄した。 乾燥後、ImmunoSpot S6 Analyzer、ImmunoCapture ソフトウェア、および BioSpot ソフトウェア (Cellular Technology) を使用して焦点番号を定量化しました。 IC50 は、GraphPad Prism (バージョン 9.0) で実行された可変勾配 (4 パラメーター) 非線形回帰を使用して、対数 (阻害剤) 対正規化応答からの内挿値から計算されました。

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