exvivoでの機械灌流中の制御された高熱による腎温存/再灌流傷害の軽減
Mar 29, 2022
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Thomas Minor1、*、†およびCharlotte vonHorn1、†
前のドナー移植片の単離されたexvivo機械灌流中の制御された短時間の熱ショック治療の可能な腎保護効果再灌流一次invitro試験で調査する必要があります。豚腎臓（n=14）は、ドナーの心臓停止の20分後に取得され、ウィスコンシン大学のソリューションで20時間の静的冷蔵にさらされました。 先立って再灌流, 腎臓35度まで灌流温度を徐々に上昇させながら、2時間のリコンディショニングマシン灌流にさらされました。 の半分で腎臓（n=7）、短時間の温熱インパルス（42度で10分間の灌流）が機械灌流期間に実装されました。 移植片の機能回復は、インビトロでの正常体温再灌流時に観察された。 温熱治療は、熱ショックタンパク質（HSP）70およびHSP 27 mRNAの50％の増加をもたらし、コントロールと比較して、再灌流時のナトリウムおよびグルコースの尿細管再吸収の約50％の改善を伴いました。 さらに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの腎喪失は、アルブミンとクレアチニンの比率で評価した尿タンパク質喪失と同様に、対照の3分の1に有意に減少しました。 エクスビボ熱ショック治療は、腎自己防衛機構を強化するための容易に実施可能で有望な選択肢であるように思われると結論付けられる。再灌流けが保存後、前臨床モデルでさらに調査する価値があります。
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研究のハイライト
トピックに関する現在の知識は何ですか？
✔局所組織での熱ショックタンパク質（HSP）の誘導は、環境ストレスに応答するよく知られた防御メカニズムです。 これらの分子シャペロンのアップレギュレーションは、修復メカニズムとその後の細胞に対する耐性を誘導しますけが。 臨床肝臓移植は、虚血/再灌流に対する感受性が強化された拡張基準ドナー臓器の使用にますます依存しています。けが。 辺縁臓器移植片のexvivo機械灌流は、移植片への特権的なアクセスと、組織の連続的な悪化に好影響を与える熱ショック応答を引き起こし、信号経路を解き放つために、孤立した臓器に温熱刺激を簡単かつ制御して適用するための新しい視点を提供します怪我と改善腎臓移植後の回復。
この研究のアドレスはどのような質問でしたか？
✔exvivo移植前の短時間の温熱刺激の潜在的な保護効果を調べます肝臓灌流虚血後の機能的転帰について再灌流.
この研究は私たちの知識に何を追加しますか？
✔この研究は、exvivo腎機械灌流中の温熱治療がわずかに保存された機能的結果の改善のための可能な新規ツールとして機能することを示すいくつかの兆候を示しています腎臓虚血後の再灌流時。 データは、細胞破壊の減少と移植後の尿細管腎機能の改善におけるHSPの関連する役割を裏付けています。
これが臨床薬をどのように変える可能性があるか
OGYまたはトランスレーショナルサイエンス？
✔確立された正常体温の機械灌流プロトコルに簡単に制御された高熱を追加することは、臨床応用のための簡単に実装可能な方法であり、移植後の臓器回復の改善に貢献する可能性があります。
臨床的腎移植は、回収前に損傷を受けているか、最適とは言えない可能性が高い拡張基準ドナー臓器の使用にますます依存しています。
品質。 虚血性保存時に有害なトリガーに対する感受性が高まる臓器の割合が増加するとともに、1,2組織の変化
虚血/再灌流傷害に関連することは、再灌流時に細胞機能障害を引き起こす腎移植における成長する主要な問題を表しています。
細胞シャペロンの誘導と保護シグナル表現型の誘発（例えば、亜臨界熱ストレスによる）は、後のストレス状況に関連する組織の変化を減らし、組織の恒常性に挑戦するためのよく知られたメカニズムです。
辺縁ドナー移植片の虚血性冷蔵の代替または補助としての隔離された機械灌流の出現は、熱ショック応答を引き起こし、信号を解き放つために、隔離された臓器への温熱チャレンジの容易かつ制御された適用のための新しい展望を開いた組織損傷の連続的な悪化に好影響を与え、移植後の腎回復を改善する経路。
熱ショック応答のプレコンディショニング効果は、細胞抵抗性の一時的な超正常な増加5に関連しているだけでなく、二次的な細胞修復メカニズムの強化を介して機能することが実験的に証明されています6。熱ショックタンパク質（HSP）は、組織への最初の傷害がすでに起こった後、早期に誘発された場合でも保護を与える可能性があります。
隔離された臓器への特権的なアクセスは、全身の加熱のための厄介な要件を排除し、ドナーまたはレシピエントの生物に有害な副作用をもたらします。
したがって、この研究は、虚血後の再灌流時にわずかに保存された腎臓の機能的転帰を改善するための可能な新規ツールとして機能する、exvivo腎機械灌流中の温熱治療の主要な証拠を精査するパイロット調査として意図されました。
方法
すべての実験は、死んだ雌のドイツランドレース豚（年齢：10〜12週、体重：25および30 kg）から回収された腎臓で実施されました。 動物の保護と実験動物の世話の原則に関する連邦法（国立衛生研究所（NIH）の出版物番号85-23、1985年改訂）に従った。 動物は規則に従い、地方自治体の承認後に扱われた。
循環停止の20分後に腎臓を取り出し、ウィスコンシン大学の冷たい（4度）溶液で100cmの重力でバックテーブル上で流出液が透明になるまで洗い流した。 ヘパリンはいつでも与えられませんでした。
その後、移植片はウィスコンシン大学の溶液で満たされたビーカーに18時間保管され、温度はクライオサーモスタットによって4度に調整されました。
次に、対照群では、腎臓に、40 g/Lのウシ血清アルブミンを添加したAqixRSI溶液を用いた酸素化（95％O2; 5％CO2）正常体温マシン灌流を2時間受けました。 以前に提案されたように、8,9灌流は低体温で開始され、プログラム可能な循環クライオサーモスタットによって制御され、最初の60分以内に35度まで段階的に増加しました。
実験群では、短期間の制御された高熱（CH）が孤立した灌流に含まれていました
臓器移植片のexvivo熱ショック治療マイナーおよびフォンホーンプロトコル。 35度に達した後、灌流液の温度を一時的にさらに43度まで10分間上昇させ（図1）、残りの2-時間は35度で灌流を継続しました。 温度上昇の時間と高さは、一貫した効果を得ることを目的とした先行する増分スクリーニング実験から導き出されました。
3つの実験では、組織内の酸素分圧は、温度補償された光ファイバー酸素計（Microx 4、PreSens精密センシング、ドイツ、レーゲンスバーグ）に接続されたマイクロファイバー針型光学酸素センサーを使用して制御されました。サーミスタプローブを使用して、対応する温度を記録しました。
灌流の温熱期間中であっても適切な組織酸素化を記録するために、針を腎臓の内側皮質領域に配置した。
孤立した腎臓再灌流モデル
保存/再灌流傷害からの腎回復は、前述のように、確立されたinvitro再灌流モデルを使用して評価されました。
手短に言えば、腎臓は、機械の再調整期間の終わりに生理食塩水100 mLでコールドフラッシュされ、その後、生体内での外科的移植中の2番目の温虚血期間をシミュレートするために室温で20分間維持されました。 この時間は、再灌流時に尿を収集できるように、大きなチューブで尿管にカニューレを挿入するためにも使用されました。
腎臓をサーモスタット制御されたプレキシガラスチャンバーに入れ、平均脈動圧90mmHgで腎動脈を介して灌流した。 静脈流出液はリザーバーに自由に排出されました。 灌流液の酸素化は、熱制御された中空糸人工肺を使用して、95パーセントのO2/5パーセントのCO2で実行されました。 動脈圧は、動脈灌流カニューレに接続された圧力トランスデューサーと組み合わせたサーボ制御ローラーポンプによって維持されました。 尿は、リザーバーの外側に誘導された尿管に挿入されたPEチューブから収集されました。 収集された尿100mLごとにろ過され、順番にリザーバーに再注入されました
図1腎臓それぞれの灌流液温度（実線）に関連したexvivo機械灌流中の皮質組織pO2（点線）。
灌流液の電解質組成を一定に保つため。
分析手順
グルコースおよび電解質の酸素分圧および灌流液濃度を、pH-血液ガス分析器（ABL 815flex酸塩基実験室、ラジオメーター、コペンハーゲン）で測定した。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の酵素活性とクレアチニンの濃度は、Reflotron Plusポイントオブケアユニット（Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ）での反射測光によって日常的に測定されました。
腎臓クリアランスは、尿中クレアチニン×尿流/灌流液クレアチニンとしてそれぞれの間隔で計算されました。
実験終了時の尿画分のアルブミン濃度は、大学病院の実験室センターでブロモクレゾールグリーンを用いた色素結合アッセイを使用して測光的に測定され、タンパク質の量は、尿中アルブミンとしてのクレアチニンの対応する濃度に対して正規化されました。クレアチニン比。
ナトリウムのろ過負荷（FL Na）は次のように計算されました。
FL=GFR×Na
FRNa =（FLNa − Na（尿）×尿流）∕ FLNa
それに応じて、濾過された負荷およびグルコースの部分的再吸収が計算された。
逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応
全RNAは、外皮質からの急速凍結組織サンプルから分離され、前述のように分析されました。
ベースライン値は、生体から採取された組織サンプルから計算されました腎臓exvivo。 結果は、ΔΔCt法を使用して定量化されました。 標的遺伝子は、内部標準としてグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼに正規化されました。 フォールド遺伝子発現値は、ベースライン値に対して正規化されたように、個々のサンプルごとに計算されました。
以下のプライマー（Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツから購入）を研究に使用しました：グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（番号PPS00192A）、HSP72（番号PPS00074A）、HSP27（番号PPS01262）、およびHO { {6}}（番号PPS01191A）。
ウエスタンブロット法
タンパク質イムノブロッティングは、外側の全細胞ライセートから実施しました腎臓前述のように、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびニトロセルロースメンブレンへの電気泳動転写による皮質。8ポンソーSで染色を行い、タンパク質のローディングと転写の均一性を確認しました。
一次抗体とのインキュベーションは、4度（ウサギ抗リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK、Thermo Fisher、＃MA 5-15174-1：500）または抗HSP 72（StressMarq Bioscience、＃SCM）で一晩行いました。 -100 — 1：300）。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（1：1、000）と室温で1時間インキュベートした後、C-DigitBlotを使用した化学発光の増強によりタンパク質を検出しました。スキャナー（Li-COR）。
タンパク質含有量の定量化は、UN-SCAN-ITゲルバージョン6.1（Silk Scientific、Orem UT）を使用して、総ERK（Thermo Fisher、＃MA 5-15174）またはβ-アクチン（Thermo Fisher 、＃PA 1-46296）。
統計学
すべての値は、グループあたりn個の{{0}}動物の平均±SDとして表され、グループ間の差異は、特に明記されていない限り、不等分散に対するウェルチの補正を使用した対応のない両側t検定によってテストされました。 統計的有意性はP<>
結果
機械灌流
機械灌流移植片の制御された酸素化再加温中に、一時的な温熱療法により、目に見える一時的な低下が起こりました。腎臓皮質組織pO2（図1）は、それでも常に200 mmHgを超えたままであり、したがって、30〜50mmHgであると報告されている正常体温灌流中の生理学的要件に明確に準拠していました11,12。
腎臓循環灌流液へのASTの放出は、温熱療法群では対照条件下よりもわずかに低かった（19.8±12.1対33.3±25.9 U / L; CH対対照、有意ではない）。
exvivo機械灌流中の一過性温熱療法の分子読み出し
保存と再灌流は、ヘモキシゲナーゼ1、HSP 27のmRNA転写物の〜2-倍、8-倍、さらには100-倍の増加を伴う対照条件下でもHSPの顕著な誘導をもたらします。 、およびHSP 72、それぞれ。
それにもかかわらず、機械灌流中の制御された一過性温熱療法は、すべての場合において、遺伝子誘導のこの増加を効果的に約50パーセント増強した。 この効果は、HSP27およびHSP72で非常に有意であることがわかりましたが、ヘムオキシゲナーゼ1の誘導に関して統計的有意性は証明できませんでした（図2）。
ERKのリン酸化は、HSP72.13の発現を促進する可能性のある高速で応答性の高い保護シグナルイベントを表します。
これは、タンパク質レベルでの熱ストレスの初期の影響として調査されました。 ウエスタンブロット分析により、機械灌流中の一過性温熱療法は、対照群と比較した場合、組織内のERKリン酸化の量を有意に増強することが明らかになりました（図3）。 これに対応して、HSP 72のタンパク質発現は、機械灌流中の制御された高熱後、コントロール値を超えて有意に上昇することもわかりました。
一過性温熱療法が改善する腎臓保存後の回復
再灌流中の灌流液の流れは平均300〜400 mL /分で、2つの間に差はありませんでした。
グループ。 尿産生も両方のグループで類似しており、897±354対601±280 mL / 90分（対照対CH）でした。
腎臓ASTの放出は、全体的な細胞傷害のパラメーターとして採用され、再灌流中に追跡されました（図4）。 温熱治療は、再灌流の開始時に最初はより低い値をもたらし、進行中の灌流中の進行性の上昇をさらに軽減したことが見られる。
腎臓尿細管細胞の機能は、限外濾過液からのナトリウムとグルコースの再吸収の分析によって評価されました（図5）。 からの部分的な再吸収率が腎臓、以前は機械灌流中に制御された温熱療法を受けていましたが、対照群のそれを約40パーセント大幅に上回りました。
その制御の可能性を排除するために腎臓限外ろ過液中のナトリウムまたはグルコースの絶対的な高負荷で充電された可能性があるため、両方の物質の合計ろ過負荷も決定しましたが、FLNaが2.7±{{3 }}。7および2.5±0。8ミリモル/分およびFLgluは24.8±12.1および28.6±9.4mg/分（それぞれコントロール対CH）。
糸球体濾過率も両方のグループであいまいでした。 クレアチニンのクリアランス値は、{{0}}。25±0。0対照群では6 mL / g /分、0.24±0.08 mL /g/分でした。 CHの後。
対照的に、尿中タンパク質の漏出は、腎臓CHを受けたもの（図6）。
討論
エクスビボでの機械灌流の使用は、臓器移植前の移植片保存の管理における進化する傾向を表している。
過去10年間で、低体温機灌流は、単純な静的冷蔵と比較して優れた保存方法として確立され14,15、より高いリスクの保存および拡張された基準臓器で人気がありました14–16。
体外期間中の血管系の脈動刺激17および酸素18の存在は、維持することが示された。腎臓恒常性と改善機能的移植後の転帰。
最近の技術的進歩は、代謝恒常性の改善された維持と保存された移植片を評価するためのより本格的な機会によってより高い支出を補う低体温灌流技術のより生理学的な代替として、正常体温機械灌流への新しい傾向を促進しました移植前。19,20
これを超えて、正常体温の機械灌流は、前の回収/保存損傷の結果を軽減すること、または移植時の2回目の温虚血および再灌流後の再灌流損傷に対する事前調整を目的としたコンディショニング目的に役立つ可能性のある孤立した臓器への治療的介入のための理想的なプラットフォームを表します。
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治療アプローチとしての熱ショック治療は、腎臓の非常に効果的な保護メカニズムを促進し、タンパク質の構造と細胞の完全性を安定させることにより、特定の傷害に対する耐性を誘発することがわかった。 この効果は主に、腎臓で構成的に発現され、さまざまなストレス状態に応じて高度にアップレギュレーションされる可能性がある特定のHSPの合成に基づいています。
この研究は、単離された腎臓灌流中の短時間の温熱チャレンジが、転写前およびタンパク質レベルで証明されるように、分子熱ショック反応を効果的に誘発し、ERK経路を介した生存シグナル伝達を活性化することを示しています。 それにより、記載された手順は、追加の酸素担体なしの孤立した灌流にもかかわらず、明らかな組織低酸素症とは関連していなかった。
HSPの誘導は1時間以内に開始する可能性があり21、HSP 72の発現は3時間後にすでに多数に増加することが以前に確立されています22。HSP70は、高熱ストレスに反応する最も顕著なシャペロンであり、極めて重要な役割を果たします。細胞の自己防衛機構の増強による組織保護における役割。5
HSP 72は、タンパク質の誤った折り畳みを防ぎ5、損傷したタンパク質の除去を促進し6、タンパク質のリフォールディングと修復に関与します。 denovo合成よりもはるかに安価な細胞修復プロセスをサポートします。 したがって、HSP 72は、細胞傷害後の再灌流時の重大な状況での代謝の必要性を減らし21、それによって細胞の回復侮辱から。
リソソーム膜の安定化23は、酸性加水分解酵素による細胞傷害と細胞死の連続的な誘導を低減します。 分子レベルでは、以前の研究では、HSP72がMEK/ Erk経路を活性化し、関連する保護効果がRaf、MEK、およびErkのリン酸化と細胞の生存に関連していることが示されています24,25。一般的な細胞損傷のパラメーターとして採用されたASTの全体的な放出の減少。 さらに、進行中の再灌流中のASTの進行性の上昇も、治療によって著しく弱められました。
これに伴い、大幅な緩和が行われました腎機能障害管状細胞の再吸収能力は、対照値よりも約50パーセント増加することがわかったため。
HSP 27は低分子量HSPであり、腎臓の保護熱ショック応答においても重要な役割を果たしていることがわかっています4。ラット尿細管細胞に関する研究では、近位尿細管細胞へのHSP27の蓄積が生存率の向上と関連していることが示されています。再生.26
現在のパイロット研究の結果に基づいて、ex vivo機械灌流プロトコルへの簡単な温熱チャレンジの実装は、細胞の自己防衛の強化によって再灌流傷害に対する回復力を促進する、わずかに保存された腎臓移植片を調整する簡単な方法のようです機械。 ロジスティック上の不便が生じたにもかかわらず、移植片の調達直後に機械灌流を事前に行う必要がある場合27、または静的冷蔵による臓器の輸送後の短い虚血末期灌流期間で十分であり、より簡単に実施できる場合は、依然として論争があります。臨床ルーチン。28,29CHによる移植片のexvivoコンディショニングはどちらのモダリティでも可能です。
ただし、時期尚早の最終結論に関しては注意が必要です。 孤立灌流腎（IPK）は、機能的スクリーニング研究30に役立つツールであり、IPKデータと臨床転帰の相関関係により、IPKモデルは腎機能の評価に役立つ可能性のあるツールになります17,31。ただし、モデルの機能的能力はかなり一定です。数時間に制限されており32、長期的な観察は不可能です。
HSPの最大発現はこの時間を超えても発生する可能性があるため22、温熱治療の保護効果の潜在的なさらなる増加（例えば、虚血性発作後の再生の改善に関して）は、パイロット設定では考慮されません。 さらに、他のモデルでの以前の研究から、熱ショック治療またはレンチウイルスによって誘発されるHSP 27の過剰発現が、損傷した標的臓器の炎症反応の緩和をもたらす可能性があることはよく知られています。
組織への好中球浸潤の有意な減少とともに33,34
次に、白血球浸潤は、invivoでの腎虚血および再灌流後に有害な炎症反応を引き起こす主要な急性型現象であることが知られています。
ただし、拡張in vitroモデルでは避けられない、人工チューブ表面での血球活性化の付随する悪影響を排除するために、自然血管形態を含む生理学的条件下での実際の移植および再灌流は、細胞に正確に対処するために必須であるように思われますしたがって、現在のパイロット調査では対処されなかった炎症作用。
ついに、最近の調査結果は実質的なことを示しました性差慢性腎臓病または炎症誘発性遺伝子モジュールの性関連の格差を反映している可能性のある、男性と女性の近位尿細管細胞で発現する転写物で35。熱ショック反応。 一方、男性組織のおそらく異なる行動は対処されておらず、したがってこの研究では説明できません。
結論として、これまでのデータは、短時間の温熱ex vivo灌流が、早期再灌流時に実質保護を与える孤立した腎移植片でのシャペロン誘導の簡単な方法であり、観察時間を延長したinvivo移植モデルを使用したさらなる確認を保証することを示しています。
謝辞。 著者は、BastianとReginaLüerの貴重な技術的支援に感謝します。
資金。 この作業のための資金はありませんでした。
利害の対立。 著者は、この作業に競合する利害関係はないと宣言しました。
著者の貢献。 TMとCvHが原稿を書きました。 TMとCvHが研究を設計しました。 TMとCvHが調査を実施しました。 TMとCvHがデータを分析しました。
