ブラジルの血液透析水の微生物学的品質についての考察 Ⅲ

ブラジルの透析水に関する現行法

使用される基準は、透析の評価水は、治療を受けている患者がさらされる潜在的なリスクに関する管轄当局の認識を通じて生じた（Faria、2011）。

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大学理事会 (RDC) の決議第 33/2008 号は、ブラジルの保健規制当局における血液透析用の水処理および配水システムの計画、プログラミング、精緻化、評価、および承認に関する技術規制を規定しています (Anvisa、2008)。 。

RDC 第 11/2014 号は、以下のグッド プラクティス要件を規定しています。透析サービス、教育および研究活動を行うものも含め、公的、民間、慈善活動、民間、または軍事を問わず、すべての透析サービスに適用されます。 また、微生物学的分析用のサンプルは、少なくとも月に一度、配送ループの返却ポイントおよび処理室のポイントの 1 つで収集されることも決定します。 さらに、発熱性症状、菌血症、または敗血症の疑いがある場合には必ず水の微生物学的品質を検証する必要があると判断しています。透析を受けている患者。 この RDC 番号 11/2014 は透析の水質基準を確立しており、表 1 では生物学的および微生物学的特性が強調されています (Anvisa、2014)。

表 1 - 透析水の生物学的および微生物学的品質基準

国際標準化機構 (ISO) の規格番号 13959:2014 では、次のように規定されています。血液透析水および関連療法の品質基準として、微生物数の合計が 100 CFU / mL 未満、またはその場合はそれ以下であることを地域の法律で規定しています。 また、エンドトキシンのレベルは 0.25UE / mL 未満、または現地の法律で規定されている場合は同様に微量であると規定されています (国際標準化機構、2014)。

従来の微生物学的方法と代替微生物学的方法

従属栄養細菌の列挙

これは 1610 年半ばの微生物検査の最初のマークと考えることができ、1665 年にガリレオ ガリレイとファン レーウェンフックによってそれぞれ顕微鏡が発明されました。 レーウェンフックはおそらく細菌と原生動物を観察した最初の人物ではありませんが、観察の図と説明を含む報告書を作成した最初の人物でした。 その中で、1675 年に彼は水中に存在する生物について記述しました (Dias, 2018; Pelczar, Reid, Chan, 1980)。

しかし、ドイツの科学者は、茹でたジャガイモの中でコロニーが成長することを観察しており、これは微生物の培養と培地の開発の実践を特徴づけていました。 固体培地での微生物の培養を始めたのはコッホでした。 彼は藻類から抽出され、室温で固化する物質を寒天と名付けました。 Richard Petri は、培地を置くためのガラスプレートを開発しました (Jay、2001; Pelczar、Reid、Chan、1996)。

レーウェンフック、ルイ・パスツール、ロベルト・コッホ、テオバルド・スミス、その他数人の科学者が水中の生物を発見してから 200 年後、微生物と病気を関連付けました。 Joseph Lister は 1878 年に、液体培地での段階希釈を使用して細菌の最初の純粋培養物を取得しました (Pelczar、Reid、Chan、1980)。

19 世紀末、飲料水の品質を分析するために栽培技術が採用されました。 大腸菌およびその他の大腸菌群の分析では、最確数 (MPN) による培養液が主な方法となり、総計数にはコッホ寒天培地または固体培地が使用されますが、どちらもいくつかの変更を経ています。 1950 年に、細菌の計数に膜フィルターの使用が導入されました (Pelczar、Reid、Chan、1996; Sartory、Watkins、1999)。

MNP はシンプルですが、より長い分析時間 (最大 5 日間) を必要とします。一方、膜濾過では、推定結果は 3-5 日間のインキュベーション後に得られます (Anvisa、2019)。 固体培地に関しては、選択肢の 1 つはプラーク カウンティング寒天 (PCA) で構成されます。PCA は栄養分が少なく、既に水中でストレスを受けている細菌の回収には不向きな培地です。 たとえば、より多くの細菌を回収できるが、生存可能な集団全体を回収できるわけではないため、栄養的に弱い培地も使用される場合がある(Sartory、Watkins、1999)。 Reasoner の 2A 寒天培地 (R2A) は、栄養的に弱い培地の例であり、水の微生物学的分析に最も推奨されています (USP、2017)。

現在、プレート法、膜濾過、MNP プロセスによるマルチチューブなど、多くの従来の微生物学的方法が存在します (Anvisa、2019)。 これらはシンプルで効率的で経済的ではありますが、培地の選択性が低い、生物学的反応が変動する、微生物の検出が遅くなり、患者の傷害を軽減するための予防策を決定する時間を損なうなど、いくつかの制限があります（Anvisa） 、2019）。

これらの制限を最小限に抑えるために、より高レベルの検査品質、より高い感度、より迅速な結果を提供し、早期に是正措置を講じることができる代替微生物学的方法が開発されました (Anvisa、2019)

細菌エンドトキシン

テオドール・ビルロートは、1865 年に、発熱を引き起こす物質を指すためにパイロジェンという用語を使用しました (Kikkert、Groot、Aarden、2008; Medical Staff Conference、1978)。 1892 年のリチャード・ファイファーのコレラに関する研究は、ロベルト・コッホの奨励を受けて行われ、その発見により彼をエンドトキシンの父として称賛しました (Rietschel、Cavaillon、2003)。

1942 年、生体内法による発熱物質試験がアメリカ薬局方の第 12 版に追加されました (Mc Closky et al.、1943)。 この試験が組み込まれて以来、非経口薬中の発熱物質による汚染を評価するために広く使用されてきました (Kikkert、Groot、Aarden、2008)。 しかし、この検査がブラジル薬局方に掲載されたのは 1976 年になってからです (Navega et al., 2015)。

この検査は、試験溶液の静脈内注射後のウサギの発熱反応の測定に基づいており、結果の解釈は生物学的対照の特徴付けに使用されます (Anvisa、2019)。 ただし、動物管理、生物学的多様性、倫理上の問題など、いくつかの制限があります。 これらの側面により、研究者は発熱物質の in vivo 試験の代替方法を開発するようになりました (Kikkert、Groot、Aarden、2008)。 Levin と Bang (1964) は、Kikkert、Groot、および Aarden (2008) によって引用された研究で、大腸菌エンドトキシンがカニ リムルス ポリフェムスの体液で凝固を引き起こすことを観察しました。

リムルス変形細胞溶解物（LAL）検査は、1980 年にアメリカ薬局方に追加されましたが、ブラジル薬局方に含まれたのは 1996 年になってからです（薬局方、1996 年; USP、1980 年）。 LAL 検査には 2 種類あり、1 つはゲル形成に基づく半定量的凝固検査です。 2 つ目は定量的検査である測光法で、発色に基づく発色法と濁度の発現に基づく濁度法に分けられます (Anvisa、2019)。

ただし、LAL テストには、分析手法のばらつきや、使用する機器に固有の誤差などの制限があり、分析の品質を損なうため、これらの制限を排除する代替方法が望ましい (Anvisa, 2019; Charles River, 2017) ; Lemgruber 他、2011)

代替微生物学的方法

従来の方法の限界を克服しようとする場合には、代替の微生物学的方法が望ましい。 さまざまな概要では、代替手法は定性的、定量的、または識別に分類されています (Anvisa、2019; PDA、2013; USP、2017)。

ブラジル薬局方は、生存率ベース、増殖ベース、細胞成分ベースの主な方法を強調しています (Anvisa、2019)。 代替微生物学的手法の主な種類とそれぞれの技術を表 II に示します。

表 II - 代替微生物学的手法の主な種類とそれぞれの技術

リアルタイムでの是正措置の可能性だけでなく、患者の安全性を高めるために迅速な代替方法を使用することの重要性にも関わらず、透析処理水分析の分野での適用可能性を実証する研究はほとんど行われていない（Anvisa、2019） 。 Rieplら。 (2011) は、落射蛍光顕微鏡法によって明らかになった固相サイトメトリーの適用性を評価し、従来の方法と代替方法の間に高い相関関係があることを観察しました。

透析水の微生物分析における固相サイトメトリーの応用は、信頼性が高いことに加えて、分析時間が約 3 時間であるため迅速な方法であるため、有望であり、水質だけでなく透析のモニタリングにもその使用が提案されています。流体（Canaud、2011; Riepl et al.、2011）。

サイトメトリーは、迅速な方法であることに加えて、生存可能な非培養微生物の検出も可能にします。 これらの微生物は、実験室での実験と実際の水中の微生物相との間の結果の相違の原因となっています。 活発な代謝機構を持ち、生き続けますが、分裂してコロニーを形成することはできません。 多くの細菌、特にグラム陰性菌にはこの能力があります。 マイコバクテリウム種は、潜在的な VNC として強調表示されます (Anvisa, 2019; Joux, Lebaron, 2000; Díaz et al., 2010; Sandle, 2015)。

16S rDNA PCR 分析などの細胞成分ベースの技術も、培養とは独立しているため、培養不可能な生存微生物を検出できるため、有望な技術です (Anvisa, 2019; Gomila et al., 2010; Gomila, Ramirez, Lalucat, 2007) ）。